CN111024877A - 益肾壮骨丸中的中药成分检测方法 - Google Patents

益肾壮骨丸中的中药成分检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了中药检测技术领域内的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，先进行显微镜下观察，初步判定主要药味，再分组进行薄层鉴别作定性判断，然后对莫诺苷与马钱苷进行定量分析，以莫诺苷与马钱苷的总含量作为判断依据；其根据中药成分定性及定量是否符合标准作为判断益肾壮骨丸合格的依据。其有益效果在于：本发明或以多种检测方法进行综合判断，通过一板多测的方式，可以快速判断药物组分的准确性，同时对药物中特定的指标进行定量分析，判断其是否符合设定的指标。其专用于益肾壮骨丸的检测中，本专利中公开的一板多测的思路，也为其他中药成分的检测提供了相应的技术思路。

Description

益肾壮骨丸中的中药成分检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药成分的检测方法，特别涉及益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，属于中药检测技术领域。
背景技术
现有技术中，有一种益肾壮骨丸的中药，其处方包括如下重量组分：山茱萸100份；杜仲100份；枸杞子200份；补骨脂100份；赤芍100份；生地100份；熟地100份；续断200份；威灵仙100份；当归100份；黄芪300份；白芍100份；地龙100份；砂仁40份。
以上十四味中药组分中，生地、熟地、续断、赤芍、威灵仙五味混合煎煮两次，第一次加8倍重量水煎2小时，第二次加5倍重量水煎1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.16～1.18(70～80℃)的稠膏，其余九味粉碎成细粉，与稠膏拌匀，100℃烘干5小时，粉碎，过80～100目筛，用水泛丸，即得。
本品为黄棕色至棕褐色浓缩丸；气香、味苦。
其功能与主治：补益强肾，壮骨强身。用于肝肾亏虚，筋骨瘘弱引起的腰腿痛、关节痛，腰膝酸软，四肢无力等。
用法与用量：口服，温水送服，一次5g，一日3次。
由于中药材的生长环境、年份、品种等因素的限制，导致中药中的有效成分的变化较大，因此，对中药材中的主要成分的定性和定量分析显得尤为重要。现有技术中，有大量记载针对某一特定中药材中的有效成分的类别研究、提纯、定量分析的记载，但对成药成分的研究的技术方案相对较少，尤其是多组分混合后的成药的组分研究较少，原因在于，多种组分混合在一起时，组分之间、有效药物成分之间会相互影响，导致检测结果相互干扰，影响最终的指标评判；如果以每一种有效成分作为单一指标进行检测，则会造成检测繁琐，工作量大，因此，如何将多种不同的药物进行分类，通过更少的检测步骤确定其种类，甚至其有效成分的含量是否符合标准，是本领域内亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其通过多种检测方法进行综合判断，判断药物组分的准确性，同时对药物中特定的指标进行定量分析，判断其是否符合设定的指标。
本发明的目的是这样实现的，一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，包括如下步骤：
(1)取待试成药研成粉末，置显微镜下观察，初步判断是否含有山茱萸、杜仲、枸杞子、补骨脂、当归、黄芪、白芍、地龙及砂仁；
(2)薄层鉴别；
(2.1)取待试成药粉末，加甲醇，加热回流，浓缩后再加于中性氧化铝柱上，再以甲醇洗脱，脱液蒸干，残渣加水溶解，再以水饱和的正丁醇提取后，再蒸干，再加甲醇溶解，制成供试品溶液；另取山茱萸、黄芪、白芍、赤芍对照药材，以本节同样方法制成对照药材溶液；再取熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷对照品，分别加甲醇制成对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，进行色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性；
(2.2)取待试成药粉末，加甲醇，超声处理并过滤，滤液浓缩后作为供试品溶液；另取当归、补骨脂以同法制成对照药材溶液；再取蒿本内酯、补骨脂素和异补骨脂素，分别加甲醇制成对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，进行荧光色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性；
(2.3)取待试成药粉末，加水后加热回流，滤过并浓缩后，用乙酸乙酯振摇提取后，再浓缩，作为供试品溶液Ⅰ；取待试成药粉末，加乙酸乙酯，超声处理后滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液Ⅱ；另取枸杞子对照药材，按照供试品溶液Ⅰ制备方法制成对照药材溶液；再取杜仲对照药材，按照供试品溶液Ⅱ制备方法制成对照药材溶液；吸取供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ、对照药材溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，进行荧光色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液色谱的特征斑点的一致性；
(3)莫诺苷与马钱苷的定量分析：用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以质量含量0.3％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱在240nm处进行HPLC分析；获取莫诺苷与马钱苷的峰面积，按照如下回归方程计算莫诺苷及马钱苷的含量：
莫诺苷Y＝16194X+4280回归系数0.9997
马钱苷Y＝16186X+9019回归系数1
其中，Y为峰面积，X为含量，单位μg/mL；
根据X的值计算成药中的莫诺苷与马钱苷含量和，以成药中的莫诺苷和马钱苷的总量不得低于0.56mg/g作为判断依据。
(4)根据中药成分定性及定量是否符合标准作为判断益肾壮骨丸合格的依据。
本发明通过加入粉末的药物特性进行初步判断，获取初步判断结果，再根据色谱对照分析各物质的对应性，从而进一步准确判断益肾壮骨丸中是否含有配方规定的药味及其主要化学成分；同时，通过测定莫诺苷和马钱苷的总含量，确定药物是否符合标准。通过多种检测方法进行综合判断，通过一板多测的方式，可以快速判断药物组分的准确性，同时对药物中特定的指标进行定量分析，判断其是否符合设定的指标。鉴于中药药物成分的复杂性，决定了不能完全判断中药中的有效成分及含量，通过本发明可以判断出益肾壮骨丸中的主要君药和臣药的成分，已足以通过该指标确立益肾壮骨丸的判断标准，并可通过该标准对不同药物生产厂家生产的益肾壮骨丸予以评定，其专用于益肾壮骨丸的检测中，本专利中公开的一板多测的思路，也为其他中药成分的测试提供了相应的技术思路。
具体而言，步骤(1)中，显微镜下观察时：
果皮表皮细胞表面观多角形或长方形，直径16～30μm，垂周壁连珠状增厚，外平周壁颗粒状角质增厚，胞腔含淡橙黄色物，中果皮细胞橙棕色，多皱缩，初步判断为含有山茱萸；橡胶丝成条或扭曲成团，表面显颗粒状，初步判断为含有杜仲；种皮石细胞表面观不规则多角形，壁厚，波状弯曲，层纹清晰，初步判断为含有枸杞子；纤维成束或散离，直径8～30μm，壁厚，表面有纵裂纹，初生壁与次生壁分离，两端常断裂成须状或较平截，初步判断为含有黄芪；韧皮薄壁细胞纺锤形，壁略厚，表面有极微细的斜向交错纹理，有时可见菲薄的横隔，初步判断为当归；草酸钙簇晶直径11～35μm，存在于薄壁细胞中，排列成行，或一个细胞中含数个簇晶，初步判断为含有白芍；种皮栅状细胞侧面观有纵沟纹，光辉带1条，位于上侧近边缘处，顶面观多角形，胞腔极小，孔沟细，初步判断为含有补骨脂；内种皮厚壁细胞红棕色或黄棕色，表面观多角形，壁厚，非木化，胞腔内含硅质块，断面观为1列栅状细胞，内壁及侧壁极厚，胞腔偏外侧，内含硅质块，初步判断为含有砂仁；表皮细胞呈棕黄色，细胞界限不明显，布有暗棕色的色素颗粒，初步判断为含有地龙。
步骤(2.1)的具体做法是：
取供试品粉末5g，加甲醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至15mL，加于5g、100～120目中性氧化铝柱上，用重量含量40％甲醇水溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取山茱萸、黄芪、白芍、赤芍对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；薄层色谱法试验时，吸取供试品溶液5μL、对照药材溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比13﹕6﹕2的二氯甲烷-甲醇-水溶液的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量浓度10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，再观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性。
步骤(2.2)的具体做法是：
取供试品粉末2g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液；另取当归、补骨脂对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取藁本内酯、补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；进行薄层色谱分析时，吸取上述六种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7﹕2的正己烷-乙酸乙酯溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。
步骤(2.3)的具体做法是：
取供试品粉末5g，加水50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至20mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15mL，合并乙酸乙酯液，浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅰ；再取供试品粉末2g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅱ；另取枸杞子对照药材1g，按照供试品溶液Ⅰ制备方法制成对照药材溶液；再取杜仲对照药材1g，按照供试品溶液Ⅱ制备方法制成对照药材溶液；进行薄层色谱分析时，吸取供试品溶液Ⅰ5μL、供试品溶液Ⅱ5μL、对照药材溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比15﹕8﹕1.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。
步骤(3)中进行莫诺苷与马钱苷的定量分析的具体做法是：
取供试品粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量；超声处理，功率300W，频率50kHz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；分别精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱；以乙腈为流动相A，以重量含量0.3％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；于柱温为30℃下，检测波长为240nm，获取莫诺苷与马钱苷的峰面积，然后再进行计算。
附图说明
图1为各种药材的显微特征图，图中1a：山茱萸果皮表皮细胞表面观(山萸肉)；1b：山茱萸果皮表皮细胞侧面观(山萸肉)；2：山茱萸中果皮细胞(山萸肉)；3：橡胶丝(杜仲)；4：纤维束(黄芪)；5：种皮石细胞(杜仲)；6：韧皮薄壁细胞(当归)；7：草酸钙簇晶(白芍)；8a：种皮栅状细胞侧面观(补骨脂)；8b：种皮栅状细胞顶面观(补骨脂)；9a：内种皮厚壁细胞表面观(砂仁)；9b：内种皮厚壁细胞断面观(砂仁)；10：表皮细胞(地龙)。
图2为步骤(2.1)对应的薄层色谱图；图中，1、12、13：供试品(批号：180821、181203、190425)；2：山茱萸阴性样品；3：山茱萸对照药材；4：熊果酸对照品；5：黄芪阴性对照；6：黄芪对照药材；7：黄芪甲苷对照品；8：芍药苷阴性对照；9：白芍对照药材；10：赤芍对照药材；11：芍药苷对照品。
图3为步骤(2.2)对应的薄层色谱图；图中，1～3：供试品(批号：180821、181203、190425)；4：补骨脂阴性对照；5：补骨脂对照药材；6：补骨脂素对照品；7：异补骨脂素对照品；8：当归阴性对照；9：当归对照药材；10：藁本内酯对照品。
图4为为步骤(2.3)对应的薄层色谱图；图中，1～3：供试品Ⅰ(批号：180821、181203、190425；与供试品溶液Ⅰ对应)；4：枸杞子阴性对照；5：枸杞子对照药材；6～8：供试品Ⅱ(批号：180821、181203、190425；与供试品溶液Ⅱ对应)；9：杜仲阴性对照；10：杜仲对照药材。
图5为莫诺苷与马钱苷专属性色谱图。
具体实施方式
益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，按照如下方法进行，该方法中涉及的步骤，其顺序可以按照实际情况进行互换。
(1)取待试成药研成粉末，置显微镜下观察，初步判断是否含有山茱萸、杜仲、枸杞子、补骨脂、当归、黄芪、白芍、地龙及砂仁；显微镜下观察时，如图1所示：
果皮表皮细胞表面观多角形或长方形，直径16～30μm，垂周壁连珠状增厚，外平周壁颗粒状角质增厚，胞腔含淡橙黄色物，中果皮细胞橙棕色，多皱缩，初步判断为含有山茱萸；橡胶丝成条或扭曲成团，表面显颗粒状，初步判断为含有杜仲；种皮石细胞表面观不规则多角形，壁厚，波状弯曲，层纹清晰，初步判断为含有枸杞子；纤维成束或散离，直径8～30μm，壁厚，表面有纵裂纹，初生壁与次生壁分离，两端常断裂成须状或较平截，初步判断为含有黄芪；韧皮薄壁细胞纺锤形，壁略厚，表面有极微细的斜向交错纹理，有时可见菲薄的横隔，初步判断为当归；草酸钙簇晶直径11～35μm，存在于薄壁细胞中，排列成行，或一个细胞中含数个簇晶，初步判断为含有白芍；种皮栅状细胞侧面观有纵沟纹，光辉带1条，位于上侧近边缘处，顶面观多角形，胞腔极小，孔沟细，初步判断为含有补骨脂；内种皮厚壁细胞红棕色或黄棕色，表面观多角形，壁厚，非木化，胞腔内含硅质块，断面观为1列栅状细胞，内壁及侧壁极厚，胞腔偏外侧，内含硅质块，初步判断为含有砂仁；表皮细胞呈棕黄色，细胞界限不明显，布有暗棕色的色素颗粒，初步判断为含有地龙。
(2)薄层鉴别；
步骤(2.1)，具体做法是：取供试品粉末5g，加甲醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至15mL，加于5g、100～120目中性氧化铝柱上，用重量含量40％甲醇水溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取山茱萸、黄芪、白芍、赤芍对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；薄层色谱法试验时，吸取供试品溶液5μL、对照药材溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比13﹕6﹕2的二氯甲烷-甲醇-水溶液的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量浓度10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，再观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性。如图2所示。
步骤(2.2)，具体做法是：
取供试品粉末2g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液；另取当归、补骨脂对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取藁本内酯、补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；进行薄层色谱分析时，吸取上述六种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7﹕2的正己烷-乙酸乙酯溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。如图3所示。
步骤(2.3)，具体做法是：
取供试品粉末5g，加水50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至20mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15mL，合并乙酸乙酯液，浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅰ；再取供试品粉末2g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅱ；另取枸杞子对照药材1g，按照供试品溶液Ⅰ制备方法制成对照药材溶液；再取杜仲对照药材1g，按照供试品溶液Ⅱ制备方法制成对照药材溶液；进行薄层色谱分析时，吸取供试品溶液Ⅰ5μL、供试品溶液Ⅱ5μL、对照药材溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比15﹕8﹕1.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。如图4所示。
上述步骤(2.1)、(2.2)、(2.3)中的薄层鉴别时，供试品批号：180821、181203、190425。
步骤(2.1)中以山茱萸、黄芪、白芍、赤芍为对照药材，以熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷为对照品，进行一板多测鉴别，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，色谱图见图2。
步骤(2.2)中，以当归、补骨脂为对照药材，以藁本内酯、补骨脂素、异补骨脂素为对照品，进行一板多测鉴别，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图3。
步骤(2.3)中，以枸杞子、杜仲为对照药材，进行一板多测鉴别，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图4。
(3)莫诺苷与马钱苷的定量分析：取供试品粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量；超声处理，功率300W，频率50kHz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；分别精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱；以乙腈为流动相A，以重量含量0.3％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；于柱温为30℃下，检测波长为240nm，获取莫诺苷与马钱苷的峰面积，按照如下回归方程计算莫诺苷及马钱苷的含量：
莫诺苷Y＝16194X+4280回归系数0.9997
马钱苷Y＝16186X+9019回归系数1
其中，Y为峰面积，X为含量，单位μg/mL；
再根据X的值计算成药中的莫诺苷与马钱苷含量和，以成药中的莫诺苷和马钱苷的总量不得低于0.56mg/g作为判断依据。
进行梯度洗脱时，按表1进行：
表1梯度洗脱表
时间(分钟) A(％) B(％)
0～20 7 93
20～60 7→20 93→80
60～70 20 80
70～75 20→7 80→93
75～80 7 93
取莫诺苷、马钱苷作对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含莫诺苷20μg、马钱苷50μg的混合溶液。
更具体而言，是采用高效液相色谱法测定君药山萸肉中莫诺苷、马钱苷的含量。
仪器：安捷伦公司Agilent1260高效液相色谱仪，DAD检测器；梅特勒-托利多公司Mettler Toledo XS205 DU分析天平；昆山禾创超声仪器有限公司KH-400KDE型高功率数控超声波清洗器；赛默飞公司OGH60电热恒温干燥箱；密理博公司Milli-Q超纯水仪；拜杰公司BT-150多功能粉碎机(550W，50～60Hz)。
试样与试剂：益肾壮骨丸样品(规格：45g/盒，宝应县中医医院，批号：181119、181203、181218)；益肾壮骨丸阴性样品(缺山萸肉，宝应县中医医院，批号：181203)；莫诺苷对照品(批号：111998-201602，含量：96.3％)、马钱苷对照品(批号：111640-201808，含量：99％)，均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯(北京迪马科技有限公司)；甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为纯化水。
考察准确度、精密度、专属性、线性范围、检测限、定量限等。
一、准确度
取样品(批号：181203)粉末(过四号筛)2.5g，精密称定，精密加入含莫诺苷17.64μg、马钱苷45.84μg的混合对照品溶液25mL，供试品溶液的制备6份，测定各待测成分含量，计算加样回收率，结果见表2。
表2加样回收率试验结果
Figure BDA0002346310190000121
由上表可知，本方法准确度良好。
二、精密度
取样品(批号：181203)粉末，按标准方法平行制备6份供试品溶液进行测定，计算含量，结果莫诺苷和马钱苷的含量测定值RSD分别为0.9％，0.7％。另考察了不同检验员、不同品牌仪器、不同日期的结果相对偏差，均在2.0％以内。综上说明，本方法精密度良好。
三、专属性
分别取样品(批号：181203)粉末、阴性样品(批号：181203)粉末，按标准方法制备和进样，记录色谱图，见图5。结果，样品中检出莫诺苷、马钱苷色谱峰，且与相邻峰的分离度大于1.5，阴性样品中未检出相应的色谱峰，说明阴性无干扰，本方法专属性良好。
四、线性范围
取莫诺苷、马钱苷对照品适量，用甲醇稀释制成6个不同浓度的混合对照品溶液，莫诺苷浓度分别为2.94μg/mL、5.87μg/mL、11.75μg/mL、29.37μg/mL、46.99μg/mL、58.74μg/mL；马钱苷浓度分别为15.29μg/mL、30.57μg/mL、61.14μg/mL、152.85μg/mL、244.56μg/mL、305.70μg/mL。取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以各对照品的浓度(μg/mL)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线。线性方程、线性范围和相关系数见表3。实验结果显示，莫诺苷和马钱苷的浓度与峰面积呈良好的线性关系。通过该线性关系，可以计算出莫诺苷和马钱苷的含量及其含量和。
表3线性关系考察结果
待测成分 回归方程 r 线性范围(μg/mL)
莫诺苷 Y＝16194X+4280 0.9997 2.94～58.74
马钱苷 Y＝16186X+9019 1 15.29～305.70
五、检测限和定量限
分别取莫诺苷、马钱苷对照品适量，加甲醇稀释制成适当浓度的溶液，取10μL进样分析，以信噪比S/N＝3为指标，结果莫诺苷进样浓度为0.29μg/mL，即检测限为2.9×10-3μg；马钱苷进样浓度为0.31μg/mL，即检测限为3.1×10-3μg；以信噪比S/N＝10为指标，结果莫诺苷进样浓度为0.98μg/mL，即定量限为9.8×10-3μg；马钱苷进样浓度为1.02μg/mL，即定量限为10.2×10-3μg。
六、样品测定
分别对3批样品进行测定，结果见表4。
表4样品含量测定结果
样品批号 莫诺苷含量(mg/g) 马钱苷含量(mg/g)
181119 0.169 0.512
181203 0.183 0.535
181218 0.188 0.527
七、方法考察
山茱萸项下的含量测定方法，选择以乙腈-0.3％磷酸梯度洗脱为流动相。在200～400nm波长范围内进行扫描，选择有最大吸收且干扰峰较少的240nm处测定莫诺苷、马钱苷。
在样品前处理方法研究中，将样品分为甲醇加热回流组、甲醇超声组、70％甲醇加热回流组、70％甲醇超声组、乙醇加热回流组、乙醇超声组、70％乙醇加热回流组和70％乙醇超声组，考察待测成分的含量。结果，甲醇提取的各待测成分的含量均大于乙醇；加热回流提取与超声处理相比较，未见更多的色谱峰信息，且待测成分含量差异不大，故选择以甲醇超声处理。同时考察了不同提取时间下(30分钟、45分钟、60分钟)待测成分的含量差异。结果，3组样品的含量无明显差异，故选择超声处理30分钟即可。
3批样品中莫诺苷的平均测定值为0.180mg/g，马钱苷的平均测定值为0.525mg/g。考虑以平均测定值的80％设限，规定益肾壮骨丸含莫诺苷和马钱苷的总量不得低于0.56mg/g。
(4)根据中药成分定性及定量是否符合标准作为判断益肾壮骨丸合格的依据。
本成药中，生地、熟地、续断、赤芍、威灵仙五味以水煎液入药，尝试采用薄层色谱法对成药中的上述几种药材进行鉴别研究，分别考察了水溶液、甲醇提取液、正丁醇提取液、乙酸乙酯提取液、石油醚提取液等薄层色谱效果。结果，仅赤芍的甲醇提取液中可检出芍药苷，其他药材均难以检出专属性成分。中药药物成分的复杂性，决定了不能完全判断中药中的有效成分及含量。但在本实施例的公开范围内，已经足以确定益肾壮骨丸的成分及主要物质的含量。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）取待试成药研成粉末，置显微镜下观察，初步判断是否含有山茱萸、杜仲、枸杞子、补骨脂、当归、黄芪、白芍、地龙及砂仁；
（2）薄层鉴别；
（2.1）取待试成药粉末，加甲醇，加热回流，浓缩后再加于中性氧化铝柱上，再以甲醇洗脱，脱液蒸干，残渣加水溶解，再以水饱和的正丁醇提取后，再蒸干，再加甲醇溶解，制成供试品溶液；另取山茱萸、黄芪、白芍、赤芍对照药材，以本节同样方法制成对照药材溶液；再取熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷对照品，分别加甲醇制成对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，进行色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性；
（2.2）取待试成药粉末，加甲醇，超声处理并过滤，滤液浓缩后作为供试品溶液；另取当归、补骨脂以同法制成对照药材溶液；再取蒿本内酯、补骨脂素和异补骨脂素，分别加甲醇制成对照品溶液；吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，进行荧光色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性；
（2.3）取待试成药粉末，加水后加热回流，滤过并浓缩后，用乙酸乙酯振摇提取后，再浓缩，作为供试品溶液Ⅰ；取待试成药粉末，加乙酸乙酯，超声处理后滤过，滤液浓缩，作为供试品溶液Ⅱ；另取枸杞子对照药材，按照供试品溶液Ⅰ制备方法制成对照药材溶液；再取杜仲对照药材，按照供试品溶液Ⅱ制备方法制成对照药材溶液；吸取供试品溶液Ⅰ、供试品溶液Ⅱ、对照药材溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，进行荧光色谱分析，观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液色谱的特征斑点的一致性；
（3）莫诺苷与马钱苷的定量分析：用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，以质量含量0.3％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，在240nm波长处进行HPLC分析；获取莫诺苷与马钱苷的峰面积，按照如下回归方程计算莫诺苷及马钱苷的含量：
莫诺苷Y=16194X＋4280 回归系数0.9997
马钱苷Y=16186X＋9019 回归系数1
其中，Y为峰面积，X为含量，单位μg/mL；
根据X的值计算成药中的莫诺苷与马钱苷含量和，以成药中的莫诺苷和马钱苷的总量不得低于0.56mg/g作为判断依据；
（4）根据中药成分定性及定量是否符合标准作为判断益肾壮骨丸合格的依据。
2.根据权利要求1所述的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于：步骤（1）中，显微镜下观察时，
果皮表皮细胞表面观多角形或长方形，直径16～30μm，垂周壁连珠状增厚，外平周壁颗粒状角质增厚，胞腔含淡橙黄色物，中果皮细胞橙棕色，多皱缩，初步判断为含有山茱萸；
橡胶丝成条或扭曲成团，表面显颗粒状，初步判断为含有杜仲；
种皮石细胞表面观不规则多角形，壁厚，波状弯曲，层纹清晰，初步判断为含有枸杞子；
纤维成束或散离，直径8～30μm，壁厚，表面有纵裂纹，初生壁与次生壁分离，两端常断裂成须状或较平截，初步判断为含有黄芪；
韧皮薄壁细胞纺锤形，壁略厚，表面有极微细的斜向交错纹理，有时可见菲薄的横隔，初步判断为当归；
草酸钙簇晶直径11～35μm，存在于薄壁细胞中，排列成行，或一个细胞中含数个簇晶，初步判断为含有白芍；
种皮栅状细胞侧面观有纵沟纹，光辉带1条，位于上侧近边缘处，顶面观多角形，胞腔极小，孔沟细，初步判断为含有补骨脂；
内种皮厚壁细胞红棕色或黄棕色，表面观多角形，壁厚，非木化，胞腔内含硅质块，断面观为1列栅状细胞，内壁及侧壁极厚，胞腔偏外侧，内含硅质块，初步判断为含有砂仁；
表皮细胞呈棕黄色，细胞界限不明显，布有暗棕色的色素颗粒，初步判断为含有地龙。
3.根据权利要求1所述的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于步骤（2.1）的具体做法是：
取供试品粉末5g，加甲醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至15mL，加于5g 、100～120目中性氧化铝柱上，用重量含量40％甲醇水溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取山茱萸、黄芪、白芍、赤芍对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取熊果酸、黄芪甲苷、芍药苷对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；薄层色谱法试验时，吸取供试品溶液5μL、对照药材溶液和对照品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比13﹕6﹕2的二氯甲烷-甲醇-水溶液的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量浓度10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，再观察供试品溶液的色谱与对照药材溶液、对照品溶液的色谱的特征斑点的一致性。
4.根据权利要求1所述的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于步骤（2.2）的具体做法是：
取供试品粉末2g，加甲醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液；另取当归、补骨脂对照药材各1g，分别同法制成对照药材溶液；再取藁本内酯、补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；进行薄层色谱分析时，吸取上述六种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7﹕2的正己烷-乙酸乙酯溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。
5.根据权利要求1所述的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于步骤（2.3）的具体做法是：
取供试品粉末5g，加水50mL，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩至20mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15mL，合并乙酸乙酯液，浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅰ；再取供试品粉末2g，加乙酸乙酯30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液Ⅱ；另取枸杞子对照药材1g，按照供试品溶液Ⅰ制备方法制成对照药材溶液；再取杜仲对照药材1g，按照供试品溶液Ⅱ制备方法制成对照药材溶液；进行薄层色谱分析时，吸取供试品溶液Ⅰ5μL、供试品溶液Ⅱ5μL、对照药材溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比15﹕8﹕1.5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；判断供试品与对照药材、对照品色谱相应的位置上，是否显相同颜色的荧光斑点。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种益肾壮骨丸中的中药成分检测方法，其特征在于步骤（3）中进行莫诺苷与马钱苷的定量分析的具体做法是：
取供试品粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量；超声处理，功率300W，频率50kHz，30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；分别精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱；以乙腈为流动相A，以重量含量0.3％的磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；于柱温为30℃下，检测波长为240nm，获取莫诺苷与马钱苷的峰面积，然后再进行计算。
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