JP2839493B2 - 培養におけるセルラーゼ製剤の使用及びセルロース生産微生物の使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばアセトバクター・キシリヌム（Acet
obacter xylinum）のようなセルロース生産微生物によ
ってセルロースが生産されながらそれを分解するセルロ
ース加水分解酵素の作用に関する。本発明に関する理論
的根拠は多種にわたる。多量のセルロースを生産するア
セトバクター属のような生物は、細胞が厚いセルロース
薄膜中でしばしばからみ合うようになることから、１つ
の接種原から次の接種原に移すことがやや困難である。
セルロースの大規模生産の場合には、多量の接種原が最
終大規模セルロース生産工程において必要である。セル
ラーゼ酵素製剤は細胞増殖を阻害しないが、増殖培地に
加えられるセルラーゼ製剤が適度の濃度である場合に
は、セルロースは全く観察されない。この系を用いた場
合、セルラーゼ製剤が栄養培地から希釈又は除去されさ
えすれば、セルロースを合成する上で生理学上完全かつ
十分に有効な多量の細胞を得ることができる。 かかる環境下でのセルラーゼ製剤の使用におけるもう
１つの利点は、セルロース全部を分解しないほどの極度
に低い濃度のセルラーゼ酵素であってもポリマーの結晶
性を変化させ、かつより速い速度でセルロース合成を進
行させるようになることである。この理論的根拠は、セ
ルロース結晶性に影響を与えかつセルロース合成を促進
させるカルコフルオル（Calcofluor）及びフルオレセイ
ン色素に関しての初期研究と関連がある。 ディリンガム（Dillingham）ら〔1961年、バクテリオ
ロジカル・プロシーディングス（Bacteriological Proc
eedings）、第67巻〕によるアブストラクト“アセトバ
クター・キシリヌムによるセルラーゼ及び無セルロース
細胞生産”は、アセトバクターセルロース生産に関する
セルラーゼの効果について記載していたが、しかしなが
ら、更に文献を調査した限りでは、更に詳細に説明を加
えた関連文献はその後において発見されなかった。この
アブストラクトにおいて、ディリンガムらは次のように
述べている： 通常の培養では白色セルロース薄膜下にほとんど又は
全く混濁を生じていない。セルラーゼ存在下では、薄膜
が生成せず、しかも典型的混濁細胞懸濁液が生じる（通
常の培養における30時間で112×10⁵個と比較し、生育数
が10.0×10⁷個）。 このデータは、ミロセシウム・ベルカリア（Myrothec
ium verrucaria）由来部分精製セルラーゼの存在に起因
して、細胞密度が約９倍増加したことを示している。本
発明は、栄養培地中のセルラーゼ製剤をはじめとする関
数としてみた場合に50〜100倍の増殖増加がみられるセ
ルロース生産微生物の増殖促進技術からなる。しかも、
かかる増殖促進はその後の本発明の方法と合わせて利用
される。 セルロース生産微生物の濃培養物は、本発明の方法に
よる様々な目的のために生産されかつ使用される。最初
にセルラーゼ製剤を含有したセルロース生産微生物用の
栄養培地が調製される。次いで栄養培地にセルロース生
産微生物が接種される。しかる後接種培地は、微生物の
増殖及び実質上セルロース薄膜非含有濃微生物培養物の
生産を促進させるために、好気性条件下でインキュベー
トされる。この濃培養物は多量の栄養培地用の接種原と
して使用されるか、又は回収されて、この回収微生物が
例えば細胞成分源として使用される。多量の栄養培地に
接種された場合、接種培地のその後における好気性イン
キュベーションによってセルロールの大規模生産を促進
させる。 栄養培地が、生産されるセルロースの結晶性に影響を
与えるには十分に高濃度であるが、但し上記セルロール
のすべてを実質上加水分解させるには不十分な濃度でセ
ルラーゼ製剤を含有する場合には、培養微生物によるセ
ルロース合成速度は高まり、しかも生産されるセルロー
ルはより非晶質の特性を有するようになる。 ある場合には、セルロース生産微生物の培養は気体透
過性物質壁を有する構造体中で行なわれ、該構造体は液
体を収容することができる。壁は酸素含有気体と接触す
るように適合された第一側壁及び構造体に収容された液
体と接触するように適合された第二側壁を有する。かか
る状況において、培養される微生物は構造体をセルロー
ス薄膜で満たすようになる。 他の状況下にあっては、多量の非晶質セルロースの生
産が望まれる。セルロース生産微生物の濃培養物は、セ
ルラーゼ製剤含有栄養培地中での培養によって生産され
る。この濃培養物は多量の培地に接種するために使用さ
れる。多量の接種培地は実質上0.5ガウス以上の磁場の
影響下におかれる。磁場存在下で生産されるセルロース
は、通常生産されるものよりも実質上無秩序化されるか
又は非晶質化される。 本発明は、栄養培地中に含まれるセルラーゼ製剤によ
るセルロース生産微生物の刺激に関する。通常50〜100
倍のこの促進化は好気性培養条件下で達成される。セル
ロース生産微生物の濃培養物は容易に生産され、かかる
微生物の細胞成分源として又は引き続いての微生物培養
用の接種原として使用される。 本発明の実施に際して使用可能なセルロース生産微生
物としては、アセトバクター・リゾビウム（Acetobacte
r Rhizobium）、アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）、シュードモナス（Pseudomonas）又はアルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属のものがある。セルラーゼ製剤含
有無菌栄養培地が調製される。栄養培地成分として使用
可能なセルラーゼ製剤は酵素セルラーゼ（β−1,4−グ
ルカン・グルカンヒドロラーゼ,FC3.2.1.4）からなるべ
きであるが、所望であればセロビオヒドロラーゼ又はβ
−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシド・グルコヒドロ
ラーゼ,EC3.2.1.21）を含有していてもよい。セルラー
ゼ製剤は、ミロセシウム（Myrothecium）、トリコデル
マ（Trichoderma）又はポリポルス（Polyporus）属のも
ののような生物から得られる。更に具体的には、セルラ
ーゼ製剤はミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium ve
rrucaria）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viri
de）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）
又はポリポルス・ベルシコロル（Polyporus versicolo
r）種の生物から得られる。セルラーゼ製剤含有栄養培
地（通常セルラーゼ約0.000375〜0.015単位/ml）はセル
ロース生産微生物で接種される。次いでこの接種培地は
好気性条件下でかつ通常約20〜約40℃の温度でインキュ
ベートされる。セルロース生産微生物培養用の栄養培地
は、約３〜約７のpHであることが好ましい。セルロース
生産微生物の培養に適した栄養培地としては、単純もし
くは複合炭水化物、窒素源、無機物及びビタミンを含有
したもののように、当該技術分野で周知の各種多様の培
地がある。アセトバクター用の窒素、炭素等の多数の適
当な供給源は、テレイ、バージーズ・マニュアル・オブ
・システマティック・バクテリオロジー、第１巻、第26
8−274頁、1984年、ウィリアムズ及びウィルキンス、ボ
ルチモア／ロンドン〔De Ley,Bergey′s Manual of Sys
tematic Bacteriology,Vl,pp268−274（1984）Williams
and Wilkins,Baltimore/London〕に示されている。 セルロース生産微生物の濃培養物が求められる場合に
は、栄養培地中のセルラーゼ製剤レベルは生産される実
質上すべての微生物セルロースを加水分解するために十
分高濃度であることが好ましい。部分的加水分解により
変化をうけた微生物セルロースの生産が求められる場合
には、栄養培地中のセルラーゼ製剤レベルは生産される
実質上すべてのセルロースを加水分解するために十分な
濃度よりも低いことが好ましい。 上記方法により生産される濃微生物培養物は、多量栄
養培地用の接種原として使用される。あるいは、細胞は
そこから回収され、例えば特定タンパク質又は核酸のよ
うな細胞成分源として使用される。かかる濃培養物から
の細胞回収は、セルロースのイン・ビトロ合成において
活性な十分量の酵素を得る上で重要である。このような
濃細菌培養物は、例えばセルロース合成に必要な成分と
してDNA又はタンパク質等の細胞成分の抽出のために、
容易に利用可能な量の細菌をも提供する。 微生物セルロースが大規模に生産される場合には、セ
ルロース生産微生物用の多量の栄養培地が調製され、上
記のように調製された接種原で接種される。次いで微生
物セルロースの生産が好気性インキュベーションによっ
て促進される。“好気性インキュベーシヨン”という語
からは、接種培地が例えば空気のような酸素含有気体に
露呈されていることが想像される。この露呈は、培地中
に気体を吹込むことにより、空気と接触する培地表面積
を最適化するように形造られた容器中に接種培地を入れ
ることにより、又は少なくとも１つの気体透過性物質壁
をもつ容器中に接種栄養培地を入れることにより行なわ
れる。 微生物セルロースのイン・ビトロ合成は、セルロール
生産微生物から生産されるセルロースを加水分解するた
めに十分な量のセルラーゼ製剤を含有した栄養培地中に
おけるセルロース生産微生物の培養を伴う方法によって
行なうことが有利である。アセトバクター・キシリヌム
細胞のようなセルロール生産細胞はセルラーゼ製剤含有
栄養培地に接種され、濃細胞培養物の生産を促進させる
ために好気的にインキュベートされる。細胞は回収さ
れ、界面活性剤により可溶化される活性酵素成分及び生
物学的活性を保持している粗上澄を生産させるために処
理する。上記上澄及び酵素成分は次いでUDP−グルコー
ス含有溶液中で混合され、セルロースのイン・ビトロ合
成を促進させるためにインキュベートされる。 下記例は本発明の好ましい態様及び有用性を表わすた
めに掲示されており、特許請求の範囲で他の記載がない
限り本発明を制限するものではない。 例１ セルラーゼによる高細胞密度生産 本発明の例を通して使用されるセルラーゼ製剤は他に
特記のない限りノボ・インダストリA/S（Novo Industri
A/S）製造のセルクラスト（Celluclast）であった。セ
ルクラストは真菌トリコデルマ・レエセイ選択株の液内
発酵により製造されるセルラーゼ製剤である。セルクラ
ストが例えばアビセル（Avicel、微結晶木材セルロー
ス）のようなセルロース基質とインキュベートされた場
合、反応生成物は、主にグルコース、セロビオース及び
高グルコースポリマーである。生じる反応生成物の相対
量は反応条件に依存する。しかも、セルクラストは、例
えばカルボキシメチルセルロース（CMC）及びβ−グル
カン類のような可溶性セルロース基質に対する顕著な粘
度低下作用を有する。換言すれば、セルクラストは、そ
の含有物としての、エキソ活性体たるセロビオヒドロラ
ーゼ（EC3.2.1.91）及びエキソ−1,4−β−Ｄ−グルコ
シダーゼ（EC3.2.2.74）、並びにエンド活性体たるエン
ド−1,4−β−Ｄ−グルカナーゼ（EC3.2.1.4）（セルラ
ーゼ）に特徴がある。 使用される具体的セルクラストは、セルクラスト1.5L
（1500NCU/g）であった。１ノボセルクラスト単位（Nov
o Celluclast Unit,NCU）は、標準的条件下、グルコー
ス１μmol/minに相当する還元力でCMCを還元炭水化物に
分解する酵素量である。 標準的条件 基 質……CMC〔ハーキュリーズ（Hercules）7LFD〕 温 度……40℃ pH ……4.8 反応時間……20分間 セルラーゼ製剤を過滅菌し、250mlエルレンマイヤ
ーフラスコ中のシュラム・ヘストリン（Schramm Hestri
n）培地〔シュラムら、1954年、ジャーナル・オブ・ゼ
ネラル・ミクロバイオロジー、第11巻、第123−129頁
（Schramm et al.（1954）Journal of Genral Microbio
logy,11:pp123−129）〕100mlに加えた。培地フラスコ
にアセトバクター・キシリヌム細胞約10⁴個を接種し
た。接種培養物を回転式プラットホーム（platform）
（100rpm）上28℃で１週間増殖させた。第１表は、培地
に増量させつつ加えられたセルラーゼ製剤の関数とし
て、培地中の細胞増加数及びグルコース減少量を示す。 上記データは、栄養培地中でのセルラーゼ製剤の存在
が１週間の増殖後において細胞数を80倍以上増加させる
ことを示した。セルラーゼ処理で示される細胞数の増加
は、細胞のセルロース生産能の低下を伴わなかった。セ
ルラーゼ培地で増殖した細胞を遠心分離し、シュラム・
ヘストリン（SH）コントロール培地に加えたが、細胞は
コントロール細胞の場合と全く同様にセルロースを生産
した。細胞増加数を調べるためにプレート希釈を行なっ
た場合、粗面コロニーのみが観察されたが、このことは
100％の細胞がなおセルロースを生産していることを示
している。（粗面コロニーはセルロース生産体であり、
一方多くの場合における平滑コロニーはセルロース合成
能を失ったアセトバクター細胞を表わす）。 例２ 高細胞密度、セルロース、温度及びpH 250mlエルレンマイヤーフラスコ中のシュラム・ヘス
トリン培地100mlサンプルにアセトバクター・キシリヌ
ム細胞1.03×10⁴を接種した。コントロールの場合には
シュラム・ヘストリン培地に接種され、実験の場合には
精製セルラーゼ製剤（ノボ・インダストリA/S）10mg/培
地100ml含有のシュラム・ヘストリン培地が使用され
た。フラスコ内容物が、２つの異なる温度（20℃及び28
℃）かつ２つの異なる開始pH値（pH5.5及び6.0）で増殖
させた。第２表は得られたデータを要約している。 第２表のデータから判明するように、１つのケースで
はセルラーゼ製剤含有SH培地においてコントロール培地
よりも64倍多い細胞が生産された。この大増産はpH6.0
かつ28℃で起きた。低倍率としてはpH5.5かつ28℃で開
始した場合に4.7×のみのセルラーゼ誘導細胞密度増加
を示したが、しかしながらこの場合にあってはコントロ
ール細胞は非常に急速に増殖していた。この目的に最適
の温度は確認できなかったが、しかしながらこれらのデ
ータから、温度の上昇はコントロール対セルラーゼ実験
において細胞数を増加させることが判明する。 例３ セルラーゼ及びインキュベート時間 セルラーゼ存在下で増殖せしめられたアセトバクター
に関して時間経過に伴い生じるものを調べるため、下記
操作を行なった。SHフラスコにアセトバクターを接種し
た。これらフラスコの半分は培地100mlにつきセルラー
ゼ製剤10mgを含有していたが、一方他の半分はSH培地の
みを含有していた。フラスコを48時間にわたり試験し、
細胞濃度及びグルコース濃度を調べた。開始グルコース
濃度は8.6g/Lであった。フラスコに最初に約10,000細胞
／フラスコの非常に低濃度の接種原で接種した。 ＊すべての細胞を28℃で増殖させ、細胞をノボ・イン
ダストリA/Sの精製酵素1320B〔マーチン・シュライン博
士（Dr.Martin Schulein）の好意による〕で接種した。
すべてのフラスコをインキュベート時間中100rpmで回転
振盪した。 第３表から判明するように、96〜144時間目において
細胞数は驚異的に増加し、グルコース濃度はセルラーゼ
製剤存在下で低下したが、一方コントロールにおいては
細胞数の大きな増加はなく、しかも残留グルコース量も
さほど大きく減少しなかった。したがって、セルラーゼ
は細胞数増加に対し大きなインパクトを有していた。 例４ 静置培養によりセルラーゼ存在下で培養されるアセトバ
クターの増殖 ４つのルー（Roux）ボトル内でアセトバクター・キシ
リヌムの同等の接種原を増殖させた。２つのボトルに
は、ノボ・インダストリA/Sの精製1320Bセルラーゼ製剤
10mg/100mlを加え、28℃で２週間増殖させた。２つのコ
ントロールボトルはセルラーゼのない標準SH培地を含有
していた。 セルラーゼ処理細胞は増殖したが、接種後８〜10日目
までは目に見えるほどのセルロースは存在しなかった。
この時期から２週間後までのサンプリング期間中に、濃
薄膜が表面上で生成した。これは光学濃度の点で非常に
均一な薄膜であった。フラスコの底には多数の細胞を観
察することができた。このように、セルラーゼ存在下に
おいて、多数の細胞は静置培養物中で薄膜と分離してい
る。 逆に、コントロールでは典型的な浮遊乳白色薄膜を生
じ、２週間後においてそれから分離した細胞が全く観察
されなかった。 したがって、静置培養の場合にはセルラーゼ製剤の作
用によって異なるタイプの薄膜を生じる、と結論づけら
れる。コントロールとは反対に、この異なる薄膜は増殖
期間中の非常に遅い時期になって生じるのみであった。 例５ アセトバクター・キシリヌムがセルラーゼ含有培地中で
のインキュベート後にもなおセルロール生産について活
性であることの試験 細胞を、１週間にわたりセルラーゼ10mg/100ml含有SH
培地中で増殖（振盪培養、28℃）させた後、無菌的に回
収した。次いでこれらの細胞を標準SH培地に移し、好気
性振盪培養で増殖させた。更に、セルラーゼ増殖培養物
からの上澄を回収し、残留セルラーゼ活性の効果を調べ
るためにアセトバクター細胞で接種した。この実験で用
いられたセルラーゼは、ノボ・インダストリA/Sの精製
セルクラスト1320Bであった。 セルラーゼ存在下で増殖せしめられた細胞は振盪接種
SH培地フラスコ中で数千ものセルロース小球を産生する
ことが観察された。このように、セルラーゼ処理細胞は
無セルラーゼ製剤培地に移された場合にセルロースを十
分に生産することができた。 残留酵素活性を調べるためにアセトバクター細胞が接
種された上澄は不明瞭なセルロース生成物を生産した
が、しかしながらこの生産は新鮮セルラーゼが用いられ
た場合よりも組織化されていた。このことは、一部のセ
ルラーゼ活性が失なわれていたが、それにもかかわらず
一部の活性が残存していることを示していた。 アセトバクターは、１週間セルラーゼ存在下で増殖せ
しめられた後にも、セルロール生産に関し非常に活性が
あるようであった。これに関する別の証拠は関連した細
胞数からも明らかにされたが、それによるとプレート希
釈した場合に液体SH培地に移すとセルロースを十分合成
しうる粗面コロニーを生じた。 セルラーゼ1320B含有SH培地中で増殖しているアセト
バクター培養物は、しかしながら、培養3.5か月後ほど
の遅い時期であってもセルロースを生じなかった。した
がって、セルラーゼ酵素が高濃度（10mg/100ml）である
場合、酵素は長時間にわたりセルロール形成を阻止する
上で有効であった。 例６ セルラーゼ（ノボ・インダストリA/Sの1320B）と併用さ
れる２種の異なる培地の比較 この操作の目的は、セルラーゼが濃度10mg/100mlで培
地に加えられた場合に、シュラム・ヘストリン（SH）以
外の栄養増殖培地が細胞をより多く増殖させうるか否か
について調べることであった。セルラーゼを限外過に
より無菌化し、無菌培地に加えて、セルラーゼ濃度を10
mg/100mlとした。２つの培地、即ちコーンスチープリカ
ー及びシュラム・ヘストリンを用いた。１週間後、細胞
を計測した。 １週間後、シュラム・ヘストリン−セルラーゼ補充培
地はコーンスチープリカー−セルラーゼ補充培地よりも
多く細胞を生産した。上記データは、ある株にとってコ
ーンスチープリカーでの増殖が最適の培地ではないこと
を示した。このデータは、シュラム・ヘスリトン以外の
他の培地を使用することができ、かつそのものは細胞密
度を増加させるセルラーゼ製剤効果を示すことも証明し
た。 例７ セルロース生産微生物の振盪培養におけるセルラーゼの
効果 下記操作では、セルロースに干渉せずに純粋な細胞培
養物を与えるセルラーゼ酵素の下限を調べた。この研究
のために、液体セルクラストを20倍希釈し、この希釈液
を開始貯蔵液として用いた。増殖培地として１％グルコ
ース補充標準シュラム・ヘストリン培地を用い、培養物
を28℃かつ回転振盪速度100rpmで１週間増殖させた。こ
れら操作の結果は第６表に示されている。 細胞生産量の増加が、最高で、セルクラスト20倍希釈
の約0.7mlまで得られる。セルロース球状物質は濃度約
0.5mlで生成し始める。 例８ 低濃度のセルラーゼで増大するセルロース生産 アセトバクター・キシリヌムを濃度0.25mg/100ml培地
の低濃度セルラーゼ（1220B、ノボ・インダストリA/S）
含有培地で増殖させた。28℃で１週間の回転振盪培養
後、セルラーゼ培養下で生産されたセルロース量はコン
トロール（セルラーゼなし）培養時の量よりも約1.5倍
多いことが観察された。結果は第７表に示されている。 低濃度で培地に加えられたセルラーゼは微生物セルロ
ースの収量を高めた。このことは、開始アセトバクター
接種原が非常に低濃度（約10,000細胞／フラスコ）であ
る場合に妥当した。開始接種原の量が多いか又は培養物
が１週間以上増殖せしめられた場合には、コントロール
以上のセルロール生産の増加量はもっと少なくなり、と
きにはコントロールと同等又はそれ以下にさえなってし
まう。かかる領域では更に限定を加えることが必要であ
るが、しかしここまでのところでは、生産されるセルロ
ール量がセルロース加水分解酵素の添加によって調節さ
れうることを証明している。 例９ イン・ビトロセルロース生産のためのプロトコール アセトバクター・キシリヌム種のセルロース生産微生
物〔例えば、米国基準培養寄託機関（American Type Cu
lture Collection）、ロックビル、メリーランド州のAT
CC No.23769〕を、セルロース合成能をもつ細胞成分源
として使用した。微生物サンプルをシュラム・ヘストリ
ン寒天の表面上に接種し、５〜７日間増殖させた。単一
コロニーからの細胞をシュラム・ヘストリン栄養培地20
0ml及びセルクラスト50μｌ含有のフラスコに移した。
接種培地を120rpmにセットしたロータリーシェーカー上
28℃で36時間インキュベートした。細胞を、10層のチー
ズクロス（目のあらい薄地の綿布）に培地を通しかつ1
0,000xgで10分間遠心分離することにより回収した。遠
心分離された細胞を冷TME緩衝薄（50mMトリス−HC1（pH
7.5）、10mM MgCl₂、1mM EDTA）で２回洗浄し、セルク
ラストを除去した。各フラスコからの細胞をTME5mlに再
懸濁し、660nmで光学濃度（OD）を調べた（40μｇ＝0.0
2 OD）。上記操作による細胞収量は、無セルラーゼシュ
ラム・ヘストリン培地の場合より約５倍多く、静置ルー
ボトル培養の場合より約100倍多かった。10,000xgで10
分間再遠心分離後、細胞ペレットを20％ポリエチレング
ルコール含有TME（TME−PEG）に再懸濁した。乾燥細胞
重量1mgにつきTME−PEG約15ml用いて、この細胞懸濁液
を調製した。 細胞懸濁液を16,000psi（1,120kg/cm²）でフレンチ
（French）圧力セル中に徐々に通過させた。得られたホ
モゲネートを４℃ 12,000xgで10分間遠心分離した。こ
うして得られたペレットをTME（最初に用いたTME−PEG
の容量の1/4）に再懸濁した。この再懸濁液を４℃18,00
0xgで20分間遠心分離し、上澄（SF）及びペレットを得
た。ペレットを50mMトリス−HC1（pH7.5）、22mM MgC
l₂、1mMEDTA（Ｓ−TME）（最初に用いたTME−PEGの約1/
16〜約3/32の容量）に再懸濁し、再懸濁ペレット（MF）
を調製した。粗調製物は、最初にSF10ml、10mM GTP1.25
ml、0.1M CaCl₂125μｌ及びTME1.25ml含有混合物を調製
することにより得た。混合物を37℃で２時間しかる後約
100℃で３分間インキュベートした。凝集物質を除去す
るために遠心分離した後、上澄を得（粗Gx）、液体窒素
で凍結し、−20℃で貯蔵した。 ジギトニン可溶性酵素成分を得るために、MF（再懸濁
ペレット）を用いた。MFをＳ−TMEに懸濁し、ジギトニ
ン界面活性剤と混合し、6.25mg/mlの最終タンパク質濃
度及び１％ジギトニンとした。この混合物を４℃で５分
間超音波処理し次いでこの温度で30分間静かに振盪し
た。得た混合物を次いで４℃100,000xgで１時間遠心分
離した。得られた上澄は、セルロースシンターゼ含有の
ジギトニン可溶性調製物（DS）であった。 等量のDS及び粗Gxを混合し、UDP−グルコースを20mM
の濃度まで加えた。この混合物をセルロースのイン・ビ
トロ合成のために30℃でインキュベートした。これら操
作法の更に詳細な説明については、リンら、1985年、サ
イエンス、第230巻、第822−825頁〔Lin et al.（198
5）.Science V230,pp822−825〕を参照のこと。 変更は、本明細書に記載された要素、生物及び操作
法、あるいは本明細書に記載された方法の工程又は工程
順序に関し、特許請求の範囲で規定されるような本発明
の概念及び範囲から逸脱しない限りで、行なうことがで
きる。例えば、アセトバクター・キシリヌムはアセトバ
クター・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianu
s）と改名されていることが明らかにされた〔デレイ、1
984年、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティ
ック・バクテリオロジー、ウィリアムズ及びウィルキン
ス、ボルチモア／ロンドン、第268−274頁参照〕。これ
らの名称は本発明の目的からみて相互に代用可能である
と考えられる。

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．セルラーゼ製剤含有栄養培地を調製し； 上記栄養培地にセルロース生産微生物を接種し； 実質上セルロース薄膜を含まない濃微生物培養物の生産
   を促進させるため、好気性条件下で接種培地をインキュ
   ベートし； セルロース生産微生物用のある量の栄養培地を調製し； 該量の栄養培地に接種するため、上記濃微生物培養物を
   利用し；及び 微生物セルロースの生産を促進させるため、該量の接種
   栄養培地を好気的にインキュベートする； ことからなる微生物セルロースの生産方法。 ２．セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバクテ
   リウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３．セルロース生産微生物がアセトバクター属に属す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．セルロース生産微生物が原核生物である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５．セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリヌ
   ム種に属する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６．セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又は
   ポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼか
   らなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７．セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、トリ
   コデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリポ
   ルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるようなセ
   ルラーゼからなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８．セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラー
   ゼ及びβ−グルコシダーゼからなる、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ９．セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約0.000375単
   位/ml〜セルラーゼ約0.015単位/mlを含有すると更に定
   義される、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０．インキュベートが約20℃〜約40℃の温度で行なわ
   れる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１．栄養培地が約３〜約７のpHを有する、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １２．生産されるすべてのセルロースを実質上加水分解
   するためには不十分であるが、セルロース結晶性を変化
   させかつこれによりセルロース生産速度を高めるために
   は十分な量でセルラーゼ製剤を含有する栄養培地中にお
   いてセルロース生産微生物を培養することからなる、高
   い速度での微生物セルロースの生産方法。 １３．セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバク
   テリウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属す
   る、特許請求の範囲第12項記載の方法。 １４．セルロース生産微生物がアセトバクター属に属す
   る、特許請求の範囲第12項記載の方法。 １５．セルロース生産微生物が原核生物である、特許請
   求の範囲第12項記載の方法。 １６．セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリ
   ヌム種に属する、特許請求の範囲第12項記載の方法。 １７．セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又
   はポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼ
   からなる、特許請求の範囲第12項記載の方法。 １８．セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、ト
   リコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリ
   ポルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるような
   セルラーゼからなる、特許請求の範囲第12項記載の方
   法。 １９．セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラ
   ーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる、特許請求の範囲
   第12項記載の方法。 ２０．セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約0.000375
   単位/ml〜セルラーゼ約0.015単位/mlを含有すると更に
   定義される、特許請求の範囲第12項記載の方法。 ２１．栄養培地が約３〜約７のpHを有する、特許請求の
   範囲第12項記載の方法。 ２２．セルラーゼ製剤含有栄養培地からセルロース生産
   微生物の濃培養物を調製し； 気体透過性物質の壁を有する容器を用意し（該容器は液
   体を収容することができ、しかも上記壁は酸素含有気体
   と接触するように適合された第一側壁及び容器に収容さ
   れた液体と接触するように適合された第二側壁を有す
   る）； 上記容器中にセルロース生産微生物用の栄養培地を収容
   し（上記栄養培地は濃培養物からのセルロース生産微生
   物で接種される）；及び 培地中において微生物セルロースの生産を促進させるた
   め、培地収容容器をインキュベートする； ことからなる微生物セルロース生産方法。 ２３．セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバク
   テリウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属す
   る、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ２４．セルロース生産微生物がアセトバクター属に属す
   る、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ２５．セルロース生産微生物が原核生物である、特許請
   求の範囲第22項記載の方法。 ２６．セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリ
   ヌム種に属する、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ２７．セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又
   はポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼ
   からなる、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ２８．セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、ト
   リコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリ
   ポルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるような
   セルラーゼからなる、特許請求の範囲第22項記載の方
   法。 ２９．セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラ
   ーゼ及びβ−グリコシダーゼからなる、特許請求の範囲
   第22項記載の方法。 ３０．セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約0.000375
   単位/ml〜セルラーゼ約0.015単位/mlを含有すると更に
   定義される、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ３１．インキュベートが約20℃〜約40℃の温度で行なわ
   れる、特許請求の範囲第22項記載の方法。 ３２．栄養培地が約３〜約７のpHを有する、特許請求の
   範囲第22項記載の方法。 ３３．セルラーゼ製剤含有栄養培地中で増殖せしめられ
   るセルロース生産微生物の接種原を調製し； セルロース生産微生物用の栄養培地に接種原を移し；及
   び 酸素存在下でかつ実質上0.5ガウス以上の磁場の影響下
   で接種培地をインキュベートする； ことからなる非晶質セルロース生産方法。 ３４．セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバク
   テリウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属す
   る、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ３５．セルロース生産微生物がアセトバクター属に属す
   る、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ３６．セルロース生産微生物が原核生物である、特許請
   求の範囲第33項記載の方法。 ３７．セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリ
   ヌム種に属する、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ３８．セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又
   はポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼ
   からなる、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ３９．セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、ト
   リコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリ
   ポルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるような
   セルラーゼからなる、特許請求の範囲第33項記載の方
   法。 ４０．セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラ
   ーゼ及びβ−グルコシダーゼからなる、特許請求の範囲
   第33項記載の方法。 ４１．セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約0.000375
   単位/ml〜セルラーゼ約0.015単位/mlを含有すると更に
   定義される、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ４２．インキュベートが約20℃〜約40℃の温度で行なわ
   れる、特許請求の範囲第33項記載の方法。 ４３．栄養培地が約３〜約７のpHを有する、特許請求の
   範囲第33項記載の方法。 ４４．セルロース生産微生物用の栄養培地を調製し（培
   地は、そこで培養されるセルロース生産微生物から生産
   されるセルロースを加水分解するためには十分な量のセ
   ルラーゼ製剤を含有している）； 上記栄養培地にセルロース生産微生物を接種し； セルロース生産微生物の濃培養物を生産させるために、
   好気性条件下で接種培地をインキュベートし； 濃培養物からセルロース生産微生物を採取し； 採取された微生物を処理して活性酵素成分及び生物学的
   活性を保持している上澄を生産させ、；及び 微生物セルロースのイン・ビトロ合成を促進させるため
   に、UDP−グルコース含有溶液中で上記上澄及び酵素成
   分を混合する； ことからなる、セルロース生産微生物の成分による微生
   物セルロースのイン・ビトロ合成方法。 ４５．セルロース生産微生物がリゾビウム、アグロバク
   テリウム、シュードモナス又はアルカリゲネス属に属す
   る、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ４６．セルロース生産微生物がアセトバクター属に属す
   る、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ４７．セルロース生産微生物が原核生物である、特許請
   求の範囲第44項記載の方法。 ４８．セルロース生産微生物がアセトバクター・キシリ
   ヌム種に属する、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ４９．セルラーゼ製剤がミロセシウム、トリコデルマ又
   はポリポルス属の生物から生産されるようなセルラーゼ
   からなる、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ５０．セルラーゼ製剤がミロセシウム・ベルカリア、ト
   リコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・レエセイ又はポリ
   ポルス・ベルシコロル種の微生物から生産されるような
   セルラーゼからなる、特許請求の範囲第44項記載の方
   法。 ５１．セルラーゼ製剤がセルラーゼ、セロビオヒドロラ
   ーゼ及びβ−グリコシダーゼからなる、特許請求の範囲
   第44項記載の方法。 ５２．セルラーゼ製剤含有培地がセルラーゼ約0.000375
   単位/ml〜セルラーゼ約0.015単位/mlを含有すると更に
   定義される、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ５３．インキュベートが約20℃〜約40℃の温度で行なわ
   れる、特許請求の範囲第44項記載の方法。 ５４．栄養培地が約３〜約７のpHを有する、特許請求の
   範囲第44項記載の方法。