CN111808888B - 一种杉木内生真菌发酵滤液及其萃取物、制备方法和应用 - Google Patents
一种杉木内生真菌发酵滤液及其萃取物、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种杉木内生真菌发酵滤液及其萃取物、制备方法和应用。本发明的Epicoccum dendrobii SMEL的发酵滤液能够显著抑制杉木炭疽菌孢子萌发，抑制杉木炭疽菌的附着胞发育；Epicoccum dendrobii SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物能明显抑制杉木炭疽菌的菌丝生长，显著抑制杉木炭疽菌的孢子萌发和附着胞发育；接种试验表明该乙酸乙酯萃取物显著了抑制杉木炭疽菌的致病力。
Description
技术领域
本发明属于微生物农药领域，尤其涉及一种杉木内生真菌发酵滤液及其萃取物、制备方法和应用。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata）广泛种植于我国福建、江西、广西、四川、湖南、安徽、江苏等多个省（区），由于其干形挺直圆满、生长速度快、抗虫耐腐、经济价值高等特点，是我国重要的速生用材树种。杉木的造林面积和木材蓄积量均位列我国主要造林树种的第1位。由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的杉木炭疽病对我国杉木栽培区杉木生长造成了严重危害，病害轻微时杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严重时会使杉木幼林成片枯黄、枯死，造成毁灭性的损害。杉木炭疽菌的营养方式是一种依赖于附着胞等介导的半活体营养方式。其侵染寄主植物的过程包括：（1）孢子萌发形成芽管菌丝；（2）芽管菌丝顶端分化产生附着胞；（3）附着胞分化产生侵染栓穿透植物表层细胞的细胞壁，并分化形成侵染菌丝侵染活体细胞；（4）侵染菌丝分化产生次生菌丝分泌降解酶类杀死寄主细胞。
目前杉木炭疽病的防治主要依赖于化学防治，该方法容易导致环境污染、误伤天敌、人畜生健康风险和病菌的抗药性等问题。生物防治具有绿色环保、防效持续性长、对人畜无害等优势，使其成为一种理想的植物病虫害防治途径。生物防治的一种应用方法是在自然环境中直接释放微生物，通过生防微生物与靶标病虫害的接触发挥生防作用；另一种方式是对生防微生代谢产生的抑菌物质进行提纯和应用，该方法具有防效高、受环境因素影响小等优势，具有广泛的开发和应用前景。Epicoccum dendrobii是一种杉木内生真菌，但目前关于该菌抑菌成分的提纯萃取及其萃取物的应用还缺乏研究。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株杉木内生真菌Epicoccum dendrobii SMEL发酵滤液及其乙酸乙酯萃取物制备的方法，满足生物防治的使用需求。本发明的另一目的是提供上述杉木内生真菌发酵滤液和乙酸乙酯萃取物的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种杉木内生真菌发酵滤液，其特征在于，其由杉木内生真菌经过发酵和过滤形成；所述的杉木内生真菌保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其分类命名为Epicoccum dendrobii SMEL，此菌株代号为SMEL，其保藏编号是CCTCC No: M 2019895，保藏日期：2019年11月4日。
前述的杉木内生真菌发酵滤液的制备方法，包括如下步骤：将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中震荡培养，收集发酵滤液；通过过滤得到无菌发酵滤液。
更具体地，将杉木内生真菌的菌丝块接种至无菌PD培养基中，28℃条件下，150rpm震荡培养5d；收集发酵滤液；过滤得到无菌发酵滤液。值得一提的是，并非必需以这样严苛的条件进行杉木内生真菌的发酵和过滤才能制得相应的发酵滤液，任何能制得杉木内生真菌发酵滤液的制备过程均属于本发明的保护范围。
本发明还提供杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物，由杉木内生真菌经过发酵、过滤形成无菌发酵滤液，通过乙酸乙酯对无菌发酵滤液进行萃取以得到杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。
杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物的制备方法可以为：将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中，置于暗室摇培一定时间并过滤得到无菌发酵滤液；向无菌发酵滤液加入乙酸乙酯，然后静置；收集上层有机相，对该有机相进行蒸馏，沉淀采用DMSO进行溶解，过滤，得到发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。其中蒸馏操作是将由分液漏斗收集到的前述的上层有机相进行加热、抽真空，让溶剂挥发掉，留下的沉淀含有抑菌成分，留下的沉淀采用DMSO进行溶解，过滤，得到发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。
前述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物的制备方法，更具体为：将杉木内生真菌的菌丝块接种至无菌PD培养基中，置于暗室摇床25℃，130rpm摇培40d（此为发酵过程），过滤得到无菌发酵滤液（经过0.22-μm滤器过滤后，无菌发酵滤液中不含SMEL菌）；向无菌发酵滤液加入3倍体积的乙酸乙酯并充分混合，然后静置24h；采用分液漏斗收集上层有机相，采用旋转蒸发仪在40℃条件下对该有机相进行蒸馏；沉淀采用DMSO进行溶解，过滤，得到发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。值得一提的是，并非必需以这样严苛的条件进行发酵滤液的萃取才能制得相应的萃取物，任何能制得发酵滤液萃取物的方法均属于本发明的保护范围。
本发明的又一个目的是提供前述的杉木内生真菌发酵滤液在制备抑制杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞发育的农用药物中的应用。
本发明的另一个目的是提供前述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物在制备抑制杉木炭疽菌生长的农用药物中的应用，以及在制备抑制杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞发育的农用药物中的应用，以及在制备防治杉木炭疽病的农用药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优势：
（1）Epicoccum dendrobii菌株SMEL为一种植物内生菌，与其他环境微生物相比，该菌产生的抑菌成分能在植物体内长期存在与转运，具有更持久的防治效果。该菌的发酵滤液中含有的抑菌成分能显著降低杉木炭疽菌孢子的萌发，降低杉木炭疽菌的附着胞形成率。
（2）与其他生防微生物相比，目前未见关于Epicoccum dendrobii发酵滤液的制备方法的报道以及该菌抑菌物质的萃取方法。本发明提供了一种简便的Epicoccum dendrobii发酵滤液的制备方法以及该滤液通过乙酸乙酯萃取获得抑菌成分。
（3）Epicoccum dendrobii无菌发酵滤液通过乙酸乙酯萃取获得的抑菌成分显著抑制杉木炭疽菌孢子萌发，抑制该菌附着胞发育，降低该菌的致病力，达到良好的病害防治效果。
附图说明
图1是SMEL的发酵滤液对杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的影响结果图；图中，A. SMEL的发酵滤液对杉木炭疽菌孢子萌发的影响（不同字母表示处理间差异显著），B.SMEL的发酵滤液对杉木炭疽菌附着胞形成的影响（不同字母表示处理间差异显著）；
图2是SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌菌丝生长的影响结果图；
图3是SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞发育的影响结果图；图中，A. SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌孢子萌发的影响（不同字母表示处理间差异显著），B. SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌附着胞形成的影响（不同字母表示处理间差异显著）；
图4是SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌致病力的影响结果图；
图5是SMEL的形态学特征图；图中，A. SMEL菌落形态（正面和背面），B.SMEL的孢子堆，C-D. SMEL的子座，E-F. SMEL的孢子梗，G-H. SMEL的孢子，I. SMEL孢子表面的疣突（箭头表示）和基细胞（星号表示）；
图6基于 ITS、LSU、RPB2 和TUB串联序列的SMEL***进化树图；
本发明的一种杉木内生真菌Epicoccum dendrobii SMEL，其保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其分类命名为Epicoccum dendrobii SMEL，其保藏编号是CCTCC No: M 2019895，保藏日期：2019年11月4日。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：杉木内生真菌Epicoccum dendrobii SMEL分离与鉴定
本试验于2017年4月南京林业大学校园采集当年生健康的杉木枝条(采集人：黄麟；
联系电话：025-85427301)，用无菌水洗净，再用75%的无水乙醇进行表面消毒，去除表皮部分，将内部组织转移至PDA平板上，28℃培养，7d后利用无菌挑针挑取菌落边缘部分接种至新的PDA平板上对菌株进行纯化，获得杉木内生真菌菌株SMEL。
该杉木内生真菌Epicoccum dendrobii菌株SMEL的生物学特性如下： SMEL菌株在PDA培养基上的菌落边缘整齐，气生菌丝体为毡状至絮状，扁平，白色至浅褐色；菌落背面浅红色，中央淡褐色至棕色。菌丝有隔膜，菌丝宽1.4～4.1μm；子座呈黑色，表生或部分埋生培养基中。分生孢子梗浅棕色较短，具分枝，有隔膜，长为2.3～8.2μm。分生孢子为球形或近球形，未成熟时为浅棕色，成熟时变为深褐色，直径为8～13μm；孢子表面具有疣突，有一个基细胞（图5）。SMEL菌株形态学特征与Epicoccum dendrobii具有明显的相似性。
序列比对分析发现SMEL菌株的ITS、LSU、RPB2和TUB序列与GenBank数据库中的模式菌种Epicoccum dendrobii的序列相似性分别为100%、100%、98.5%和99.7%。采用MEGA7.0软件构建SMEL与高相似性菌株的***发育树，结果可以看出，SMEL菌株与其他2株Epicoccum dendrobii同属于一个分支（图6）。结合该菌的形态学特征，将SMEL鉴定为Epicoccum dendrobii。
实施例2：SMEL发酵滤液对杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的抑制作用
菌丝块的制备：分别将杉木炭疽菌、SMEL接种至PDA平板上，在25 ℃条件下培养5d后利用无菌的打孔器制备直径为5mm的菌块（即菌丝块）。
为了制备杉木炭疽菌的孢子，将杉木炭疽菌（由南京林业大学森林病理实验室提供，该菌株名称为SMCG1#C，由2017年.杉木炭疽菌遗传转化及附着胞发育过程的细胞核行为观察.南京林业大学南京林业大学学报(自然科学版),41(6):68-72.公开）的菌丝块接种至100ml CMC液体培养基，25℃，200rpm震荡培养，2d后收集孢子并调整浓度至1×105个孢子/ml，获得杉木炭疽菌的孢子悬浮液用于孢子萌发、附着胞发育和接种试验。
将10个直径为5mm的SMEL的菌丝块接种至100ml的无菌PD培养基中，28℃条件下，150rpm震荡培养5d；采用漏斗过滤收集发酵滤液；该发酵滤液通过0.22-μm滤器制备获得SMEL的无菌发酵滤液（过滤后发酵滤液中不含SMEL菌，SMEL培养过程中代谢到发酵液中的成分起到抑菌作用）。取该无菌发酵滤液与等量杉木炭疽菌孢子悬浮液混合充分，取20μl该混合液置于疏水玻片上，25℃暗培养；分别在4h和12h后观察孢子统计孢子的萌发率和附着胞形成率。以未接菌的PD空白培养基和去离子水（ddH2O）为对照。试验设置三次重复，每个处理30个重复（即每个处理统计30个孢子）。结果如图1，从图中可以看出，与未接SMEL菌的PD空白培养基的对照相比，SMEL的发酵滤液显著抑制了杉木炭疽菌孢子的萌发，抑制率为42%（图1A）；尽管空白的PD培养基对杉木炭疽菌附着胞的形成也有一定的抑制作用，但SMEL的发酵滤液对杉木炭疽菌附着胞发育的抑制作用更为显著，抑制率为55%（图1B）。
实施例3：SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌生长的抑制作用
将10个直径为5mm的SMEL的菌丝块接种至盛有200ml的无菌PD培养基的500ml锥形瓶中，置于暗室摇床25℃，130rpm摇培40d，采用漏斗过滤收集发酵滤液；该发酵滤液经0.22-μm滤器过滤得到SMEL的无菌发酵滤液（过滤后发酵滤液中不含SMEL菌，SMEL培养过程中代谢到发酵液中的成分起到抑菌作用）；向无菌发酵滤液加入3倍体积的乙酸乙酯并充分混合（即乙酸乙酯体积为发酵滤液体积的3倍），然后静置24h；采用分液漏斗收集上层有机相，采用旋转蒸发仪在40℃条件下对该有机相进行蒸馏；沉淀采用5ml的DMSO进行溶解，并通过0.45-μm滤器制备获得SMEL发酵液的乙酸乙酯萃取物。以未接种SMEL的等体积PD培养基作为对照。
按照实施例2中制备杉木炭疽菌的孢子悬浮液，将孢子悬浮液与PDA培养基混合倒平板，待培养基冷却后利用打孔器在培养基上制备直径为6mm的接种孔，每个平板等距离制备3个接种孔，分别向接种孔中加入20μl的SEML发酵液乙酸乙酯萃取物、PD培养基乙酸乙酯萃取物和溶剂DMSO，5d后观察接种口周围的抑菌带。试验设置三次重复，每个处理3个重复。结果如图2，从图中可以看出，在加入SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物的接种孔周围出现了明显的抑菌带，表明该提取物显著抑制了杉木炭疽菌的菌丝生长（图2）。
实施例4：SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的抑制作用
按照实施例2制备杉木炭疽菌的孢子悬浮液，按照实施例3制备SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。将2μl该乙酸乙酯萃取物加入到1ml的杉木炭疽菌孢子悬浮液并混合均匀，取20μl该混合液置于疏水玻片上，25℃暗培养，分别在2h和4h后统计孢子的萌发率，8h和12h后统计附着胞的形成率。以空白PD的乙酸乙酯萃取物、DMSO和ddH2O为对照。试验设置三次重复，每个处理统计30个孢子。结果如图3，从图中可以看出，与空白PD的乙酸乙酯萃取物的对照相比，SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物显著抑制了杉木炭疽菌孢子的萌发，2h和4h孢子萌发抑制率为分别为68%和38%（图3A）；并且SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物明显抑制了杉木炭疽菌附着胞的形成，8h和12h附着胞形成抑制率分别为65%和59%（图3B）。
实施例5：SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物对杉木炭疽菌致病力的抑制作用
野外采集健康的杂交马褂木叶片，用75%酒精对叶片进行表面消毒；表面消毒后的叶片采用无菌接种针进行创伤并用于接种试验。按照实施例2制备杉木炭疽菌的孢子悬浮液，按照实施例3制备SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。将2μl乙酸乙酯萃取物加入到1ml的杉木炭疽菌孢子悬浮液并混合均匀，取10μl的孢子混合液接种至马褂木叶片创伤处，以空白PD的乙酸乙酯萃取物、DMSO和ddH2O为对照。接种叶片放入培养皿中，底层放置一层潮湿的滤纸进行保湿处理，培养皿封口后置于25 oC培养箱中进行12h光照/12h黑暗交替处理。接种5d后观察叶片发病情况。试验设置三次重复，每个处理3个重复。结果如图4，从图中可以看出，与空白PD的乙酸乙酯萃取物的对照相比，SMEL发酵滤液的乙酸乙酯萃取物处理后炭疽病的病斑减小了36%，显著抑制了杉木炭疽菌的致病力（图4）。
附录：SMEL菌株的基因序列
ITS:
TGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAAACATAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTTAAAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACTCATAACGGCGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCT（SEQ ID NO.1）
LSU:
GCGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGGCGCTTTGGCATTGGCAGCGGTCCAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCACAGAGGGTGAGAATCCCGTACGTGGTCGCTAGCCTTTACCGTGTAAAGCCCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATACTGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAGCCAGACTTGCCTGTAGTTGCTCATCCGGGTTTCTACCCGGTGCACTCTTCTACGGGCAGGCCAGCATCAGTTTGGGCGGTTGGATAAAGGTCTCTGTCATGTACCTCCTCTCGGGGAGATCTTATAGGGGAGACGACATGCAACCAGCCTGGACTGAGGTCCGCGCATCTGCTAGGATGCTGGCGTAATGGCTGTAAGCGGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATCTATGCGAGTGTTTGGGTGTCAAGCCCGAGCGCGTAATGAAAGTGAACGGAGGTGGGAACCTTTCGGGGTGCACCATCGACCGATCCTGATGTCTTCGGATGGATTTGAGTAAGAGCATAGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGAATAGGGTGAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAATTTGGGCATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACTATCTAGTAGCTGGTTCCTGCCGA（SEQ ID NO.2）
RPB2:
GGGGTCTTGTGTGCCCCGCCGAGACACCTGAAGGACAGGCTTGTGGTCTTGTCAAGAACTTGTCCCTGATGTGCTACGTCAGTGTCGGTAGCGATGCCGGACCCATATCCGACTTCATGGGCCAGCGAAACATGCTGATGCTTGAAGAATATGATCAAAACCAGAACCCGGATGCCACCAAGGTCTTCGTCAACGGTGTATGGGTCGGTGTGCACTCTAACGCACAACAGCTTGTCTCTACAGTGCAGGAGCTTCGCCGTAATGGAACCCTCTCTTACGAGATGAGTTTGATTCGAGACATCCGTGACCGAGAGTTCAAAATCTTCACAGATGCTGGACGTGTTATGAGGCCTCTCTTCGTAGTGGAGAACGACGTGCGCAAGCCTAATAGGAATCACCTCGTCTACAACCAAGAGCACTACGGCAAGCTGGCTCGAGAGCAACAGGCAATGTCTCAGGCAGGCGTCGGCGAGGAAGAGAGGCTGGCAGAGCCTTATGGCTGGAAGGGCCTCATTCAAGATGGTGTTATTGAATACCTTGACGCGGAAGAGGAGGAGACTGCCATGATTGTCATGTCGCCCGAAGATCTCGGCGAG（SEQID NO.3）
TUB:
TCCGGATTGGCCGAAGACGAAGTTGTCGGGACGGAAGAGCTGGCCGAAGGGACCGGCGCGGACGGCGTCCATTGTACCGGGCTCCAAGTCGACGAGGACGGCACGGGGAACGAACTTGTTGCCAGAGGCCTGTGGGAGGTCAGCACTCGCAGTCCGTCTCAGGAAAGCGTGTCGTTTCTAGTACCTCGTTGAAGTAGACGTTCATGCGCTCGAGCTGGAGGTCCGAGGTGCCGTTGTAGACACCGGAGCCGTCGAGGCCATGCTCGCCGGAGATGGTCTGCCAGAAGGCGGCACCGATTTGGTTACCCTGTCCATTGTGAGCTGCCGTCCATGAGAGAACATGGAGGTGGTAAACTTACGCACTGACCGGTCTGAAGGTGAACA（SEQ ID NO.4）
综上描述了本申请发明的基本原理和应用前景。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本申请发明的原理，在不脱离本发明功能、原则和范围的前提下，本发明还会不断改进和完善，这些完善都要求在保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种杉木内生真菌发酵滤液及其萃取物、制备方法和应用
<130> 2020073105-zf-xhx
<141> 2020-07-31
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> Epicoccum dendrobii
<400> 1
tgcagttgca atcagcgtct gaaaaaacat aatagttaca actttcaaca acggatctct 60
tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtagtgtgaa ttgcagaatt 120
cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccctt ggtattccat ggggcatgcc 180
tgttcgagcg tcatttgtac cttcaagctc tgcttggtgt tgggtgtttt gtctcgcctc 240
tgcgtgtaga ctcgccttaa aacaattggc agccggcgta ttgatttcgg agcgcagtac 300
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<210> 2
<211> 812
<212> DNA
<213> Epicoccum dendrobii
<400> 2
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cactttggaa agagagttaa aaagcacgtg aaattgttga aagggaagcg cttgcagcca 300
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gcatcagttt gggcggttgg ataaaggtct ctgtcatgta cctcctctcg gggagatctt 420
ataggggaga cgacatgcaa ccagcctgga ctgaggtccg cgcatctgct aggatgctgg 480
cgtaatggct gtaagcggcc cgtcttgaaa cacggaccaa ggagtctaac atctatgcga 540
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<213> Epicoccum dendrobii
<400> 3
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gccagcgaaa catgctgatg cttgaagaat atgatcaaaa ccagaacccg gatgccacca 180
aggtcttcgt caacggtgta tgggtcggtg tgcactctaa cgcacaacag cttgtctcta 240
cagtgcagga gcttcgccgt aatggaaccc tctcttacga gatgagtttg attcgagaca 300
tccgtgaccg agagttcaaa atcttcacag atgctggacg tgttatgagg cctctcttcg 360
tagtggagaa cgacgtgcgc aagcctaata ggaatcacct cgtctacaac caagagcact 420
acggcaagct ggctcgagag caacaggcaa tgtctcaggc aggcgtcggc gaggaagaga 480
ggctggcaga gccttatggc tggaagggcc tcattcaaga tggtgttatt gaataccttg 540
acgcggaaga ggaggagact gccatgattg tcatgtcgcc cgaagatctc ggcgag 596
<210> 4
<211> 384
<212> DNA
<213> Epicoccum dendrobii
<400> 4
tccggattgg ccgaagacga agttgtcggg acggaagagc tggccgaagg gaccggcgcg 60
gacggcgtcc attgtaccgg gctccaagtc gacgaggacg gcacggggaa cgaacttgtt 120
gccagaggcc tgtgggaggt cagcactcgc agtccgtctc aggaaagcgt gtcgtttcta 180
gtacctcgtt gaagtagacg ttcatgcgct cgagctggag gtccgaggtg ccgttgtaga 240
caccggagcc gtcgaggcca tgctcgccgg agatggtctg ccagaaggcg gcaccgattt 300
ggttaccctg tccattgtga gctgccgtcc atgagagaac atggaggtgg taaacttacg 360
cactgaccgg tctgaaggtg aaca 384
Claims (8)
1.一种杉木内生真菌发酵滤液，其特征在于，其由杉木内生真菌经过发酵和过滤形成：将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中震荡培养，28℃条件下，150rpm震荡培养5d，采用漏斗过滤收集发酵滤液；通过过滤得到无菌发酵滤液；所述的杉木内生真菌保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学，其分类命名为Epicoccum dendrobii SMEL，其保藏编号是CCTCC No: M 2019895，保藏日期：2019年11月4日。
2.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中震荡培养，28℃条件下，150rpm震荡培养5d，采用漏斗过滤收集发酵滤液；通过过滤得到无菌发酵滤液。
3.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物，其特征在于，由杉木内生真菌经过发酵、过滤得到无菌发酵滤液，通过乙酸乙酯对无菌发酵滤液进行萃取以得到杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物：将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中，置于暗室摇床25℃，130rpm摇培40d，采用漏斗过滤收集发酵滤液，并过滤得到无菌发酵滤液；向无菌发酵滤液加入3倍体积的乙酸乙酯并充分混合，然后静置24h；采用分液漏斗收集上层有机相，采用旋转蒸发仪在40℃条件下对该有机相进行蒸馏，沉淀采用DMSO进行溶解，通过0.45μm滤器过滤，得到发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。
4.权利要求3所述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物的制备方法，其特征在于，将杉木内生真菌的菌丝块接种至培养基中，置于暗室摇床25℃，130rpm摇培40d，采用漏斗过滤收集发酵滤液，并过滤得到无菌发酵滤液；向无菌发酵滤液加入3倍体积的乙酸乙酯并充分混合，然后静置24h；采用分液漏斗收集上层有机相，采用旋转蒸发仪在40℃条件下对该有机相进行蒸馏，沉淀采用DMSO进行溶解，通过0.45μm滤器过滤，得到发酵滤液的乙酸乙酯萃取物。
5.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液在制备抑制杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞发育的农用药物中的应用。
6.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物在制备抑制杉木炭疽菌生长的农用药物中的应用。
7.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物在制备抑制杉木炭疽菌孢子萌发和附着胞发育的农用药物中的应用。
8.权利要求1所述的杉木内生真菌发酵滤液的乙酸乙酯萃取物在制备防治杉木炭疽病的农用药物中的应用。
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| 具抑菌活性杉木内生菌的分离、鉴定及培养条件优化;王森胜等;《基因组学与应用生物学》;20141228;第33卷(第6期);第1275-1280页 * |
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