CN104774268A - 一种双特异性抗体egfr×cd3的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元针对肿瘤细胞表面抗原EGFR具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法以及这些抗体的药学用途。

Description

一种双特异性抗体EGFR×CD3的构建及应用

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程 早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.EGFR

表皮生长因子受体(EGFR，Epidermal Growth Factor Receptor)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TGFα(transforming growth factor α)。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有证据表明，激活前也存在二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。

在配体与EGFR结合后，受体发生了二聚作用，二聚作用既包括两个同种受体分子的结合(同源性二聚作用)，也包括人类EGF相关性受体(HER)酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合(异源性二聚作用)。二聚作用后是酪氨酸残基的自磷酸化作用。这些磷酸化的残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中相互作用刺激ras蛋白，导致磷酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白(MAP)激酶的激活。或者转录信号传导和激活、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3K)-Akt和应激活化蛋白激酶(SAPK)信号传导通路将被激活。这些信号通路依次触发基因转录，同时控制细胞增生、分化和生存的通路被激活。

EGFR介导信号通路的特异性和强度取决于激活蛋白的性质和四种EGFR家族成员的水平。与HER2结合的配体不详，但当HER2和EGFR共表达时，前者经常与配体激活的后者结合形成二聚体。这种异源性二聚体与EGFR同源性二聚体相比，往往具有更高的再利用率、稳定性和传导信号的能力。EGFR也能与HER3和HER4发生二聚作用，其产物具有更高的持久性和更强的PI3K活性。EGFR信号传导通路一旦配体结合的EGFR被内吞入细胞，信号将终止，受体将被降解或再循环到细胞膜表面，这取决于配体的 性质。例如，EGF结合的受体将被降解，而TGF-α结合的受体则进入再循环。不同的生长因子会影响EGFR信号通路的数量和持续时间。

EGFR信号通路有多重的生物学作用。例如，ras-MAPK信号转导通路刺激细胞的***和迁徙。EGFR也是多种受体通路的重要介体，起到信号会聚点的作用，能够将信号整和与多样化。例如，在应激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物(包括氧化剂、放射线和烷化剂)的反应中，反向激活能诱导EGFR酪氨酸激酶的磷酸化并随后发生信号的转导。EGFR家族的成员在正常发育中起了重要的作用，但在人类肿瘤中经常过度表达并失去控制。

研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。

此外，对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究发现EGFR可以通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节而影响肿瘤血管生成。

3.双特异性抗体技术发展

双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体***是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫***来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

4.双特异性抗体制备

双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交—杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多 价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。

5.肿瘤的过继免疫治疗

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。

发明内容

术语和缩略语 

BiAb:双特异性抗体(bispecific antibody)

TA:肿瘤抗原(tumor antigen)

VH:重链可变区(heavy chain variable region)。

VL:轻链可变区(light chain variable region)。

CL：轻链恒定区(constant region of light chain)。

CDR：是英文Complementarity determining regions(CDRs)的缩写，是指抗体的抗原互补决定区。

ScFv：单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment)，又称为单链抗 体。

CLD:细胞系开发(cell line development)

FACS：荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式细胞分选术。

本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和凋亡能力来杀伤肿瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫***杀伤肿瘤细胞的功效。

具体地，本发明提供了以下的技术方案：

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR、CD20、CD30和CD133，更优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。

在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的CH2结构域位于ScFv片段和CH3结构域之间。

在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。

在一种实施方式中，在单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。

在一种实施方式中，单链单元包括针对人源CD3的抗体抗-CD3，单价单元包括针对EGFR的抗体抗-EGFR；优选地，所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号1所示的 氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链215位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接；

或所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号7所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链214位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

在一种实施方式中，单价单元中的重链包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。

在一种实施方式中，所述单价单元的人IgG Fc段和所述单链单元的IgG Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构连接。

在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S 细胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

在一种实施方式中，第一表达载体是pCHO1.0；第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素。

在一种实施方式中，所述单价单元为抗-EGFR抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F、MK-Leader(EcoRV)F和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F、MK-Leader(AvrII)F和hIgG1(BstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHO1.0表达载体，带Erbitux抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-ERB-HL-KKW，或者带Vectibix抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-VEC-HL-KKW；

所述单链单元为抗-CD3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr II)F，L2K-VH(MK)F1和hIgG1(BstZ17I)R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EGFR特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EGFR细胞。

在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在人肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。本发明还提供了以下的技术方案：

本发明提供了一种新方法制备双特异性抗体MSBODY(monomer and ScFv bispecific antibody)(如图2所示)，该双特异性抗体包括两组重轻链组合，其中一组特异结合一种抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组特异结合另一种抗原，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。并且其中一组的抗体结构为单聚体Ab，另一组为ScFv-Fc，这样就避免了各自轻链与对方重链错配的可能性，从而形成125KD的双特异性抗体蛋白分子。Fc改造后，单聚体Ab的重链和单链自然异二聚化，同时CL和CH1间自然二聚化，最后形成MSBODY，MSBODY各结构域排列顺序及结构示意图见图2。

本发明中利用以上制备双特异性抗体的方法，制备双特异性抗体。其中是以EGFR和人源CD3为靶点的双特异性抗体，被命名为EGFRX CD3，如图2，抗-EGFR这边为IgG形式，包括抗-EGFR重链与轻链，抗-CD3这边为ScFv-Fc形式，包括抗-CD3VH、VL、Fc结构域。以上双特异性抗体通过抗体基因工程方法进行构建，双特异性抗体MSBODY的单聚体Ab重链和单聚体Ab轻链二元表达载体，以及ScFv-Fc表达载体。根据LC，HC，ScFv，Fc基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中LC，HC，ScFv和Fc分别进行PCR扩增，通过PCR或重叠延伸PCR法获得基因片段，然后通过同源重组法进行克隆。酶切pCHO1.0或pCHO1.0-潮霉素载体，然后纯化回收PCR产物和酶切后的载体，分二步分别将LC片段，HC片段同源重组克隆到pCHO1.0载体上，ScFv-Fc片段同源重组克隆到pCHO1.0-潮霉素载体上，并测序。重组蛋白质MSBODY在哺乳动物细胞中的表达、检测，使用转染试剂将分别表达单价单元重链、单价单元轻链和单链单元的质粒共转染至哺乳动物细胞中，再收集上清进行SDS－PAGE和蛋白质印迹检测MSBODY的表达情况。将转染表达后的培养液上清离心，过滤，用结合缓冲液稀释，过亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS－PAGE检测纯化蛋白质。

本发明的技术方案的有益的技术效果有：

1.本申请提供了一种异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肽单元。 该异二聚体与其对应的同二聚体分子量大小不同，可利用分子量的大小来区别异二聚体和同二聚体，从而较方便的确定双特异性抗体的纯度。这两个抗原结合多肽单元之一包含类似于野生型抗体的轻链-重链对，在整个本申请中，该单元也称为“单价单元”。另一抗原结合多肽单元包含单链可变片段(ScFv)。这样的ScFv可融合至抗体的恒定片段(Fc)。在本申请全文中此融合肽也被称为“单链单元”。

2.本发明公开了一种新型双特异性抗体MSBODY介导的免疫细胞杀伤体外药效实验方法的建立及其应用。本发明包括双特异性抗体药物研究过程中所介导的免疫细胞杀伤、双特异性抗体的制备，以及双特异性抗体体外药效模型的建立和检测。双特异性抗体MSBODY包括一组单价单元(重轻链组合)，另一组则为单链单元(ScFv连接Fc组合)，其中单价单元特异结合一种人的肿瘤细胞抗原，包括EGFR等一系列肿瘤细胞膜表面抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组单链单元特异结合另一种人的T细胞抗原CD3，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组单元之间很容易形成异二聚体。与此同时，双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

令人惊奇的是，本申请证明这种非对称的抗体是稳定的并具有高的抗原结合效率。这是令人感到意外的，因为已经证实在生理条件下即使是单链抗体的同二聚体都是不稳定的。例如，Ahmad等的“ScFv Antibody:Principles and Clinical Application,”Clinical and Developmental Immunology,2012:980250(2012),显示基于ScFv的IgG类抗体不稳定，并且需要进一步改造以减少聚集并提高稳定性。

另外，因为具有非对称性，异二聚体具有与由其中任一抗原结合多肽单元组成的同二聚体所不同的等电点。基于异二聚体和同二聚体之间的等电点差异，可以容易地将需要的异二聚体与同二聚体分离，大大减少了双特异性抗体普遍存在的下游工艺开发存在的困难。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1.CD3分子结构示意图。

图2.EGFR X CD3双特异性抗体分子示意图。

图3.纯化的双抗体非变性SDS-PAGE电泳及纯度检测结果图；M：蛋白分子量标记；1：M1001；2：M1003。

图4.EGFR和CD3双抗原ELISA检测抗体双靶向能力结果图。

图5.流式检测热挑战实验处理后双抗体对HCT116细胞的结合情况图。

图6.流式检测热挑战实验处理后双抗体对人PBMC细胞的结合情况图。

图7.EGFR×CD3MSBODY与hPBMC对HCT116细胞的体外细胞毒实验结果图。

图8.EGFR×CD3MSBODY与hPBMC对MDA-MB-453细胞的体外细胞毒实验结果图。

图9.EGFR×CD3MSBODY与hPBMC对HEK293细胞的体外细胞毒实验结果图。

具体实施方式

实施例1：双特异性抗体的表达载体构建(EGFR×CD3,M1001,M1003)

1.双特异性抗体序列设计

以EGFR和CD3为靶点的双特异性抗体被命名为EGFR×CD3MSBODY，其中单价单元为抗EGFR的重链轻链对，可变区氨基酸序列参考单克隆抗体Erbitux的序列(PDB数据库序列号1YY8)和Vectibix的序列(来源为专利US6235883中的序列号38和49)，包括抗EGFR重链与轻链，含有Fab和Fc结构域；单链单元为抗CD3的ScFv-Fc形式，可变区氨基酸参考单克隆抗体L2K的序列(参考US20070123479序列号2)，包括抗CD3VH、VL、Fc结构域。 其中单价单元的重链Fc和单链单元的Fc(同人IgG1的重链Fc)均进行氨基酸突变改造，具体Fc改造过程参见PCT/CN2012/084982，使其各自不易形成同二聚体(homodimer)，而易于形成异二聚体(heterodimer)，该异二聚体即为双特异性抗体EGFR×CD3MSBODY，单价单元来源于Erbitux的EGFR×CD3MSBODY编号为M1001，单价单元来源于Vectibix的EGFR×CD3MSBODY编号为M1003。同时，为了EGFR×CD3MSBODY能在CHO细胞中表达，并能分泌到培养基中，选择了鼠源抗体kappa链的前导肽序列作为分泌信号肽。各个结构域及信号肽的氨基酸序列和核酸序列见如下序列号:1-12。信号肽直接连接于抗体可变区的N端。

单价单元重链氨基酸序列(Erbitux，序列号1)

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 

单价单元重链核酸序列(Erbitux，序列号2)

caggtgcagctgaaacagagcggcccgggcctggtgcagccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttagcctgaccaactatggcgtgcattgggtgcgccagagcccgggcaaaggcctggaatggctgggcgtgatttggagcggcggcaacaccgattataacaccccgtttaccagccgcctgagcattaacaaagataacagcaaaagccaggtgttttttaaaatgaacagcctgcagagcaacgataccgcgatttattattgcgcgcgcgcgctgacctattatgattatgaatttgcgtattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcgcggcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgataccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcgatctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga 

单价单元轻链氨基酸序列(Erbitux，序列号3)

DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 

单价单元轻链核酸序列(Erbitux，序列号4)

gatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgccgcgcgagccagagcattggcaccaacattcattggtatcagcagcgcaccaacggcagcccgcgcctgctgattaaatatgcgagcgaaagcattagcggcattccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgagcattaacagcgtggaaagcgaagatattgcggattattattgccagcagaacaacaactggccgaccacctttggcgcgggcaccaaactggaactgaaacgccgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag 

单价单元重链氨基酸序列(Vectibix，序列号5)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQ FSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 

单价单元重链核酸序列(Vectibix，序列号6)

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccgtcagcagtggtgattactactggacctggatccggcagtccccagggaagggactggagtggattggacacatctattacagtgggaacaccaattataacccctccctcaagagtcgactcaccatatcaattgacacgtccaagactcagttctccctgaagctgagttctgtgaccgctgcggacacggccatttattactgtgtgcgagatcgagtgactggtgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcagcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgataccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcgatctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga 

单价单元轻链氨基酸序列(Vectibix，序列号7)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 

单价单元轻链核酸序列(Vectibix，序列号8)

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacatcagcaactatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatatttctgtcaacactttgatcatctcccgctcgctttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag 

单链单元氨基酸序列(L2K，序列号9)

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 

单链单元核酸序列(L2K，序列号10)

GACATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCCGTGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCC AGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGAAGTGGTGGAGGAGGTTCTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTAAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGGTGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCGGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCGCCAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 

鼠kappa链的前导肽序列氨基酸序列(序列号11)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

鼠kappa链的前导肽序列核酸序列(序列号12)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt

2.双特异性抗体基因克隆

选择pCHO1.0作为表达载体去克隆和表达抗EGFR的重链和轻链基因，pCHO1.0-潮霉素表达载体是通过用潮霉素抗性基因替换pCHO1.0载体中的嘌呤霉素基因改造而来，被选择用来克隆和表达抗CD3的ScFv-Fc融合基因。表1中的引物根据克隆方案设计好后，发送到苏州 金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1中的引物进行PCR扩增，模板为由金唯智基因合成并克隆到pUC57上的基因质粒，包括Erbitux和Vectibix的可变区，然后分别将抗-EGFR重、轻链分别构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗CD3ScFv-Fc构建到pCHO1.0-潮霉素的表达载体上。

表1.双特异性抗体基因克隆中使用的引物

初始PCR扩增模板DNA：M1001和M1003使用相同的引物；扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F，MK-Leader(EcoRV)F，和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr II)F，MK-Leader(AvrII)F和hIgG1(BstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；所述单链单元为抗-CD3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr II)F，L2K-VH(MK)F1和 hIgG1(BstZ17I)R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc；模板DNA的用量为35ng/管，如，目标抗体的轻链和重链；1μl的10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10x PCR Buffer缓冲液；1μl的10mM dNTP；1μl的2.5单位/μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara，R005A)；和蒸馏水到25μl总体积在microfuge管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：95℃，5分钟；以下的25个循环：95℃，每次30秒；56℃，30秒；和72℃，1分钟。

通过几轮重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；以及相应的引物将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHO1.0表达载体，带Erbitux抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-ERB-HL-KKW，带Vectibix抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-VEC-HL-KKW。

通过重叠PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。

实施例2：双特异性抗体表达与纯化

1.双特异性抗体的表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD FortiCHO培养基(Invitrogen，货号A11483-1)中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)，使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-Erbitux-HL-KKW与 pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY一起共转染到CHO-S细胞中，表达抗EGFR×CD3的双特异性抗体M1001；使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-Vectibix-HL-KKW与pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY一起共转染到CHO-S细胞中，方法同上，表达抗EGFR×CD3的双特异性抗体M1003。培养14天后，800Xg离心收获表达上清。

2.双特异性抗体的纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，柱货号18-1153-45,填料货号17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱购自GE公司(柱货号18-1153-44,填料货号17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄+1M NaCl，pH 6.0)20个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换Buffer PBS。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，两种MSBODY纯度均在80％左右，见图3。

实施例3：双特异性抗体与细胞的结合活性测定(FACS)

本发明的双特异性抗体与相应细胞上的靶抗原结合。本发明以HT29(购自中国典型培养物保藏中心)作为EGFR阳性的细胞，Jurkat(ATCC，TIB-152)作为CD3阳性的细胞，并以本发明制备的双抗体测定其细胞结合活性。

1.利用流式分析法检测双特异性抗体与HT29细胞的结合活性

培养足够的HT29细胞，用0.25％胰酶消化、离心收集细胞。同时稀释双特异性抗体，浓度从160nM开始，4倍梯度稀释，得到6个浓度梯度，备用。将收集的细胞用PBS+1％FBS洗两遍，再加PBS+1％FBS重悬细胞至4×10⁶个细胞/ml，细胞铺板于96孔板中，每孔50ul(2×10⁵个细胞)，加入50ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗人IgG FC抗体(Biolegend，409304)重悬细胞， 室温避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再以平均荧光强度，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计算双抗体与HT29的结合亲和力KD值。结果显示EGFR×CD3双抗体与EGFR阳性的HT29细胞具有良好的结合活性(见表2)。与EGFR阳性细胞HT29结合情况：M1001的KD值是0.65±0.27nM，M1003的KD值是0.65±0.18nM，Erbitux的KD值是0.12±0.03nM。两种EGFR×CD3MSBODY的亲和力接近，且与单克隆抗体Erbitux的亲和力相差不大。

表2 EGFR×CD3MSBODY对HT29细胞的亲和力

2.流式分析法检测双特异性抗体与Jurkat细胞的结合活性

培养足够的Jurkat悬浮细胞，离心收集细胞。接下来的实验过程与上述实施例相同，将100ul PBS重悬的细胞，上机检测，以平均荧光强度，通过用软件GraphPad Prism5.0进行分析计算双抗体与Jurkat细胞的结合亲和力KD值。结果显示EGFR×CD3双抗体与CD3阳性的Jurkat细胞具有较好的结合活性(见表3)。与CD3阳性细胞Jurkat结合情况：M1001的KD值是8.73±5.29nM，M1003的KD值是14.36±5.79nM，亲和力均低于单克隆抗体L2K(KD值是0.42±0.12nM)。说明单链单元的结构会降低抗体的亲和力。

表3 EGFR×CD3MSBODY对Jurkat细胞的亲和力

3.双抗原ELISA检测S802的双靶向结合能力

1)抗原制备：EGFR抗原引物设计参考Genbank SeqNo.NM_005228.3，引物序列 见表2的EGFR-F和EGFR-R；mRNA从HT29细胞中提取，使用的试剂为Trizol(Invitrogen)并反转录成cDNA，使用的反转录试剂盒为RT-PCR Kit(TaKaRa)，引物为EGFR-R，再用引物EGFR-F和EGFR-R将该抗原的胞外结构域扩增出来，然后使用引物EGFR-F和Histag-R以PCR方法加上组氨酸标签(7×His)，构建至表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen)中，转染表达方法同M1001的转染表达(见实施例2)，纯化采用GE公司的镍柱(1mL规格预装柱)。

2)使用的抗原之一为HRP标记CD3抗原(CD3抗原为自制，详见专利CN201310399169)，抗原之二为EGFR(见步骤1)。

3)包被抗原：用包被液(pH＝9.6，0.05mol/L碳酸钠缓冲液)将EGFR稀释到1μg/mL加入酶标板孔中，100μl每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST(PBS+0.1％Tween20)洗板一次，100μL/孔；

4)封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；

5)标准曲线：分别加入不同的抗体100μL/孔，浓度均为20μg/mL，每种抗体做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；阴性对照为PBS；

6)加入酶标抗原：再加入HRP标记CD3抗原(PBS稀释到1μg/mL)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；

7)显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；

8)终止：每孔加入100μl终止液(2M盐酸)终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。

由图4可知，M1001和M1003均可以同时结合EGFR和CD3两种抗原。

实施例4：双特异性抗体的热稳定性测定

1.双特异性抗体的热挑战性实验

抗体用PBS稀释到0.5mg/mL，以50μL/管的规格分装到PCR管中，在PCR仪(ABI PCRsystem 9700)上热处理60min。PCR仪从左至右设置温度梯度，从37℃至82℃，每个样品对应一个温度。处理完后，冷却的样品转移至V型底96孔板(Corning)中，4℃、2000rpm离心30min。取上清用于HCT116细胞(购自中国典型培养物保藏中心)或人PBMC细胞结合分析。细胞与上清在室温下共孵育30min，用冰上预冷的1％FBS-PBS洗两遍，再用50倍稀释的PE标记的羊抗人二抗(Sigma，P9170)室温染色30min。染色后的细胞用预冷的1％FBS-PBS洗3遍，重悬于PBS中用流式细胞仪(FC500，Beckman)分析：10万个细胞计数。用GraphPad Prism5软件具有可变斜率的S形剂量响应(a sigmoidal dose response with variable slope)模型进行分析。热变形曲线的温度中点值为T₅₀。

单链抗体片段(ScFv)通过一个连接肽(Gly4Ser)3把重链可变区和轻链可变区连接起来而形成的。但是有报道ScFv内在的不稳定性可能会影响抗体药物的质量(Michaelson JS1,etc.,Farrington GK,Lugovskoy A,Joseph I,Bailly V,Wang X,Garber E,Browning J,Glaser SM.Anti-tumor activity of stability-engineered IgG-like bispecific antibodies targeting TRAIL-R2and LTbetaR.MAbs.2009Mar-Apr；1(2):128-41)。M1001的单链单元与M1003完全一致，两者与Jurkat结合的T₅₀也非常接近(图5)，M1001的T₅₀＝60.26±0.24℃，M1003的T₅₀＝59.71±0.64℃；M1001的单价单元使用的是Erbitux的轻链和重链，M1003的单价单元使用的是Vectibix的轻链和重链，与HCT116结合的T₅₀值差别很小(图6)，M1001的T₅₀＝59.66±0.50℃，M1003的T₅₀＝59.20±0.70℃。两种MSBODY的热稳定性差别不大。

实施例5：双抗体介导的体外细胞杀伤检测

1.人外周血单核细胞(hPBMC)细胞的分离 

取新鲜抗凝人血，400g离心5min，弃上清。加入10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温或冰上裂解4-5分钟。在裂解过程中宜适当摇动以促进红细胞裂解。4℃400g离心5min，弃红色上清。若红细胞裂解不完全，重复步骤2和3一次。洗涤1-2次。加入5倍细胞沉淀体积的PBS，重悬沉淀，4℃,400×g离心2-3分钟，弃上清。可 再重复1次，共洗涤1-2次。根据实验需要用适当4℃预冷PBS重悬细胞沉淀后即得hPBMC，可进行计数等后续实验。

2.双抗体有效介导PBMC细胞杀伤EGFR阳性肿瘤细胞检测

用胰酶消化靶细胞(包括EGFR高表达的HCT116结肠癌细胞，EGFR低表达的MDA-MB-453乳腺癌细胞和EGFR阴性的HEK-293人胚肾细胞，均购自中国典型培养物保藏中心)，制备单细胞悬液。用终浓度为5μM的CFSE染色靶细胞，染色后用该细胞培养的10％FBS-1640将细胞重悬至2×10⁵/ml，按照2×10⁴/孔，即100μl/孔加入96孔板培养过夜。实验设计加入5倍于靶细胞数的效应细胞(hPBMC)，50μl/孔，设置对照孔，无需加入PBMC细胞的孔则用相同体积的培养基补入。加入PBMC细胞的同时按实验设计加入相应抗体，50ul/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。48h后取出96孔板，用胰酶消化各孔细胞为单细胞悬液，此过程中的所有上清及细胞悬液均对应收集到1.5ml离心管中，离心500g×5min。弃上清，各孔加入150ul 1％FBS-PBS重悬混匀细胞。各管于流式上机前10-15min加入PI(终浓度为1μg/ml)流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞的死亡率。

M1001和M1003对EGFR高表达的肿瘤细胞HCT116杀伤效果均非常明显，最高杀伤率达60％以上，且使用剂量均远低于单克隆抗体Erbitux和L2K(图7)；对EGFR低表达的肿瘤细胞MDA-MB-453也都有显著杀伤，且效果大大优于Erbitux和L2K(图8)。但是，对于EGFR完全阴性的细胞HEK293，M1001和M1003没有表现出杀伤效果(图9)。说明EGFR×CD3MSBODY在体外细胞毒实验中，在免疫细胞的参与下，对EGFR阳性表达量不同的肿瘤细胞均有很好的杀伤效果，而对于EGFR不表达的细胞基本不具有毒性。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述本发明具体的实施方案的许多等价物。这些等价物意欲包含在所附的权利要求中。

Claims (12)

1.双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR、CD20、CD30和CD133，更优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR；和(b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元的CH2结构域位于铰链区和CH3结构域之间；不包含CH1结构域；单链单元的铰链区位于ScFv和CH2结构域之间。

3.根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：所述单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。

4.根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：在所述单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；所述重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。

5.权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：单链单元包括针对人源CD3的抗体抗-CD3，单价单元包括针对EGFR的抗体抗-EGFR；

优选地，所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链215位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

或所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号7所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链214位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱氨酸与抗-CD3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。

6.根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元中的重链包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgG1Fc片段；所述融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgG1Fc片段。

7.根据权利要求6所述双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元的人IgG1Fc段和所述单链单元的IgG1Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构连接。

8.制备权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

9.根据权利要求8所述方法，所述第一表达载体是pCHO1.0；所述第二表达载体是pCHO1.0-潮霉素。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)中：

所述单价单元为抗-EGFR抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoR V)F，MK-Leader(EcoRV)F，和hIgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(Avr I I)F，MK-Leader(AvrI I)F和hIgG1(BstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrI I与BstZl7I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHO1.0表达载体，带Erbitux抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-ERB-HL-KKW，或者带Vectibix抗体基因的质粒命名为pCHO1.0-VEC-HL-KKW；

所述单链单元为抗-CD3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(Avr I I)F，L2K-VH(MK)F1和hIgG1(BstZ17I)R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的pCHO1.0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为pCHO1.0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。

11.权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EGFR特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EGFR细胞。

12.权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。