CN115058522A - 一种鉴定含有白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种鉴定含有白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记及应用，所述分子标记为位于线粒体基因组16 131bp处的SNP位点，其存在A/G多态性，当该位置碱基为A时，则该品种不含白洛克血缘，当该位置碱基为G时，为白洛克血缘的肉鸡品种。该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。

Description

一种鉴定含有白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鉴定白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记及应用。
背景技术
中国的地方品种大多是有色羽，包括黄羽、黄麻羽、麻羽、褐羽、红羽、黑羽等羽色，我们统称为黄羽肉鸡。黄羽肉鸡是我国独具特色的本土鸡种，销售方式以活鸡为主，年出栏在45亿只左右。黄羽肉鸡根据生长速度不同，又分为快速、中速和优质型3种类型。我国家禽业“规模养殖、集中屠宰、冷链运输、冷鲜上市”的发展需求，纷纷推出屠宰加工型品种。冷鲜上市之前不同档次肉鸡可以通过羽色等外观进行区分，屠宰以后，仅靠屠体外观很难进行区分。我国黄羽肉鸡普遍生产效率很低。白洛克是快大型白羽肉鸡的母本，集产蛋多和生长速度快于一身，杂交后代生产速度会大幅度提升。目前国内培育的快速型黄羽肉鸡品种，大都用白洛克鸡为母本。因此市场上好多不良商家以次充好，杂交肉鸡当纯种地方土鸡卖，造成了市场混乱。这些现象的发生，不仅阻碍肉鸡产业结构的升级，也间接造成肉鸡行业内诚信的缺乏，使整个行业面临信任危机。因此亟需一种快速、准确而有易于操作的技术鉴别不同档次的鸡肉产品。
目前动植物品种鉴定主要有形态学鉴定和分子生物学鉴定两种手段。形态学鉴定易受环境及季节的影响，鉴定时间长，工作量大，不够准确和科学。分子鉴定技术可以克服形态学鉴定的不足，具有快速且不受环境影响的优势，被逐步用于品种鉴定中。
早期的分子标记鉴定方法如：随机扩增的多态性(Randomly AmplifiledPolymorphic, RAPD)、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism,RFLP)等标记，由于存在分型不稳定、基因型过多无法分辨、非共显性等缺陷，都只是作为研究，基本上都没有被纳入品种鉴定标准。经过数十年的品种鉴定的发展与实践，只有微卫星(Simple Sequence Repeat，SSR)标记法和单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphism,SNP)标记法被保留了下来。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。由于SNP具有高密度性、兼容性好、通量高、速度快、成本低与表型性状关联度高等优点，因此作为一类农作物和家养动物的分子标记，SNP在品种DNA身份鉴定中得到了广泛的应用。但是迄今为止，未见利用SNP分子标记方法对白洛克血缘的肉鸡品种进行鉴定的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术不足，提供一种鉴定白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记。
本发明的目的之二在于提供用于检测上述分子标记的引物。
本发明的目的之三在于提供上述分子标记的用途。
本发明的目的之四在于提供利用上述分子标记的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种分子标记，所述分子标记为位于线粒体基因组16131bp 处的SNP位点，其存在A/G多态性，当该位置碱基为A时，则该品种不含白洛克血缘，当该位置碱基为G时，为白洛克血缘的肉鸡品种。
一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的方法，为提取鸡基因组DNA，检测线粒体基因组16 131bp处的碱基序列，当该位置碱基为A时，为不含白洛克血缘的肉鸡品种，当该位置碱基为G为白洛克血缘的肉鸡品种。
本发明鸡基因组DNA的提取可以采用常用方式进行提取待鉴定鸡的基因组DNA，例如提取鸡的血液、鸡肉、羽毛、组织或鸡蛋的基因组DNA。
一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的方法，线粒体基因组16 131bp处的碱基为G时，可以形成GGGCT/C的BanII内切酶的酶切位点，碱基为A时GGACTC无法被BanII内切酶酶切。
本发明还提供一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记的引物对，其中：
正向引物：5'-GCAGCCTCAGTCCTCATCC-3'
反向引物：5'-ACTAGAGCTTGTGCGTGGG-3'。
本发明还提供一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记，通过本发明所述的引物对扩增待鉴定鸡品种基因组DNA，然后用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，获得一条455bp扩增片段的为不含白洛克血缘的肉鸡品种，获得346bp和109bp两条扩增片段的为白洛克血缘的肉鸡品种。
本发明还提供含有上述引物对的用于鉴别白洛克血缘的肉鸡品种基因型的试剂盒。
本发明还提供上述分子标记或引物对或试剂盒在鉴别白洛克血缘的肉鸡品种中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物对或试剂盒在筛选白洛克血缘的肉鸡品种中的应用。
本发明还提供上述分子标记或引物对或试剂盒在筛选不含白洛克血缘的肉鸡品种中的应用。
本发明还提供一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的方法，通过本发明所述的引物对扩增待鉴定鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，获得一条455bp扩增片段的为不含白洛克血缘的肉鸡品种，获得346bp和109bp两条扩增片段的为白洛克血缘的肉鸡品种。
在一种具体的实施方式中，本发明还提供白洛克血缘的肉鸡品种的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)提取待测鸡肉中的基因组DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用本发明所述引物对，进行PCR扩增反应；
3)步骤2)中PCR反应体系为：2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L 正方向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA2μL，超纯水21μL；
4)步骤2)中PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃60s)35循环， 72℃ 10min；
5)用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果呈现2条带的为白洛克血缘的肉鸡品种，仅为1条带的为不含白洛克血缘的肉鸡品种。
6)步骤5)中酶切反应体系为：反应体系为PCR产物43μL，10×缓冲液5μL，BanII酶(5U)2μL，将样品混合均匀后离心，置于PCR仪37℃孵育1h。
有益效果：
本发明利用线粒体序列的差异鉴别白洛克血缘的肉鸡品种，优点在于能够快速、准确鉴别白洛克血缘的肉鸡品种。并且该法操作简单、易于实验室操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
图1：白洛克血缘的肉鸡品种分子鉴定PCR扩增片段电泳结果。
图2： 碱基突变位置处测序峰图。
图3： BanII酶切后琼脂糖电泳结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1白洛克血缘的肉鸡品种分子检测方法的建立
1.1引物设计
申请人对白洛克血缘的肉鸡品种群体和不含白洛克血缘的肉鸡品种群体线粒体基因组进行全长测序，发现两个群体在16131bp处存在变异，设计引物扩增该候选位点。
正向引物：5'-GCAGCCTCAGTCCTCATCC-3'
反向引物：5'-ACTAGAGCTTGTGCGTGGG-3'
1.2PCR扩增
PCR反应体系为：
2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正方向引物各1μL，50-100μg/ml 模板DNA2μL，超纯水21μL。
PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，60℃30s，72℃60s)35循环，72℃10min。
1.3电泳检测
PCR产物经1.3％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。检测结果显示PCR产物均为特异的一条455bp的片段，将PCR产物送上海生工生物有限公司测序，对测序序列进行比对筛选变异位点，在148bp处发现(A-G)变异位点，测序峰图见图2，其中上述扩增片段148bp处变异位点在鸡线粒体基因组上的位置是16131bp(参考序列为NC_007235)，并且仅当该位点碱基是G时，可以形成GGGCT/C的BanII内切酶的酶切位点，为白洛克血缘的肉鸡品种；碱基为A时GGACTCC无法被BanII内切酶酶切，为不含白洛克血缘的肉鸡品种。即白洛克血缘的肉鸡品种为单基因位点控制，可利用此处变异位点可以区分白洛克血缘的肉鸡品种。
由于线粒体基因组序列不发生同源重组，因此无杂合子基因型，该位点碱基是A时是无酶切位点的AA纯合型，该位点碱基是G时为有酶切位点的GG纯合型。用BanII酶切上述PCR产物，反应体系为PCR产物43μL，10×缓冲液5μL，BanII酶(5U)2μL将样品混合均匀后离心，置于PCR仪37℃孵育1h。反应结束后，用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。AA型电泳检测只有一条455bp的条带，GG型为有酶切位点的纯合型，电泳检测时有346bp和109 bp的两条带，见结果如图3(其中1～8为不含白洛克血缘的肉鸡品种，9～16为含白洛克血缘的肉鸡品种)。
实施例2
本实施例利用实施例1所述的方法和引物对对白洛克血缘的肉鸡品种进行扩大群体验证。不含白洛克血缘的肉鸡品种(白耳黄鸡、茶花鸡、河南斗鸡、固始鸡、狼山鸡、仙居鸡、北京油鸡)来自国家级地方鸡种基因库(江苏)，每个品种30只；3个白洛克血缘的肉鸡品种来自3个大型养殖企业。每个品种30只。所述分子标记在白洛克血缘的肉鸡品种中GG型比例占80％，在不含白洛克血缘的肉鸡品种中全部为AA型。进一步验证了该处SNP位点能有效、可靠地鉴别白洛克血缘的肉鸡品种(如表1所示)。
表1是利用本发明的分子标记检测的白洛克血缘的肉鸡品种基因型分布情况。
Figure BDA0003757360890000051

Claims (10)

1.一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种分子标记，其特征在于，所述分子标记为位于线粒体基因组16 131bp处的SNP位点，其存在A/G多态性，当该位置碱基为A时，则该品种不含白洛克血缘，当该位置碱基为G时，为白洛克血缘的肉鸡品种。
2.一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的方法，其特征在于，为提取鸡基因组DNA，检测线粒体基因组16 131bp处的碱基序列，当该位置碱基为A时，为不含白洛克血缘的肉鸡品种，当该位置碱基为G为白洛克血缘的肉鸡品种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，提取鸡基因组DNA为提取鸡的血液、鸡肉、羽毛、组织或鸡蛋中的基因组DNA。
4.一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记的引物对，其中：
正向引物：5'-GCAGCCTCAGTCCTCATCC-3'
反向引物：5'-ACTAGAGCTTGTGCGTGGG-3'。
5.一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的分子标记，通过权利要求4所示引物对扩增待测鸡的基因组DNA，然后用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，获得一条455bp扩增片段的为不含白洛克血缘的肉鸡品种，获得346bp和109bp两条扩增片段的为白洛克血缘的肉鸡品种。
6.含有权利要求4所述的引物对的试剂盒。
7.权利要求1所述的分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在鉴别白洛克血缘的肉鸡品种中的应用。
8.权利要求1所述的分子标记、权利要求4所述的引物对或权利要求6所述的试剂盒在筛选白洛克血缘的肉鸡品种或者筛选不含白洛克血缘的肉鸡品种中的应用。
9.一种鉴别白洛克血缘的肉鸡品种的方法，其特征在于，通过权利要求4所示引物对扩增待鉴定鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，获得一条455bp扩增片段的为不含白洛克血缘的肉鸡品种，获得346bp和109bp两条扩增片段的为白洛克血缘的肉鸡品种。
10.一种筛选含有或者不含白洛克血缘的肉鸡品种的方法，其特征在于，通过权利要求4所示引物对扩增待筛选鸡基因组DNA，然后用限制性内切酶BanII酶切扩增产物，获得一条455bp扩增片段的为不含白洛克血缘的肉鸡品种，获得346bp和109bp两条扩增片段的为白洛克血缘的肉鸡品种。
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