CN115044528B - 一种诱导卵菌属隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于诱导隐袭腐霉菌产孢技术领域，公开了一种诱导卵菌属隐袭腐霉菌产生游动孢子方法。本研究基于诱导液和草本植物榨取汁，将其对隐袭腐霉菌进行共同作用后具有明显诱导产生游动孢子的效果。由于卵菌属隐袭腐霉菌难以产生游动孢子，本发明发明了一种相较于已有的诱导产孢技术可以提高产孢量的方法，能够更高效诱导游动孢子的产生以及简化游动孢子的收集。

Description

一种诱导卵菌属隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法
技术领域
本发明涉及卵菌诱导产生游动孢子的技术领域，更具体地，涉及一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法。
背景技术
隐袭腐霉菌Pythium insidiosum是一种类似真菌的水生卵菌，是哺乳动物中唯一能引起隐袭腐霉病的病原体。在沼泽地区具有生态优势，常见于热带、亚热带和温带地区。隐袭腐霉菌属于管毛生物界(Straminipila)(藻物界为其同物异名)，卵菌门Oomycota，卵菌纲Oomycetes，霜霉目Peronosporales，腐霉科Pythiaceae，腐霉属Pythium。腐霉属是一种生态上通用的微生物，在几乎所有的土壤和潮湿环境中都能找到。它们是最具破坏性的植物病原体之一，给多种作物造成经济损失。腐霉属的成员在生态学和生理学上都是独一无二的。它们经常栖息在世界各地的土壤和水域。然而，在该属中所描述的所有微生物中，只有一种，隐袭腐霉菌被认为是哺乳动物中引起疾病的唯一病原体。
该生物通常以两种形式出现:一种是具有直角分枝或宽丝的菌丝，另一种是带有双鞭毛的水生游动孢子，是仅存在于水生环境中的感染性繁殖体。由病原性卵菌产生的有性生殖形式是一种球形、厚壁结构，可以承受不利的外部条件。卵孢子可以在土壤中存活很长一段时间(几个月到几年)，这使病原体在环境中的存在永久化，增加了感染宿主的机会。游动孢子是P.insidiosum的感染单位，能游动以发芽菌丝形式侵入宿主组织。菌丝在实验室培养中很常见，而游动孢子由于其产生条件苛刻因此在实验室培养中很少见。
为了更好鉴别菌株以及研究隐袭腐霉菌的生物学特性，诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子是研究中必不可少的一步。但是目前报道的诱导隐袭腐霉菌产孢的方法仍然较少，不仅产孢量较少且分离困难，亟需一种新的诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法，该方法具有能够提供简化产孢步骤和明显提高产孢量的优势。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种复合诱导液，由隐袭腐霉菌孢子诱导液和草本植物汁液组成；
所述隐袭腐霉菌孢子诱导液包括如下组分：
A液：K2HPO4·3H2O 11.4g；KH2PO4 6.8g,(NH4)2HPO4 6.6g；超纯水50ml；
B液：MgCI2·6H2O 2.54g,CaCl2·2H20 1.84g；超纯水25ml；
A液和B液的混合体积比为5:1-1:1。草本植物汁液中草本植物为番荔枝叶。
作为一种优选的技术方案，所述番荔枝叶与水的混合体积比为1:1-1:5。
作为一种优选的技术方案，将A液和B液混合，再加入1L水中，得到隐袭腐霉菌孢子诱导液。
作为一种优选的技术方案，隐袭腐霉菌孢子诱导液和草本植物汁液的混合体积比为7～1：1。
本申请同时保护所述复合诱导液在诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子中的应用。
与现有产孢技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法，本发明相较于已有的诱导产孢技术能够显著增加隐袭腐霉菌游动孢子的产量，能够更高效诱导游动孢子的产生以及简化产孢步骤和游动孢子的收集。
附图说明
图1为显微镜拍摄红细胞计数板计数游动孢子图片。
图2为显微镜拍摄产生游动孢子的图片。
图3是对比例1条件下显微镜下观察叶子边缘诱导的游动孢子图，图3a和图3b分别代表不同视角下的观察图。
图4为植物叶子汁液与诱导液比例对产生游动孢子的数量的对比图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
所用的诱导液和草本植物榨取汁为自己配制无商品化购买途径。
实施例1诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法
1、实验材料：
(1)诱导液、草本植物叶片(番荔枝叶子)，光学显微镜等。
(2)试验用培养基：2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)(广东星朗生物科技有限公司)、脑心浸出液琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、无菌脱纤维绵羊血(购买自广东星朗生物科技有限公司)。
(3)菌株：隐袭腐霉菌分离株(实验室保藏，市售也可)。
2、试验前的准备工作：
(1)配制孢子诱导液
配制孢子诱导液；
A液：K2HPO4·3H2O 11.4g；KH2PO4 6.8g,(NH4)2HPO4 6.6g；超纯水50ml；
B液：MgCI2·6H2O 2.54g,CaCl2·2H20 1.84g；超纯水25ml；
将0.5ml A液和0.1ml B液,加入1L dd水，pH为7.0-7.1储存4℃保存待使用。
(2)草本植物(番荔枝叶子)用无菌水洗净，再用70％的酒精浸泡几分钟消毒，草本植物汁液的获得：称重100g，加入无菌水500ml，榨取成汁。植物汁液于121℃灭菌储存备用。
(3)隐袭腐霉菌在90mm平皿培养至菌丝生长直径约40-60mm大小。
3、一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法：
(1)从新鲜脑心浸出液绵羊血板边缘上挑取带菌丝的琼脂塞，转移到2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板上，37℃培养箱培养；
(2)取2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板带菌丝的琼脂塞，置于2％沙氏葡萄糖肉汤(SDB)的离心管中，放入37℃摇床中180rpm培养4h；
(3)将(2)步骤培养好的离心管取出，去除离心管中肉汤加入等量超纯水，之后37℃，180rpm培养1h；
(4)将(3)步骤培养好的离心管取出，去除离心管中超纯水加入诱导液与叶汁体积比例为(1：1)，之后37℃，180rpm培养10-24h；
(5)取(4)步骤培养好的菌液，滴在细胞计数板上，在光学显微镜下计数诱导产生的孢子数量，实验结果均经过三个生物学重复后进行统计分析。
如图1所示，在光学显微镜下(10×)，可以用红细胞计数板计数产生游动孢子的数量。
如图2所示，在光学显微镜下(10×)，可以清晰的观察产生的游动孢子。
对比例1
1、实验材料：
(1)诱导液、草本植物叶片(番荔枝叶子)，光学显微镜等。
(2)试验用培养基：2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)(广东星朗生物科技有限公司)、脑心浸出液琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司)、无菌脱纤维绵羊血(购买自广东星朗生物科技有限公司)。
(3)菌株：隐袭腐霉菌分离株(实验室保藏)。
2、试验前的准备工作：
(1)配制孢子诱导液
配制孢子诱导液；
A液：K2HPO4,87.09g；KH2PO4,68.05g；(NH4)2HPO4 66.04g；超纯水,500ml.
B液：CaCl2·2H20,18.38g；MgCl2·6H2O 25.42g；超纯水250ml。
将0.5ml A液和0.1ml B液,加入1L dd水,pH为7.1储存4℃保存待使用。
(2)草本植物(番荔枝叶子)叶片剪成25mm小片，置于无菌水中121℃灭菌储存备用。
(3)隐袭腐霉菌在90mm平皿培养至菌丝生长直径约40-60mm大小。
3、诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法：
(1)从新鲜脑心浸出液绵羊血板上挑取带菌丝的琼脂塞，转移到2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板上。
(2)取2％沙氏葡萄糖琼脂(SDA)板带菌丝的琼脂塞并转移到pH 6.9，2％的水琼脂板上。
(3)同时将灭菌的番荔枝叶子剪成1-4mm小块，覆盖在每个琼脂塞上，置于37℃培养箱孵育1d，在此过程中菌丝会寄生于叶片边缘。
(4)将被寄生的叶片转移到装有30ml诱导液的培养皿中37℃孵育12-24h。
(5)将琼脂块上的草叶取下，放于光学显微镜下观察诱导产生孢子的数量，实验结果均经过三个生物学重复后进行统计分析。
如图3所示，在光学显微镜下(40×)，可以观察到叶片边缘产生的游动孢子。
由于本方法游动孢子吸附于叶片边缘，游动孢子在菌丝之间不能很好地脱离至诱导液中，叶片影响观察视野因此计数困难，不能具体记录产孢数量。
实施例1和对比例1的结果如表1所示，本发明诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法产孢量相较于对比例1产孢量大大提升了可清晰检出的数量，表明本发明方法可以明显提高隐袭腐霉菌产生游动孢子的数量而且简化了产孢步骤。
表1一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法
Figure BDA0003687897840000041
实施例2诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法
参照实施例1的操作，改变植物与诱导液的比例，具体如下：
采摘新鲜植物叶子，称重100g，加入无菌水500ml，榨取成汁。将植物叶子汁液与诱导液按1：1，1：4、1：7的体积比混匀，加入新鲜菌丝琼脂块，37℃，180rpm培养12-24h，计数诱导产生孢子的数量。结果如表2和图3所示，发现植物叶子汁液与诱导液1：1比例产孢效果最好。
表2
Figure BDA0003687897840000051
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）从新鲜脑心浸出液绵羊血板边缘上挑取带菌丝的琼脂塞，转移到2%沙氏葡萄糖琼脂板上，37℃培养箱培养；
（2）取2%沙氏葡萄糖琼脂板带菌丝的琼脂塞，置于2%沙氏葡萄糖肉汤的离心管中，放入37℃摇床中180rpm培养4h；
（3）将（2）步骤培养好的离心管取出，去除离心管中肉汤加入等量超纯水，之后37℃，180rpm培养1h；
（4）将（3）步骤培养好的离心管取出，去除离心管中超纯水加入诱导液与草本植物汁液，两者体积比例为1：1，之后37℃，180rpm培养10-24h；
所述诱导液包括A液和B液；
A液：K2HPO4·3H2O 11.4 g；KH2PO4 6.8 g, (NH4)2HPO4 6.6 g；超纯水 50 ml；
B液： MgCl2·6H2O 2.54 g，CaCl2·2H2O 1.84 g；超纯水25ml；
将0.5ml A液和0.1ml B液，加入1L ddH2O，pH为7.0-7.1储存4℃保存得到诱导液；
所述草本植物汁液为将番荔枝叶子用无菌水洗净，再用70%的酒精浸泡几分钟消毒，草本植物汁液的获得：称重100g，加入无菌水500ml，榨取成汁，植物汁液于121℃灭菌。
2.权利要求1所述方法在诱导隐袭腐霉菌产生游动孢子中的应用。
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