CN107619857B - 一种检测肉牛klf8基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法及其应用：以肉牛品种郏县牛的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增其KLF8基因CNV区域和内参基因BTF3，根据2*log₂ 2^‑ΔΔCt将结果分为***型、缺失型和正常型，鉴定其KLF8基因的拷贝数变异。与郏县牛生产数据的关联分析显示，KLF8不同拷贝数对郏县牛的生长发育有显著影响，其中缺失型个体的胸宽显著高于***型和正常型个体。本发明在DNA水平上检测与肉牛生产性状密切相关的CNV，可作为肉牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，快速建立遗传资源优良的肉牛种群。

Description

一种检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于QPCR技术检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法。

背景技术

随着基因组学和生物信息学等学科的迅猛发展，动物育种理论和技术正在发生重大变化，肉牛育种的方向由常规的表型选育向分子育种发展。目前，牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种，即分子标记辅助选择(molecularmark-assist selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。

全基因组范围内寻找CNV的方法主要有比较基因组杂交(CGH)、SNP芯片和重测序，其中前两种主要基于芯片技术。(1)CGH技术是基于微阵列技术的比较基因组杂交，通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交可检测试验样本基因组和对照基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针覆盖整个基因组，所以这种分析方法是高通量分析法，且具有敏感度、准确度、分辨率高的特点，分析所得的试验数据有较高的可信度。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。(2)SNP芯片不需要同时使用两个样本的DNA和探针进行双杂交，仅使用单杂交就可以完成。它可以通过比较测试样本的信号强度与其他个体的强度，而确定每个位点的相对基因组拷贝数。(3)重测序利用新一代直接测序技术克服了杂交固有的一些缺点，不需要知道更多的背景知识和设计工作，应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中，实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。根据QPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2^-ΔΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。

KLF8(Krüppel-like factor 8)基因是属于KLFs(Krüppel-like factors)家族中的一种转录因子。KLF8基因广泛表达于机体的各组织器官中，其在细胞周期的调控、EMT的激活、表达的作用都与癌症的发生发展有着密不可分的联系，而在脂肪细胞分化中的作用为调控生长发育提供基础。

目前，尚未见有关KLF8基因CNV对郏县红牛等肉牛品种生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法，包括以下步骤：

以肉牛(郏县牛)血液全基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过实时荧光定量PCR(QPCR)扩增KLF8基因的CNV区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定肉牛KLF8基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’-TCTTTGTGTGAATGCTGCC-3’

下游引物R1：5’-CCATAACTCTGCTGCTCAC-3’；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

所述的KLF8基因的CNV区域位于牛KLF8基因参考基因组序列NC_007331的134933bp-136632bp。

所述的拷贝数变异类型是根据2*log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：***型，拷贝数(即2*log₂ 2^-ΔΔCt)大于2；缺失型，拷贝数(即2*log₂ 2^-ΔΔCt)小于2；正常型，拷贝数(即2*log₂ 2^-ΔΔCt)等于2。

所述的QPCR所用的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1μL、10pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×SYBR Green QPCR Mix 6.25μL。

所述的QPCR所用的反应程序包括以下步骤：(1)预变性：95℃，10min；；(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环。

基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为153bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法在肉牛(郏县牛)分子标记辅助选择育种中的应用。具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。所述生长性状为胸宽。

本发明中，以牛KLF8基因候选区域Chr X:99748601-99750300为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在郏县牛群体中的拷贝数变异情况，并与重要经济性状进行关联分析；如果检测KLF8基因候选位点的拷贝数变异类型为缺失型，则待测郏县牛的胸宽更优异。KLF8基因CNV与郏县牛重要生长性状关联，可以为中国郏县牛分子育种提供理论依据，便于郏县牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的郏县牛种群。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的郏县牛KLF8基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育，甚至在刚出生时就可进行选择。

(2)检测KLF8基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便。

(3)KLF8基因拷贝数变异位点的检出，为郏县牛的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

图1为KLF8基因CNV检测引物PCR扩增产物电泳图；图1中：左侧两泳道为KLF8基因特异性引物(引物对P1)PCR产物，片段大小为153bp，最右侧泳道为DNA marker I。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

对郏县牛全基因组重测序，发现KLF8基因存在1700bp的拷贝数变异(CNV)，本发明利用QPCR对郏县牛KLF8基因的拷贝数变异进行检测。

本发明所涉及的一种基于QPCR技术检测的CNV标记，就是指牛KLF8基因候选区域(Chr X:99748601-99750300)的拷贝数变异。具体地，所述的CNV标记位于牛KLF8基因(GenBank Accession No.NC_007331)所示序列的134933bp-136632bp区域内。

1、郏县牛样本采集

本发明以中国地方肉牛品种郏县红牛作为检测对象，从河南省平顶山市郏县红牛良种繁育中心采集了137头生长数据资料完善的郏县红牛的血液样本(采集时间：2012年8月)。

2、基因组DNA的分离、提取、纯化

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、目的基因及参考基因扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛KLF8基因(目的基因)序列(GenBank Accession No.NC_007331)为参考序列，利用Primer 5.0设计QPCR引物(引物对P1)检测KLF8基因拷贝数变异，同时，以NCBI所公布的牛BTF3基因序列(AC_000177.1)为参考序列，采用相同的方法设计扩增参考基因(BTF3基因)中一段166bp的序列的QPCR引物(引物对P2)。引物序列信息如表1所示，PCR扩增验证结果如图1所示。

表1.实时荧光定量PCR的引物信息

进行QPCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA 1μL，10pM的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green QPCR Mix(TAKAR,Japan)6.25μL，及去离子水4.25μL。

QPCR扩增的反应程序为：

(1)预变性：95℃10min；

(2)扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，39个循环；

(3)绘制溶解曲线：95℃10s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对P1和P2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2^-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_实验组-(C_{T目的基因}-C_{T参考基因})_对照组。C_T即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。实验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2^-ΔΔCt表示的是实验组目标序列的拷贝数相对与对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2^-ΔΔCt的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。

根据2*log₂ 2^-ΔΔCt将定量结果分为三类：***型，拷贝数大于2；缺失型，拷贝数小于2；正常型，拷贝数等于2。

5.郏县牛KLF8基因CNV位点与生长性状的关联分析

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 19软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk，

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。

表2.KLF8基因CNV与郏县牛生长性状的关联分析

注：平均值肩上不同字母，表示差异显著。

关联分析结果表明(见表2)，郏县牛KLF8基因CNV位点可显著影响胸宽(P值<0.05)。并且，优势拷贝数变异类型为缺失型，说明KLF8基因该CNV位点可以作为一个提高郏县牛生长性状的候选分子遗传标记。

6.上述CNV标记在郏县牛选育中的应用

获得的CNV可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牛生长性状的数量性状基因座，以及对郏县牛进行分子标记辅助选择，从而加快郏县牛品种改良的选育进程。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种检测肉牛KLF8基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

tctttgtgtg aatgctgcc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ccataactct gctgctcac 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (5)

1.一种检测郏县牛KLF8基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以郏县牛基因组DNA为模板，以引物对P1以及引物对P2为引物，分别通过QPCR扩增KLF8基因的CNV区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定郏县牛KLF8基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对P1为：

上游引物F1：5’- TCTTTGTGTGAATGCTGCC -3’

下游引物R1：5’- CCATAACTCTGCTGCTCAC -3’ ；

所述的引物对P2为：

上游引物F2：5’- AACCAGGAGAAACTCGCCAA -3’

下游引物R2：5’- TTCGGTGAAATGCCCTCTCG -3’ ；

所述的拷贝数变异类型是根据2*log₂ 2^−ΔΔCt将定量结果分为的三类：***型，2*log₂ 2^−ΔΔCt大于2；缺失型，2*log₂ 2^−ΔΔCt小于2；正常型，2*log₂ 2^−ΔΔCt等于2；

郏县牛KLF8基因CNV标记显著影响胸宽，作为一个提高郏县牛生长性状的候选分子遗传标记，并且，优势拷贝数变异类型为缺失型；

所述的KLF8基因的CNV区域位于牛KLF8基因参考基因组序列NC_007331的134933bp-136632bp。

2.如权利要求1所述一种检测郏县牛KLF8基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的QPCR采用的扩增体系包括10 ng/μL模板DNA 1 μL以及10 pM的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5 μL。

3.如权利要求1所述一种检测郏县牛KLF8基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的QPCR采用的反应程序包括以下步骤：1）预变性：95℃，10 min；2）扩增反应：95℃变性10 s，60℃退火30 s，39个循环。

4.如权利要求1所述一种检测郏县牛KLF8基因CNV标记的方法，其特征在于：基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为153 bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为166 bp。

5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在郏县牛分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：具有缺失型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优，所述生长性状为胸宽。

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