CN115029318A

CN115029318A - 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途

Info

Publication number: CN115029318A
Application number: CN202210518596.9A
Authority: CN
Inventors: 余亚杰; 窦欣童
Original assignee: Guangzhou Mingzheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Fuzhisaile Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN115029318B

Abstract

本申请提供了一种携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途，这种多特异性抗体采用单域抗体结构，可减小抗体分子质量，便于药物递送和体内吸收，还可以降低载体构建和表达难度；靶向EGFR抗体结构域和靶向CD3的抗体结构域采用2:1比例设置，提高针对肿瘤细胞表面EGFR抗原的靶向识别能力，且能够防止所述抗体聚集于非特异性部位；在抗体中设置共刺激因子结构域，可通过CD3和共刺激因子实现双途径激活T细胞，提高抗肿瘤疗效；以MSC为携带载体，可在体内有效突破血脑屏障，到达病灶部位，发挥抗肿瘤效果，且该MSC中还携带了PEDF基因，有利于进一步强化抗肿瘤作用；还能够促进IFN‑γ表达，而IL‑6表达水平没有显著变化，从而抑制免疫因子的过度分泌，为神经***肿瘤药物的开发提供了基础。

Description

携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途

技术领域：

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途。

背景技术：

癌症是继心血管疾病和传染病之后的人类第三大死因，在发达国家中四分之一的死亡是由癌症引起的。尽管科研人员数十年坚持不懈的研究极大地促进了对癌症生物学、基因组学、蛋白质组学和前瞻性治疗的深刻理解，取得了许多积极的成果，但即使在现代癌症仍然是致命的，2020年有1700万新病例和950万例死亡，到2040年全球预计新癌症病例将上升至惊人的2750万，这凸显了开发新型癌症诊断和治疗手段的紧迫性和必要性。目前癌症的治疗手段以手术、放疗和化疗为主，但传统治疗方式由于以下原因而受到限制：(1)无法跨越生物屏障，(2)非特异性副作用，(3)对转移性肿瘤的影响很小，(4)缺乏有效的诊断/治疗检查程序。

在众多肿瘤中,胶质瘤是成人中最常见的侵袭性原发性中枢神经***肿瘤，它在全世界造成严重的经济负担。恶性胶质瘤的标准治疗手段是手术切除和术后放疗，然后与替莫唑胺联合辅助化疗，由于恶性胶质瘤的侵袭性生长特征，导致很少能实现完全切除。目前治疗恶性胶质瘤的手段有所发展，例如在手术中使用荧光引导技术，如5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，可以提高切除比例，但不能提高恶性胶质瘤患者的总体生存率；自1950年代以来，医生已开始对颅内肿瘤患者进行放射治疗，但该技术发展缓慢；替莫唑胺是恶性胶质瘤患者最常见和最有效的化疗药物，但结果取决于6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)的启动子甲基化状态。此外，恶性胶质瘤的复杂特征导致预后不良，预后最差的胶质母细胞瘤中位生存率仅为14.6个月(参见

RP,Zong H.Inflammation and gliomagenesis:bidirectional communication at early and late stages of tumorprogression.Curr Pathobiol Rep.2013；1(1):19-28.)。近年来，随着对胶质瘤生物学特征认识的深入，越来越多的精准靶向治疗产生，包括单克隆抗体、多特异性抗体、siRNA、嵌合抗原受体T细胞等等。

在恶性胶质瘤治疗中遭遇的困难主要来自两方面，一是恶性胶质瘤多发于神经***中，根据病理又可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶母细胞瘤等，由于血脑屏障的存在，使得常规药物难以达到病灶部位，导致疗效不佳；二是神经胶质瘤的免疫微环境复杂，神经胶质瘤将免疫抑制和支持肿瘤的可溶性因子释放到微环境中，导致癌症加速增殖、侵袭和免疫逃逸。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，包括自我更新能力和多向分化能力。间充质干细胞临床上被应用于解决多种血液***疾病、心血管疾病、肝硬化、神经***疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等方面。截止目前，美国FDA已批准了近60项有关MSC的临床试验，主要包括：(1)造血干细胞移植，增强造血功能，促使造血干细胞移植物的植入，治疗移植物抗宿主病；(2)组织损伤的修复，如骨、软骨、关节损伤、心脏损伤，肝脏损伤，脊髓损伤和神经***疾病；(3)自身免疫性疾病，如***性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等；(4)作为基因治疗的载体。间充质干细胞被广泛认为是低免疫原性的，使其能够跨越主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)屏障。虽然MSC不是免疫豁免的，但它被认为具有免疫规避性，并且在很大程度上未被免疫***检测到，MSC具有远距离迁移、穿越血脑屏障和与周围免疫细胞交流的先天能力，所有这些都使它们成为脑癌治疗的理想“特洛伊木马”。对此，已有大量研究成果被报道，例如MSC携带免疫因子基因、溶瘤病毒、***基因等不同效应因子治疗脑部肿瘤。

色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor，PEDF)是有效的抗肿瘤效应因子之一，它是一种50kDa分泌的糖蛋白，可激活Fas/FasL通路以诱导内皮细胞死亡并调节诱导剂和血管生成抑制剂之间的平衡，PEDF在神经胶质瘤的血管生成和肿瘤发生中起重要作用，有研究证明表达PEDF的MSCs可有效诱导肿瘤细胞凋亡并抑制血管生成，从而减少肿瘤体积并延长胶质瘤小鼠的生存期。然而，PEDF导致胶质瘤细胞凋亡和抗血管生成的分子机制尚不完全清楚，有研究人员发现来自磷酸酶和张力蛋白同源物mRNA工程化的MSCs的条件培养基在体外通过PI3K-AKT-mTOR通路诱导U251细胞死亡。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb，简称双抗)是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，双抗的概念于上世纪60年代提出，但由于受到生物工程技术和基因技术的限制，直到近十年才取得了突破性进步，2009年欧洲医药管理局批准了靶向EpCAM和CD3的双抗catumaxomab用于恶性腹水治疗，成为首个被批准的双抗药物；2014年，美国食品药物管理局批准靶向CD19和CD3的双抗blinatumomab，用于治疗急性淋巴白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中最常见的费城染色体阴性的复发或难治的前体B细胞急性淋巴细胞白血病(precursor B-cell lymphoblasticleukemia，BCP-ALL)，随后进一步拓展为包括费城染色体阳性的复发或难治的BCP-ALL。值得注意的是，除具有轻链和重链结构的传统抗体外，双特异性纳米抗体(bispecificnanobody，BsNb)也被开发出来，这种双抗具有更强的特异性、靶向性和更低的脱靶毒性的特点，并且与靶标抗原的结合力得到增强和血清半衰期也得到延长，使得其在感染、肿瘤及免疫领域诊断与治疗中已成为研究热点。为了进一步改善抗体的治疗效果，研究人员在双特异性抗体的基础上，又提出了多特异性抗体(multispecific antibody，MsAb)的概念，是指一个抗体分子可以与两个以上不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，是其靶向性得到强化。

T细胞表面的白细胞分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)可介导T细胞活化和募集T细胞至肿瘤靶标细胞周围，这使得CD3双特异性抗体(CD3-BsAbs)成为癌症免疫治疗领域中一种新兴的治疗方式。CD3-BsAbs通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞上的CD3发挥作用，CD3-BsAbs将这两种细胞类型交联允许形成免疫突触，类似于天然T细胞受体(TCR)/肽-主要组织相容性复合物(MHC)复合物，这种突触既能够特异性结合肿瘤靶细胞，又能够有效诱导T细胞活化，从而导致炎症细胞因子和溶细胞分子的分泌，这些分子能够在此过程中杀死肿瘤细胞，从而发挥多重抗肿瘤作用。CD3-BsAb疗法是一种被动形式的免疫疗法，与表达嵌合抗原受体转基因的T细胞的过继细胞治疗具有类似的亲缘关系，CAR由直接连接到细胞内CD3ζ链的TAA结合域和来自共刺激受体(例如4-1BB)组成，从而在抗原识别时激活T细胞。CD3-BsAbs和CAR T细胞在许多方面都相似：两者都针对表面TAA，都利用T细胞效应功能，并且都成功地用于临床治疗血液***恶性肿瘤，并显示出相似类型的毒性特征。但与CD3-BsAbs相比，目前临床批准的CAR-T细胞的一些缺点是：(1)患者需要在输注CAR-T细胞之前进行淋巴清扫，(2)必须为每个患者单独生产CAR-T细胞，而CD3-BsAbs可以作为现成的可大规模生产的治疗药物，(3)CAR-T细胞在肿瘤被清除后留在患者体内，导致在靶向CD19的CAR-T细胞存在情况下持续B细胞耗竭，而CD3-BsAbs随着时间的推移从血液中清除。由此可见CD3-BsAb相比于CAR-T细胞具有更多的临床使用优势。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，也称为HER1或ErbB1，是由HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)组成的ErbB家族成员。EFGR是一个170kDa的跨膜受体，包含3个结构域，包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中胞外区可以识别并结合相应的配体，胞内区具有酪氨酸激酶活性，一旦被激活EGFR与其他ErbB家族成员形成同源二聚体或异源二聚体，然后磷酸化酪氨酸激酶，并激活下游信号通路，如RAS-RAF-MEK-ERK、JAK-STAT和PI3K-AKT-mTOR，这些信号最终导致肿瘤发展和进展。因此，EGFR成为肿瘤治疗中一个很有前景的靶点，研究人员开发出来多种靶向EGFR的抗体药物用于治疗实体肿瘤，包括：(1)西妥昔单抗，于2004年被FDA批准用于治疗EGFR阳性的晚期结肠癌，是第一个经FDA批准的EGFR单抗药物，它是一种人/鼠嵌合IgG1单克隆抗体，能够以高亲和力与内源性配体竞争结合EGFR胞外域，还可诱导产生ADCC作用杀伤肿瘤细胞；(2)帕尼单抗，是第一个完全人源化IgG2单克隆抗体，作用机制与西妥昔单抗相似，2006年9月被FDA批准用于治疗化疗失败后转移性结直肠癌，2007年12月获EMEA批准用于治疗K-ras野生型结直肠癌；(3)尼妥珠单抗，是我国批准引进的第一个用于治疗恶性肿瘤的EGFR单抗药物，2008年，CFDA批准其用于与放疗或化疗联合治疗EGFR表达阳性的Ⅲ/IV期鼻咽癌；(4)加西他布单抗，是第二代重组人IgG1 EGFR抗体，于2015年被FDA批准用于联合吉西他滨、顺铂一线治疗转移性鳞状非小细胞肺癌。尽管靶向EGFR和CD3的双特异性抗体已被报道，如WO2021104430A1、CN111848806A、CN113874396A等，但是仍面临对实体肿瘤的靶向性不足，肿瘤杀伤活性有待提高等问题，尤其是在脑部肿瘤的治疗中，如何有效突破血脑屏障和肿瘤免疫环境的抑制作用，日益成为脑部肿瘤研究中的热点问题。

本申请提供了一种携带靶向EGFR和CD3多特异性抗体基因的间充质干细胞，这种多特异性抗体采用单域抗体结构，可减小抗体分子质量，便于药物递送和体内吸收，还可以降低载体构建和表达难度；靶向EGFR抗体结构域和靶向CD3的抗体结构域采用2:1比例设置，提高针对肿瘤细胞表面EGFR抗原的靶向识别能力，且能够防止所述抗体聚集于非特异性部位；在抗体中设置共刺激因子结构域，可通过CD3和共刺激因子实现双途径激活T细胞，提高抗肿瘤疗效；以MSC为携带载体，可在体内有效突破血脑屏障，到达病灶部位，发挥抗肿瘤效果，且该MSC中还携带了PEDF基因，有利于进一步强化抗肿瘤作用，从而为新型抗肿瘤药物的开发奠定了基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明中提供了一种间充质干细胞，其特征在于携带有多特异性抗体基因，所述多特异性抗体包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；所述第一抗原和第三抗原均为EGFR，第一抗原结合域和第三抗原结合域分别包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述第二抗原为CD3，包括如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6；所述第二抗原结合域连接有共刺激因子，所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

现有技术中提出了多种CD3-BsAb，但多是用于治疗白血病、淋巴瘤等血液肿瘤，并且取得了令人满意的疗效，但如前所述，却在实体肿瘤的治疗中遭遇了困难，尤其是在脑部肿瘤的治疗中，受到血脑屏障和复杂肿瘤微环境的影响，普通药物疗效大大降低。本发明中选择EGFR靶点与CD3靶点配合，该抗体具有全新的CDR区，其中靶向EGFR的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域选择使用具有中等较强亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、***等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；在多特异性抗体结构中引入了4-1BB共刺激因子，使得能够通过CD3和4-1BB双信号通路激活效应细胞，发挥更大的抗肿瘤效果；靶向EGFR抗体结构域和靶向CD3的抗体结构域采用2:1比例设置，提高针对肿瘤细胞表面EGFR抗原的靶向识别能力；以间充质干细胞为药物递送载体，能够顺利突破血脑屏障而富集于肿瘤病灶部位，并引入PEDF因子，进一步强化了抗肿瘤效果；此外，本发明中所述细胞还能够防止治疗过程中免疫因子的过度分泌，有助于降低毒副作用。

进一步的，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:7所示的单域可变区。

进一步的，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:8所示的单域可变区。

进一步的，所述共刺激因子是4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

进一步的，所述多特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

进一步的，所述间充质干细胞还携带有PEDF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示

进一步的，所述的间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞。

间充质干细胞包括多种来源，如脐带、脐带血、骨髓等，其中华通胶间充质干细胞为近年来新提出的MSC来源类型，在细胞分化能力、细胞因子表达能力和代谢调解能力上具有显著优势，因此本申请中选用华通胶间充质干细胞为基础进行基因改造和修饰，以便能够活性较高的药物传递能力和用药安全性。

提供了一种药物组合物，其包含本发明所提供的间充质干细胞。

提供了一种本发明中所述的间充质干细胞或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤选自神经胶质瘤、脑癌。

EGFR是一种在恶性肿瘤中广泛表达的靶点，在多种实体肿瘤中广有表达，因此本发明所提供的间充质干细胞可用于肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、尿路上皮癌、***癌、咽癌、直肠癌、肾细胞癌、小肠癌、食管癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、***区癌、腹膜癌、胃癌、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、外阴癌、***癌、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤、***、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌***癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、神经内分泌瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌等实体肿瘤的治疗；优选用于神经胶质瘤、脑癌。

有益效果

本申请提供了一种携带靶向EGFR和CD3多特异性抗体基因的间充质干细胞，在多个方面具有技术优势，包括：

(1)所述多特异性抗体采用单域抗体结构，可减小抗体分子质量，便于药物递送和体内吸收，还可以降低载体构建和基因表达难度；

(2)靶向EGFR抗体结构域和靶向CD3的抗体结构域采用2:1比例设置，提高针对肿瘤细胞表面EGFR抗原的靶向识别能力，且能够防止所述抗体聚集于非特异性部位；

(3)在抗体中设置共刺激因子结构域，可通过CD3和共刺激因子实现双途径激活T细胞，提高抗肿瘤疗效；

(4)以MSC为药物递送载体，可在体内有效突破血脑屏障到达病灶部位，还能够利用MSC干细胞本身的生理特性，使其聚集与肿瘤部位，发挥靶向抗肿瘤效果，并且该MSC中还携带了PEDF基因，有利于进一步强化抗肿瘤作用；

(5)可调节免疫因子分泌，使得IFN-γ表达升高，而IL-6表达水平没有显著变化，抑制免疫因子的过度分泌。

附图说明

图1：多特异性抗体结构示意图；

图2：体外神经胶质瘤细胞的杀伤作用；

图3：体内神经胶质瘤动物模型的平均生存期；

图4：IFN-γ表达水平变化图；

图5：IL-6表达水平变化图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1多特异性抗体的设计和获得

在前期的研究中，发明人开发并获得了靶向EGFR和CD3的多特异性抗体。目前常规的靶向CD3靶点的双特异性抗体，通常仅包括一个靶向肿瘤细胞的抗原结合域和靶向T细胞的CD3抗原结合域，即“1+1”式结构，这种方式容易造成对实体肿瘤的亲和力不强，产生非特异性结合而导致副反应，也可能因肿瘤细胞变异导致其EGFR表面抗原数量减少，而难以发挥可预期的抗肿瘤效果。相比于常规包括CD3靶点的双特异性抗体，本发明人提出了“2+1”式的多特异性抗体，这种结构中包括2个靶向肿瘤细胞表面抗原的抗原结合域和1个靶向T细胞的CD3抗原结合域，并且上述抗原结合域为单域抗体结构，能够提高对实体肿瘤细胞的识别能力，还降低了分子生物学上的操作难度和载体负载难度，便于药物的有效递送。此外，在抗原结合域亲和力的选择方法，靶向EGFR的抗原结合域选用具有高亲和力的结合域，而靶向CD3的抗原结合域选用具有中高亲和力的结合域，使得该多特异性抗体能够有效识别靶细胞，同时又可避免在非肿瘤病灶部位的过度集聚。

如图1所示，所述多特异性抗体EGFR-CD3-EGFR MsAb，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；所述第一抗原和第三抗原均为EGFR，第一抗原结合域和第三抗原结合域分别包括如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述第二抗原为CD3，包括如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6。第一抗原结合域和第三抗原结合域包括如SEQ ID NO:7所示的单域可变区，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:8所示的单域可变区。进一步的，为了改善提升效益细胞质量，借鉴CART细胞中引入共刺激因子的作法，在多特异性抗体中中引入4-1BB共刺激因子，以便提升实体肿瘤中T细胞的激活程度，所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。所述多特异性抗体的核苷酸序列如SEQID NO:10所示。

将编码EGFR-CD3-EGFR MsAb的DNA序列导入pcDNA3.3表达载体中，将上述表达载体电转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，转化后涂布于含有抗生素的LB平板上，37℃下在培养过夜，筛选阳性克隆。提取质粒，测序显示所述双特异性抗体序列正确。

使用Expi293表达***试剂盒(购自ThermoFisher公司)将表达质粒共转染入Expi293细胞，转染后5天，收集上清液，通过镍柱亲和层析法纯化抗体，分别获得EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体。通过HPLC-SEC检测抗体纯度，EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体纯度为95.8％。

实施例2脐带间充质干细胞的制备

取人脐带组织，用无菌生理盐水清洗3次，去除附着血液及杂物，分离并弃去动静脉血管，使用无菌手术剪将脐带组织剪成约5cm×2cm的小块；将脐带表面羊膜撕开，取出全部华通氏胶，使用生理盐水清洗3遍后，将华通氏胶剪成大小约1cm×1cm的小块组织，置于DMEM完全培养基中(含10％FBS和10ng/mL bFGF)，37℃、5％CO₂培养；每天更换培养基，并观测细胞生长情况，待细胞融合度达到80％左右后，进行传代扩增培养；收获细胞，并保存于-80℃冰箱中。

实施例3脐带间充质干细胞的基因改造

根据生物信息学检索结果，获得PEDF基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:11所示。将该核苷酸序列***到pLent-EF1α表达载体(购自Vigene公司)中，进而构建携带PEDF基因的慢病毒载体。复苏实施例2中制备的MSC细胞，以以5×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，37℃、5％CO₂孵育过夜后，加入5×10⁶cfu/孔的慢病毒，37℃、5％CO₂孵育48h后，收获细胞，经ELISA鉴定经转染后的PEDF-MSC细胞能够稳定表达PEDF因子。

基于类似方法，构建携带EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体核苷酸的慢病毒载体，然后转染PEDF-MSC细胞，获得可以表达所述多特异性抗体的MsAb-PEDF-MSC细胞，经鉴定该细胞能够稳定表达EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体。

实施例4体外抗肿瘤实验

4.1效益细胞分离和培养

采用Ficoll密度梯度离心法分离人PBMC细胞：抽取新鲜人外周血10mL与10mL的无血清RPMI1640培养基混合，缓慢加到10mL密度梯度离心液Ficoll上层；室温下，12000rpm离心10min；取出离心管，弃去上层血浆，再小心吸取血浆与Ficoll中间的白层PBMC，放置于50mL离心管中；加入15mL无血清RPMI1640培养基，重悬后3000rpm离心10min，重复操作2次；加入15mL含10％血清的RPMI1640培养基，于37℃5％CO₂条件下培养。

4.2肿瘤细胞培养

本发明中选用人神经胶质瘤细胞系U87作为实验对象，考察细胞水平上的抗肿瘤作用。复苏U87细胞，接种于含10％血清的DMEM完全培养基中，于37℃、5％CO₂条件下培养细胞至对数生长期；使用携带有绿色荧光蛋白GFP基因的慢病毒载体转染上述肿瘤细胞，便于后续观测和实验。

4.3体外抗肿瘤实验

效应细胞与靶细胞按5:1比例接种于96孔板中，并分别加入50ng/mL的EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体、与靶细胞比例为1:1的PEDF-MSC细胞、与靶细胞比例为1:1的MsAb-PEDF-MSC细胞和无菌生理盐水(对照组)，以无菌培养基作为对照，37℃培养24h后，每孔加入2μl7-AAD，37℃孵育1h后，利用Perkin Elmer Operetta高内涵成像仪进行拍照，检测各组细胞活的细胞数；计算细胞杀伤百分比，浓度杀伤百分比＝(空白组活的细胞数-各浓度抗体组活的细胞数)/空白组活的细胞数。

如图2所示，本发明中所提供的多特异性抗体或MSC细胞可在体外有效杀死肿瘤细胞，其中EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体的杀伤效率最高，细胞杀伤率可超过80％，相比之下MSC细胞的杀伤能力较低，虽然MsAb-PEDF-MSC细胞中携带了EGFR-CD3-EGFR MsAb抗体基因，但是在体内实验中却没有表现出预想的强抗肿瘤活性。这可能是由于在体外实验中，不存在体内复杂的肿瘤微环境，多特异性抗体受到的免疫抑制较小，且不存在血脑屏障的阻碍，使得其能够直接接触肿瘤细胞而发挥更强的肿瘤杀伤作用，此外本发明中的多特异性抗体中靶向EGFR和CD3的抗原结合域采用2:1的特色设计，并添加了4-1BB共刺激因子，使得体外抗肿瘤活性得到巩固和强化；而MSC细胞则受到抗肿瘤基因的表达效率或胞内其他调控机制的影响，抗肿瘤作用稍低。

实施例5体内抗肿瘤实验

5.1裸鼠脑部肿瘤模型

选取雌性BALB/c裸鼠，室温26-28℃，空气湿度40％-60％，饲养1周以实验适应环境。培养U87胶质瘤细胞至对数生长期(方法同4.2节)，使用无菌PBS调整细胞密度至2×10⁵/μL单细胞，麻醉裸鼠并将其固定于操作台上，用微量注射器脑内注射入U87细胞5μL(细胞数1×10⁶个)，造模一周后经活体成像仪检测，证明造模成功。

将实验动物随机分为4组，BsAb抗体组，每3天尾静脉注射5mg/kg EGFR-CD3-EGFRMsAb抗体；PEDF-MSC组，每周注射1×10⁶个PEDF-MSC细胞；MsAb-PEDF-MSC组，每周注射1×10⁶个MsAb-PEDF-MSC细胞；对照组，每3天尾静脉注射0.5mL无菌生理盐水。

5.2平均生存期观测

每日观测实验动物的生存情况，记录并计算各组模型动物的平均生存时间，结果如图3所示，EGFR-CD3-EGFR MsAb多特异性抗体在体内实验的抗肿瘤效果不佳，与体外实验中可强烈抑制神经胶质瘤生长不同，在体内实验中几乎难以展现出预想的抗肿瘤效果，这表明抗体在体内难以有效通过血脑屏障达到肿瘤病灶部位有关；与之相反的是，使用MSC细胞在体内实验中却展现出了较强的肿瘤抑制作用，相关治疗组中模型动物的生存期得到延长，尤其是在MsAb-PEDF-MSC组中，其动物生存期相比于对照组延长了近1倍，这说明该MSC细胞能够穿过血脑屏障达到肿瘤病灶部位，通过表达PEDF因子和本发明所提供的多特异性抗体发挥联合抗肿瘤作用，调动体液免疫机制和细胞免疫机制发挥协同抗肿瘤作用。

5.3血清中免疫因子浓度检测

给药3周后，取裸鼠血浆3000r/min离心15min，取上层血清，采用ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司公司)，按照说明书所述步骤分别测量血清中IFN-γ和IL-6的含量。

如图4所示，在MSC治疗后模型动物体内IFN-γ的表达显著提高，而IFN-γ被认为是一种具有广泛作用的抗肿瘤因子，它既可以通过激活TNF-α、IL-2等免疫因子，还能够促进NKL细胞活性、抗原呈递和提高巨噬细胞溶酶体活性，发挥抗肿瘤作用，本发明中使用经过基因修饰的MSC细胞能够大幅度提高体内IFN-γ表达水平，尤其在MsAb-PEDF-MSC组这一趋势更加明显。

如图5所示，IL-6也是一种具有复杂调控机制的免疫因子，在肿瘤发展的不同时间IL-6展现了不同的作用，此外它还是免疫因子风暴中的主要效应因子，如果表达水平过高，可引起发热、晕厥甚至死亡等严重不良反应，本发明所提供的抗体或MSC细胞对于IL-6的表达无明显影响，说明这种疗法具有安全性方面的保障，免疫因子风暴的发生机制受到抑制。

虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。

序列表

<110> 广州明征生物科技有限公司

<120> 携带多特异性抗体基因的间充质干细胞及其制药用途

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Met Ser Thr Gly Met

1 5

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Lys Ala Pro Trp Pro Gly Thr Ala Pro Ser Ser Trp

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gly Leu Leu Glu Trp Glu Leu Leu Val Val Ala Ala Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Thr Glu Asp Asp Trp Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Ile Thr Gly Leu Ser Thr Lys Ile

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Glu His Ala Ser Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Met Ser Thr Gly Met Trp His Arg Pro Thr Pro

20 25 30

Gly Arg Glu Arg Glu Leu Ile Ala Leu Lys Ala Pro Trp Pro Gly Thr

35 40 45

Ala Pro Ser Ser Trp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ser Asn

50 55 60

Thr Val Tyr Leu Gln Met Ala Asn Leu Asn Thr Glu Asp Thr Ala Val

65 70 75 80

Tyr Phe Cys His Ala Gly Gly Leu Leu Glu Trp Glu Leu Leu Val Val

85 90 95

Ala Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Ser Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Pro Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Asn Ile Phe Ser Arg Thr

20 25 30

Glu Asp Asp Trp Ile Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Ala

35 40 45

Phe Val Ala Trp Ile Thr Gly Leu Ser Thr Lys Ile Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Gly Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ala

65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Ala Asn Ala Ala Glu His

85 90 95

Ala Ser Lys Val Val Glu Val Ser Thr Ser Trp Gly Gln Gly Thr Val

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaagcggcg gcggcctgac ccagccgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgcggcgagc 60

ggcatgagca ccggcatgtg gcatcgcccg accccgggcc gcgaacgcga actgattgcg 120

ctgaaagcgc cgtggccggg caccgcgccg agcagctggc gctttaccat tagccgcgat 180

aacgcgagca acaccgtgta tctgcagatg gcgaacctga acaccgaaga taccgcggtg 240

tatttttgcc atgcgggcgg cctgctggaa tgggaactgc tggtggtggc ggcgagctgg 300

ggccagggca ccgtgagcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 360

ggcagccagg tgaaactgga agaaagcggc agcgaactgg tgcagccggg cggcccgctg 420

cgcctgagct gcgcggcgag cgcgaacatt tttagccgca ccgaagatga ttggatttgg 480

tatcgccagg cgccgggcaa acagcgcgcg tttgtggcgt ggattaccgg cctgagcacc 540

aaaattggcc gctttaccat tagcgtggat aaaagcaaag gcaccattta tctgcagatg 600

aacgcgctga aaccggaaga taccgcggtg tattatgcga acgcggcgga acatgcgagc 660

aaagtggtgg aagtgagcac cagctggggc cagggcaccg tggtgaccgt gagcagcggc 720

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcaaacgcgg ccgcaaaaaa 780

ctgctgtata tttttaaaca gccgtttatg cgcccggtgc agaccaccca ggaagaagat 840

ggctgcagct gccgctttcc ggaagaagaa gaaggcggct gcgaactggg cggcggcggc 900

agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcgaaagcg gcggcggcct gacccagccg 960

ggcggcagcc tgcgcctgag ctgcgcggcg agcggcatga gcaccggcat gtggcatcgc 1020

ccgaccccgg gccgcgaacg cgaactgatt gcgctgaaag cgccgtggcc gggcaccgcg 1080

ccgagcagct ggcgctttac cattagccgc gataacgcga gcaacaccgt gtatctgcag 1140

atggcgaacc tgaacaccga agataccgcg gtgtattttt gccatgcggg cggcctgctg 1200

gaatgggaac tgctggtggt ggcggcgagc tggggccagg gcaccgtgag cagc 1254

<210> 11

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgcaggcgc tggtgctgct gctgtgcatt ggcgcgctgc tgggccatag cagctgccag 60

aacccggcga gcccgccgga agaaggcagc ccggatccgg atagcaccgg cgcgctggtg 120

gaagaagaag atccgttttt taaagtgccg gtgaacaaac tggcggcggc ggtgagcaac 180

tttggctatg atctgtatcg cgtgcgcagc agcaccagcc cgaccaccaa cgtgctgctg 240

agcccgctga gcgtggcgac cgcgctgagc gcgctgagcc tgggcgcgga acagcgcacc 300

gaaagcatta ttcatcgcgc gctgtattat gatctgatta gcagcccgga tattcatggc 360

acctataaag aactgctgga taccgtgacc gcgccgcaga aaaacctgaa aagcgcgagc 420

cgcattgtgt ttgaaaaaaa actgcgcatt aaaagcagct ttgtggcgcc gctggaaaaa 480

agctatggca cccgcccgcg cgtgctgacc ggcaacccgc gcctggatct gcaggaaatt 540

aacaactggg tgcaggcgca gatgaaaggc aaactggcgc gcagcaccaa agaaattccg 600

gatgaaatta gcattctgct gctgggcgtg gcgcatttta aaggccagtg ggtgaccaaa 660

tttgatagcc gcaaaaccag cctggaagat ttttatctgg atgaagaacg caccgtgcgc 720

gtgccgatga tgagcgatcc gaaagcggtg ctgcgctatg gcctggatag cgatctgagc 780

tgcaaaattg cgcagctgcc gctgaccggc agcatgagca ttattttttt tctgccgctg 840

aaagtgaccc agaacctgac cctgattgaa gaaagcctga ccagcgaatt tattcatgat 900

attgatcgcg aactgaaaac cgtgcaggcg gtgctgaccg tgccgaaact gaaactgagc 960

tatgaaggcg aagtgaccaa aagcctgcag gaaatgaaac tgcagagcct gtttgatagc 1020

ccggatttta gcaaaattac cggcaaaccg attaaactga cccaggtgga acatcgcgcg 1080

ggctttgaat ggaacgaaga tggcgcgggc accaccccga gcccgggcct gcagccggcg 1140

catctgacct ttccgctgga ttatcatctg aaccagccgt ttatttttgt gctgcgcgat 1200

accgataccg gcgcgctgct gtttattggc aaaattctgg atccgcgcgg cccg 1254

Claims

1.一种间充质干细胞，其特征在于所述间充质干细胞携带有多特异性抗体基因，所述多特异性抗体包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合域和特异性结合第三抗原的第三抗原结合域，所述抗原结合域具有单域抗体结构；所述第一抗原和第三抗原均为EGFR，第一抗原结合域和第三抗原结合域分别包括如SEQ IDNO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述第二抗原为CD3，包括如SEQ ID NO:4所示的CDR4，如SEQ ID NO:5所示的CDR5，如SEQ ID NO:6所示的CDR6；所述第二抗原结合域连接有共刺激因子，所述共刺激因子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞，第一抗原结合域和第三抗原结合域包括如SEQID NO:7所示的单域可变区。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:8所示的单域可变区。

4.如权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述共刺激因子是4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

5.如权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述多特异性抗体的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。

6.如权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞还携带有PEDF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

7.如权利要求1-6任一项中所述的间充质干细胞为脐带华通胶间充质干细胞。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的间充质干细胞。

9.权利要求1至7中任一项所述的间充质干细胞或权利要求8中所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，所述肿瘤选自神经胶质瘤、脑癌。