CN115896298A - 翘嘴鳜x染色体分子标记引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种翘嘴鳜X染色体分子标记引物，其特征是：所述引物为引物对1或引物对2，所述引物对1包括Contig‑1上游引物和Contig‑1下游引物，所述引物对2包括Contig‑2上游引物和Contig‑2下游引物，其中Contig‑1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig‑1下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：2所示，Contig‑2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Contig‑2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。还公开了一种翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法以及上述引物或方法在翘嘴鳜鱼全雄性育种中的应用。

Description

翘嘴鳜X染色体分子标记引物及其应用

技术领域

本发明属于鱼类性染色体组成鉴定技术领域，具体涉及翘嘴鳜X染色体分子标记引物及其应用。

背景技术

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，已有多种鱼类的性染色体特异标记被开发出来，如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)以及红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等，但是这些标记主要是通过微卫星(microsatellite，SSR)、限制位点相关DNA(restriction site associated DNA，RAD)和扩增片段长度多态性(amplifiedfragment length polymorphism，AFLP)等分子标记开发技术获得，这些分子标记开发方法耗时长，工作量大，成功率低。而高通量测序技术的出现为分子标记开发提供了一种新的高效手段，目前通过高通量测序的方法已成功开发出乌鳢(Channa argus)及大黄鱼(Larimichthyscrocea)性染色体特异分子标记。

翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)，鳜科(Sinipercidae)，鳜属(Siniperca)，俗称鳜鱼、桂花鱼，其英文名意为中国鲈(Chinese perch)、满洲鱼(Mandarin Fish)。翘嘴鳜为我国特有淡水名贵鱼类，其肉质鲜美，营养丰富，无肌间刺，深受国内外消费者喜爱。在每年的2-5月，国内鳜鱼需求量很大，销售价格高，但是塘内鳜鱼储量少。近年来养殖户为获得更高的利润，选择在越冬期后出售鳜鱼。翘嘴鳜的生长具有性别二态性，在越冬期前的2-9个生长月期间，雌鱼的生长速度快于雄鱼，而在越冬期后的9-14个生长月内，雌鱼达到性成熟并减慢生长速度，此时雄鱼的生长速度快于雌鱼。所以，养殖全雄翘嘴鳜具有极高的经济价值。

在翘嘴鳜以往的核型分析中，并没有发现明显的性染色体，但通过雌雄基因组的测序和翘嘴鳜雄性特异性分子标记的开发，我们证实在雄鱼基因组中存在Y染色体特异性DNA片段，因此判断鳜鱼性别决定为XX/XY型，即雄性异配。全雄鳜鱼单性育种首先需要获得YY超雄鱼，获得超雄鱼的主要途径是将***诱导得到的伪雌鱼与正常雄鱼交配，从而得到YY超雄鱼后代，理论上超雄鱼在后代中占比25％。其次，将获得的超雄鱼与正常雌鱼交配，从而获得基因型全部为XY的雄鱼子代。传统筛选XY雄鱼与YY超雄鱼的方法是通过测交实验来判断父本的性染色体组成。通过鳜鱼雄性特异性标记验证测交子代的性别需要耗费大量实验成本，且测交亲本单独养殖需要占用较多养殖资源，所以用测交的方法耗时，费力又费资源。迄今为止，国内外尚无能够成功鉴定翘嘴鳜X染色体特异性标记的报道，因此，开发翘嘴鳜X染色体分子标记快速筛选YY超雄鱼对翘嘴鳜全雄育种具有极大的生产应用价值。

发明内容

本发明第一个目的在于提供一种翘嘴鳜X染色体分子标记引物，该引物能在分子水平上鉴别YY超雄性翘嘴鳜鱼以及XY雄性翘嘴鳜鱼。

本发明第二目的还在于提供一种翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，该方法耗时短，检测结果准确。

本发明第三目的在于提供上述引物或方法在翘嘴鳜鱼全雄育种中的应用。

为实现上述第一目的，本发明采用以下技术方案：

一种翘嘴鳜X染色体分子标记引物，所述引物为引物对1或引物对2，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Contig-2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：

Contig-1上游引物：5’-ATTCCCATCAACCTGT-3’；

Contig-1下游引物：5’-CACAATCTGTGCCTAC-3’；

Contig-2上游引物：5’-TTGCGTTTAGTGTTGATTGT-3’；

Contig-2下游引物：5’-AGACCTGCACGTCCTAA-3’。

为实现上述第二目的，本发明采用以下技术方案：

一种翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)制备翘嘴鳜鱼DNA样品；

(2)以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用权利要求1中的引物对1或引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

在上述翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法中：

优选的，步骤(2)中以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有约935bp的X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有约935bp的X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

优选的，步骤(2)中以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有约850bp的X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有约850bp的X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

优选的，步骤(1)中DNA样品制备采用柱式离心法提取翘嘴鳜鱼DNA。

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，采用20μL PCR反应体系，所述20μL PCR反应体系包含DNA50 ng，引物对1的Contig-1上游引物和Contig-1下游引物各0.8μL或引物对2的Contig-2上游引物和Contig-2下游引物各0.8μL，2×Taq MasterMix 10μL，其余用ddH₂O补齐。

优选的，步骤(2)中PCR扩增时，采用的PCR反应程序为：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。

优选的，步骤(2)电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。

为实现上述第三目的，本发明采用以下技术方案：

上述引物或方法在翘嘴鳜鱼全雄性育种中的应用。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明基于YY超雄性和XX雌性翘嘴鳜的基因组高通量测序数据，利用基因组比对和组装等分析方法，快速、准确的筛选出翘嘴鳜X染色体分子标记，首次设计了鉴别翘嘴鳜X染色体分子标记引物，该引物可对翘嘴鳜的YY超雄鱼进行快速准确的鉴定；

(2)本发明方法建立了一种利用翘嘴鳜X染色体分子标记引物进行翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，利用两对特异性引物对，完成一个PCR反应就可以鉴别翘嘴鳜鱼YY超雄鱼，相较于传统通过测交实验来判别父本的性染色体组成，耗时短，效率高，节约资源。

附图说明

图1为实施例1中YY超雄鱼选育流程图；

图2为实施例1中测交筛选用于测序的YY鱼子代电泳图，其中a-f为YY测交后代，g为XY测交后代；

图3为实施例1中X染色体特异性候选片段获取示意图；

图4为实施例1中引物Contig-1和Contig-2在XX雌性和XY雄性样本中分别检测到扩增大小为935bp和850bp片段，在YY超雄鱼中无相应扩增的PCR产物电泳图；

图5为实施例1中其余四对引物在XX雌性、XY雄性和YY超雄性中的非X染色体特异性片段的扩增的PCR产物电泳图；

图6为实施例2中引物Contig-1在8个XX雌性、8个XY雄性和6个YY超雄性样本中的PCR产物电泳图；

图7为实施例2中引物Contig-2在8个XX雌性、8个XY雄性和6个YY超雄性样本中的PCR产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1

本实施例提供翘嘴鳜鱼X染色体分子标记引物，引物包括引物对1或引物对2，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，Contig-2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：

Contig-1上游引物：5’-ATTCCCATCAACCTGT-3’；

Contig-1下游引物：5’-CACAATCTGTGCCTAC-3’；

Contig-2上游引物：5’-TTGCGTTTAGTGTTGATTGT-3’；

Contig-2下游引物：5’-AGACCTGCACGTCCTAA-3’。

本发明中上述翘嘴鳜鱼X染色体分子标记引物通过以下方式获得，其步骤包括：

(一)测序文库构建及重测序

1、鳜鱼DNA样品制备：

繁殖期间剪取鳜鱼3尾超雄鱼尾鳍，超雄鱼通过测交方法筛选获得(图1和图2)。依次按超雄鱼SM1-SM3编号，采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测，达到高通量测序的要求。

2、测序文库构建和高通量测序：

取超雄鱼SM1-SM3 DNA样品，分别构建350-500bp片段测序文库，利用IlluminaHiseq X Ten平台进行双末端(Pair-End)PE150测序，获得超雄鱼基因组测序clean data:33,810,178,500bp。

文库构建步骤具体参考Novogene NGS DNA Library Prep Kit说明书，测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

(二)X染色体特异DNA片段的富集

1、X染色体特异性候选DNA片段获得：

将实验室之前获得的雌鱼参考基因组(PRJNA612372，Females:SRR11300855,SRR11300854,SRR11300853)和超雄鱼SM1-SM3测序reads采用bwa v0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件进行比对，采用双末端比对策略，碱基错误率设为0.04，其余采用默认参数。过滤掉雌鱼参考基因组中可以使超雄鱼测序reads双端比对上的contigs，挑选出雄鱼参考基因组中无法使超雄鱼测序reads双端比对上的contigs,这些区域就是可能的X染色体特异的DNA片段(图3)。

2、X染色体特异性片段的测序深度分析：

使用Samtools(1.9版本)将上一步获得的候选X特异性片段进行测序深度分析和筛选。选择实验室先前获得的所用的鳜鱼雄性(XY)和雌性(XX)的参考基因组(PRJNA612372,Males:SRR11300858,SRR11300857,SRR11300856；Females:SRR11300855,SRR11300854,SRR11300853)进行参考分析，在X染色体和Y染色体测序深度比较分析中，为避免序列比对的错误导致深度的计算异常，深度计算选择XY染色体同源且相似性低于95％的序列进行统计。筛选原则是该片段的测序深度是雄性基因组总深度0.3-0.7倍，并且是雌性基因组总深度0.8-1.2倍，符合该测序原则的序列为候选X染色体特异性序列。共获得49条符合上述筛选条件的X染色体特异性Contig序列。

(三)X染色体分子标记的筛选

1、引物设计与合成：

基于上述49条X染色体特异性Contig序列，随机选取其中6条Contig序列，采用Primer5软件(软件使用参照Primer PREMIER Version5.0 for Windows and PowerMacintosh)设计PCR引物，引物按Contig-xxF/R编号(xx代表Contig号码)，如Contig-1的引物编号为Contig-1F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

2、鳜鱼DNA样品制备：

繁殖期间剪取鳜鱼雌性4尾、雄性4尾和超雄4尾个体尾鳍，依次按雌鱼F1-F4、雄鱼M1-M4、超雄鱼SM1-SM4编号，采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测。

3、X染色体分子标记的筛选及确认：

选择上述6对引物对4尾雌鱼、4尾雄鱼和4尾超雄鱼个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系20μL，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng，其余采用ddH₂O补齐。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳结果显示，有2对引物仅在雌雄性(XX、XY)个体中获得X染色体特异性扩增条带，在超雄性(YY)个体中均未检测到X染色体特异性扩增片段(图4)，两对引物分别是Contig-1F/R和Contig-2F/R，代表它们对应的Contig是Contig-1和Contig-2；其余4对引物，则在雌性、雄性和超雄性个体中存在相同的扩增产物(图5)，证明这些片段不是X染色体特异性片段。

通过6对引物在雌、雄和超雄各4个个体中的PCR扩增，确认了其中2条Contig：Contig-1和Contig-2是X染色体特异片段，是鳜鱼的X染色体分子标记。

实施例2

本实施例提供利用鳜鱼X染色体分子标记引物进行翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，包括下述步骤：

(1)翘嘴鳜鱼DNA样品制备：

从广东省佛山市三水白金水产种苗有限公司获得目测已性成熟的鳜鱼，经解剖得到雌、雄性别鳜鱼各8尾，经测交验证获得超雄鱼6尾。分别剪取尾鳍，同样采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。

(2)PCR扩增验证：

采用引物Contig-1F/R和Contig-2F/R(实施例1中获得)对上述提取的鳜鱼DNA样品进行PCR验证。

PCR扩增反应总体系20μL，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μL，模板DNA 50ng，其余用ddH₂O补充。

PCR反应程序为：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。

PCR反应结束后，产物经质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳，结果：引物Contig-1F/R和Contig-2F/R在16尾正常雌雄鱼DNA样品中均能扩增出条带，此时，采用引物Contig-1F/R扩增出X染色体特异性条带的分子大小是约935bp；采用Contig-2F/R扩增出X染色体特异性条带的分子大小是约850bp。在6尾超雄鱼DNA样品中均不能扩增出X染色体特异性条带(图6：Contig-1F/R扩增结果图和图7：Contig-2F/R扩增结果图)。表明分子标记Contig-1F/R和Contig-2F/R可用于鉴定雄性鳜鱼的性染色体组成。

实施例3

本实施例提供利用上述翘嘴鳜X染色体分子标记引物进行翘嘴鳜鱼全雄性育种的应用，包括以下步骤：

(1)待翘嘴鳜鱼苗养殖至10日龄，用包含500mg/kg的二羟雌酮(E₂)的鳗鱼料投喂饵料鱼，再将摄食激素料的饵料鱼投喂鳜鱼。持续投喂两个月，养殖期间采用自然光照，培育水温为26-28℃，饱食投喂。

(2)使用本实验室先前获得的Y染色体分子标记引物筛选出XY伪雌鱼(参阅申请号201911100842.3)，随后将其与XY正常雄鱼交配，将子代鱼苗养殖至30日龄，采用实施例2中的方法对子代进行筛选，得到基因型为YY的超雄鱼，具体过程参照实施例2。

(3)将标记鉴定出的YY超雄鱼继续养到性成熟，在繁殖季节与正常XX雌鱼进行交配，获得的后代即为全雄鱼。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为。

Claims (6)

1.一种翘嘴鳜X染色体分子标记引物，其特征是：所述引物为引物对1或引物对2，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，Contig-2下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备翘嘴鳜鱼DNA样品；

(2)以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用权利要求1中的引物对1或引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

3.根据权利要求2所述的翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，其特征是：步骤(2)中以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用引物对1进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有约935bp的X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有约935bp的X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

4.根据权利要求2所述的翘嘴鳜鱼YY超雄鱼鉴定的方法，其特征是：步骤(2)中以步骤(1)中的DNA样品为模板，采用引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后进行电泳检测，若电泳结果显示扩增产物具有约850bp的X染色体特异性条带，此时检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为XX雌翘嘴鳜鱼或XY雄翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示扩增产物不具有约850bp的X染色体特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为YY超雄翘嘴鳜鱼。

5.权利要求1所述引物在翘嘴鳜鱼全雄性育种中的应用。

6.权利要求2所述方法在翘嘴鳜鱼全雄性育种中的应用。

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