CN116490608A - 靶向cd70的抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种靶向CD70的抗原结合蛋白，尤其涉及一种包含该抗原结合蛋白的嵌合抗原受体以及其应用，以及包含或表达该抗原结合蛋白的细胞。所述抗原结合蛋白以1nM的KD值与CD70蛋白相结合。所述包含该抗原结合蛋白的嵌合抗原受体对于CD70蛋白的特异性识别结合能力强。所述包含或表达该抗原结合蛋白的细胞可分泌细胞因子IL‑2和IFN‑γ。
Description
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向CD70的抗原结合蛋白及其应用。
近年来，随着肿瘤免疫疗法的发展和临床研究的进展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cells，CAR-T)免疫疗法以其独特的抗肿瘤优势，目前是最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号转导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
CD70是II型跨膜蛋白，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员，又称为肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor super-family，TNFSF)因子，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。目前，实体瘤治疗缺少有效的靶点是限制CAR-T的瓶颈之一。研究结果显示CD70高水平表达于原发性及转移性肾癌中，其中在肾透明细胞癌的表达率达100％。CD70也被报道在急性髓系白血病干细胞中高表达。CD70在肿瘤组织中的高水平表达，不仅可以诱导免疫逃逸，同时也可以激活部分免疫细胞杀伤肿瘤细胞，可能作为一种潜在的肿瘤治疗靶点，给肿瘤的免疫治疗带来了新的方向。
目前的CAR-T疗法通常以来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段作为抗原结合区。细胞外的scFv结构域在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白以后，可以激活CAR结构的共刺激域和激活域。但是scFv分子量比较大而且容易形成多聚体，影响CAR的功能。因此，需要包含新结构的抗原结合区的CAR。
发明内容
本申请提供了一种靶向CD70的抗原结合蛋白，尤其涉及一种包含该抗原结合蛋白的嵌合抗原受体以及其应用，以及包含或表达该抗原结合蛋白的细胞，其具有下列性质中的一种 或多种：1)对CD70蛋白的特异性识别结合能力强；和2)能表现出更好的分泌细胞因子IL-2和IFN-γ的能力。
一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体，所述靶向部分包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:3；
b)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:4；
c)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:5；
d)HCDR1：SEQ ID NO:6，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:8；
e)HCDR1：SEQ ID NO:9，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:10；
f)HCDR1：SEQ ID NO:11，HCDR2：SEQ ID NO:12，和HCDR3：SEQ ID NO:13；
g)HCDR1：SEQ ID NO:14，HCDR2：SEQ ID NO:15，和HCDR3：SEQ ID NO:16；
h)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
i)HCDR1：SEQ ID NO:20，HCDR2：SEQ ID NO:21，和HCDR3：SEQ ID NO:22；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
k)HCDR1：SEQ ID NO:26，HCDR2：SEQ ID NO:27，和HCDR3：SEQ ID NO:28；
l)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:30，和HCDR3：SEQ ID NO:31；
m)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:32，和HCDR3：SEQ ID NO:33。
在某些实施方式中，所述靶向部分包括VHH。
在某些实施方式中，所述靶向部分包含SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，其包含信号肽。
在某些实施方式中，所述信号肽包含源自选自下组蛋白的信号肽或其组合：CD8、4-1BB、GM-CSF、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
在某些实施方式中，所述信号肽包括源自CD8的信号肽。
在某些实施方式中，所述信号肽包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述信号肽的C端与所述靶向部分的N端连接。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，其包含铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自选自下组的蛋白的铰链区或其组合：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1和CH2CH3。
在某些实施方式中，所述铰链区包括源自所述CD8中的CD8a的铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述铰链区的N端与所述靶向部分的C端连接。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，其包含跨膜结构域。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含源自选自下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、细胞因子受体、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεR、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包括源自所述CD8中的CD8a的跨膜结构域。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述跨膜结构域的N端与所述铰链区的C端连接。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，其包含共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下组的蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、CD80、CD86、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、CD30L、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、淋巴毒素β受体、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述共刺激信号传导结构域的N端与跨膜结构域的C端连接。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体，其包含胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、CD66d、CD5、CD22、FcRγ、FcRβ、FcRε、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒(BLV)gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒(SIV)PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)K1、DAP10、DAP12，和至少包含一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包括源自CD3zeta的胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述胞内信号传导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端连接。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其以1nM或更低的KD值特异性结合CD70。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，其为抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，其为VHH或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:3；
b)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:4；
c)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:5；
d)HCDR1：SEQ ID NO:6，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:8；
e)HCDR1：SEQ ID NO:9，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:10；
f)HCDR1：SEQ ID NO:11，HCDR2：SEQ ID NO:12，和HCDR3：SEQ ID NO:13；
g)HCDR1：SEQ ID NO:14，HCDR2：SEQ ID NO:15，和HCDR3：SEQ ID NO:16；
h)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
i)HCDR1：SEQ ID NO:20，HCDR2：SEQ ID NO:21，和HCDR3：SEQ ID NO:22；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
k)HCDR1：SEQ ID NO:26，HCDR2：SEQ ID NO:27，和HCDR3：SEQ ID NO:28；
l)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:30，和HCDR3：SEQ ID NO:31；
m)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:32，和HCDR3：SEQ ID NO:33。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括VHH。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其编码所述的嵌合抗原受体和/或所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述的分离的核酸分子包含SEQ ID NO:47-59和/或SEQ ID NO：73-85中任一项所示的核酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的载体包括病毒载体。
在某些实施方式中，所述的载体包括慢病毒载体。
另一方面，本申请提供了一种或多种细胞，其包含所述的嵌合抗原受体，所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，和/或所述的载体。
在某些实施方式中，所述的细胞包括免疫细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞包括T细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞与相应的野生型细胞相比，所述细胞中CD70的表达和/活性降低。
在某些实施方式中，所述的细胞与相应的野生型细胞相比，所述细胞敲除了CD70。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的嵌合抗原受体，所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，所述的嵌合抗原受体，所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞，和/或所述的药物组合物，其用于治疗与CD70的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓系白血病(AML)或肾癌。
另一方面，所述的嵌合抗原受体，所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞，和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与CD70的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述的用途，其中所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓系白血病(AML)或肾癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗与CD70的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的嵌合抗原受体，所述的分离的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞，和/或所述的药物组合物。
在某些实施方式中，所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓系白血病(AML)或肾癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述靶向CD70的CAR的结构。
图2A-2D显示的是本申请所述靶向CD70的单域抗体与细胞系786-O结合的亲和性。
图3显示的是本申请所述流式细胞仪检测靶向CD70的CAR在敲除CD70的T细胞表面的表达效率。
图4显示的是本申请所述靶向CD70的CAR-T细胞与靶细胞共培养后用Elisa法检测IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌。
图5显示的是本申请所述靶向CD70的CAR-T细胞与标记有荧光素酶的靶细胞共培养后检测靶向CD70的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤率。
图6显示的是本申请所述靶向CD70的CAR-T细胞在急性髓系白血病动物模型上的抗肿瘤效果。
图7显示的是本申请所述靶向CD70的CAR-T细胞在肾癌动物模型上的抗肿瘤活性。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常是指能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽聚合体。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括重链的一部分。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括重链可变区。术语“分离的抗原结合蛋白”可以包括单域抗体。例如，分离的抗原结合蛋白可以包括但不限于人单域抗体。
在本申请中，术语“单域抗体”或“sdAb”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中，单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报,2018,34(12):1974-1984)。例如，单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区(VH)构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在成为框架区(FR)的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原(例如，CD70)相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“CD70抗原”和“CD70蛋白”可以互换使用。并且包括CD70的任何变体和同源物，其由细胞天然表达或在用CD70基因转染的细胞上表达。在本申请中，CD70可以为人CD70，其在GenBank中的登录号为NM_001252.5，其在UniProt/Swiss-Prot中的登录号为P32970。例如，所述CD70蛋白可包含人CD70蛋白的同源物。在本申请中，术语“同源物”通常是指与人CD70蛋白氨基酸序列和人CD70蛋白核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“跨膜结构域”通常是指细胞表面蛋白中一段跨越细胞膜的序列，其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜结构域可以与细胞内信号传导结构域相连接，起着传递信号的作用。在本申请中，跨膜结构域可以源自任意的I型、II型或III型跨膜蛋白。在本申请中，跨膜结构域可以包含源自选自下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、T细胞受体的亚基、构成CD3复合体的多肽、IL2受体、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεR、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。例如，T细胞受体的亚基可以包括TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。例如，构成CD3复合体的多肽可以包括CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。例如，跨膜结构域可以包括源自所述CD8中的CD8a的跨膜结构域。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的靶向部分和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括靶向部分(例如，靶向肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)、信号肽、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。在本申请中，所述CAR 可以基于抗体的抗原(例如CD70)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,Jensen MC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr Opin Immunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。
在本申请中，术语“共刺激信号传导结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。在某些情形中，共刺激信号传导结构域可以包含源自选自下组蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、CD80、CD86、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、CD30L、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、淋巴毒素β受体、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，共刺激信号传导结构域可以包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在本申请中，术语“铰链区”通常是指靶向部分(例如，靶向CD70的胞外域)和跨膜结构域之间的连接区。在某些情形中，铰链区可以包含源自选自下组的蛋白的铰链区或其组合：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1和CH2CH3。例如，铰链区可以包括源自所述CD8中的CD8a的铰链区。
在本申请中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，胞内信号传导结构域为用于指导蛋白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。在某些情形中，胞内信号传导结构域可以包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、CD66d、CD5、CD22、FcRγ、FcRβ、FcRε、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10、DAP12，和至少包含一个ITAM的结构域。例如，胞内信号传导结构域可以包括源自CD3zeta的胞内信号传导结构域。
在本申请中，术语“信号肽”通常是指嵌合抗原受体(CAR)的氨基末端(N-末端)的 前导序列，其在翻译时或在翻译后将CAR分子引导到内质网。在某些情形中，信号肽可以包含包含源自选自下组蛋白的信号肽或其组合：CD8、4-1BB、GM-CSF、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。例如，信号肽可以包括源自CD8的信号肽。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫***的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一成分(Clq)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。此外，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。所述“抗原结合片段”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。例如，所述的抗原结合片段还可以包括单域抗体。
在本申请中，术语“急性髓系白血病(AML)”通常是指造血***的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。急性髓系白血病可以包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病。
在本申请中，术语“肾癌”通常是指肾脏细胞发生病变(癌变)并生长失控进而形成肿瘤的疾病。临床可见不同程度的贫血、尿液带血、体侧持续性疼痛、脚踝或腿部肿胀等症状。
在本申请中，术语“K
D”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“Raji细胞”通常是指能产生Epstein-Barr病毒株的连续的人类细胞系。病毒将转化脐带淋巴细胞并且在Raji细胞中诱导早期抗原。Raji细胞被广泛用作转染宿主，也被用于了解造血细胞和其他细胞恶性肿瘤。此外，因为其具有和表达某些补体成分的几种受体以及免疫球蛋白G的Fc受体，因而还被用于检测免疫复合物。
在本申请中，术语“786-O细胞”通常是指人肾透明细胞腺癌细胞。该细胞系来源于一个原发性透明细胞癌。此细胞有微绒毛和桥粒。
在本申请中，术语“THP-1细胞”通常是指人急性单核细胞白血病细胞系。该细胞系可以吞噬乳胶颗粒和激活的红细胞，细胞膜和胞浆内均没有免疫球蛋白，表达C3R和FcR；可受佛波酯TPA诱导向单核系方向分化。
在本申请中，术语“K562细胞”通常是指人类永生化骨髓性白血病细胞系。K562属于红白血病细胞系，具有恶性程度高、增殖速度快的特点。最初分离自一名处于急性期的53岁女性慢性骨髓性白血病(CML)患者的胸水。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子。所述载体可将***的核酸分子转移到细胞中和/或细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体可以是当引入合适的细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体可包含慢病毒载体。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒 或载体，或者能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的嵌合抗原受体或抗原结合蛋白即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以是免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。例如，所述免疫细胞可以是T细胞。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进 一步修饰。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、***或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
发明详述
抗原结合蛋白和嵌合抗原受体
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含可特异性结合CD70的靶向部分。另一方面，本申请提供了一种包含所述分离的抗原结合蛋白(例如，所述可特异性结合CD70的靶向部分)的嵌合抗原受体(CAR)。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，其中所述HCDR1可包含SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR1可包含与SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR2可包含与SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述HCDR3可包含与SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述分离的抗原结合蛋白可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:3；
b)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:4；
c)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:5；
d)HCDR1：SEQ ID NO:6，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:8；
e)HCDR1：SEQ ID NO:9，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:10；
f)HCDR1：SEQ ID NO:11，HCDR2：SEQ ID NO:12，和HCDR3：SEQ ID NO:13；
g)HCDR1：SEQ ID NO:14，HCDR2：SEQ ID NO:15，和HCDR3：SEQ ID NO:16；
h)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；
i)HCDR1：SEQ ID NO:20，HCDR2：SEQ ID NO:21，和HCDR3：SEQ ID NO:22；
j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；
k)HCDR1：SEQ ID NO:26，HCDR2：SEQ ID NO:27，和HCDR3：SEQ ID NO:28；
l)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:30，和HCDR3：SEQ ID NO:31；
m)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:32，和HCDR3：SEQ ID NO:33。
在本申请中，所述抗原结合蛋白还可包括框架区，所述框架区可以来源于人的抗体，或者来源于羊驼、骆驼等物种的单域抗体的框架区。例如，所述抗原结合蛋白的框架区可以来源于人。例如，所述抗原结合蛋白的框架区可以来源于人。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包括Fc区。在某些情形中，所述抗原结合蛋白可以包括单域抗体。
在某些情形中，所述抗原结合蛋白可以包括VHH。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体的靶向部分可以包含VHH。
在本申请中，所述VHH可包含SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述VHH可包含与SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述嵌合抗原受体除包含胞外的靶向部分(例如，靶向CD70)外，还可包含胞内结构域。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体可包含信号肽。所述信号肽可以包括但不限于源自选自下组蛋白的信号肽或其组合：CD8、4-1BB、GM-CSF、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。例如，所述信号肽可以是来自CD8的信号肽。例如，所述信号肽可包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体可包含铰链区。所述铰链区可以包括但不限于源自选自下组蛋白的铰链区或其组合：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1和CH2CH3。例如，所述铰链区可以是来自所述CD8中的CD8a的铰链区。例如，所述铰链区可包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体可包含跨膜结构域。所述跨膜结构域可包含源自选自 下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、细胞因子受体、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεR、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。例如，所述跨膜结构域可以是来自所述CD8中的CD8a的跨膜结构域。例如，所述跨膜结构域可以包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体可包含共刺激信号传导结构域。所述共刺激信号传导结构域可包含源自选自下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、CD80、CD86、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、CD30L、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、淋巴毒素β受体、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。例如，所述共刺激信号传导结构域可以是来自共刺激信号传导结构域。例如，所述共刺激信号传导结构域可包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述嵌合抗原受体可包含胞内信号传导结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、CD66d、CD5、CD22、FcRγ、FcRβ、FcRε、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒(BLV)gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒(SIV)PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)K1、DAP10、DAP12和至少包含一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可以是来自CD3zeta的胞内信号传导结构域。例如，所述胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述信号肽的C端可以与所述靶向部分的N端连接。
例如，所述铰链区的N端可以与所述靶向部分的C端连接。
例如，所述跨膜结构域的N端可以与所述铰链区的C端连接。
例如，所述共刺激信号传导结构域的N端可以与所述跨膜结构域的C端连接。
例如，所述胞内信号传导结构域的N端可以与所述共刺激信号传导结构域的C端连接。
在本申请中，所述嵌合抗原受体从N端到C端可以依次包含下述结构域：信号肽、靶向部分、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。
例如，所述嵌合抗原受体从N端到C端可以依次包含下述结构域：人CD8a信号肽、抗人CD70的单域抗体VHH序列、人CD8a铰链区、CD8a跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3zeta胞内信号传导结构域(如图1所示)。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含SEQ ID NO:60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述嵌合抗原受体可包含与SEQ ID NO:60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
核酸、载体和细胞
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述分离的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述分离的抗原结合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述分离的抗原结合片段的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动 子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体可为表达载体。例如，所述载体可为病毒载体。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的***可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使***的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非***细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。
另一方面，本申请提供了一种细胞。所述细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。所述细胞还可包含本申请所述的嵌合抗原受体或抗原结合蛋白。例如，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述细胞可以包括酵母细胞。例如，所述细胞可以包括大肠杆菌细胞。例如，所述细胞可以包括哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以包括免疫细胞。
所述细胞可以包括免疫细胞。在某些情形中，所述细胞可以包括免疫细胞。例如，所述细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T 淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4+辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+/CD8+T细胞、CD4-/CD8-T细胞或任何其他T淋巴细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的T细胞是人类T细胞。在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。T细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T细胞系。在另一些情形中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。
在某些情形中，所述细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。
在某些情形中，所述细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。
在某些情形中，所述细胞可包括白细胞。白细胞通常是指一种有核的血细胞，具有活跃的移动能力，可以从血管内迁移到血管外，或从血管外组织迁移到血管内。除了在血液外，白细胞还可以存在于淋巴***、脾，扁桃腺以及身体的其他组织。在本申请中，所述白细胞可以包括粒细胞(如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、无粒白细胞(如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、吞噬细胞、肥大细胞)。
在某些情形中，所述细胞可包括淋巴细胞，所述淋巴细胞可以包括在血液、淋巴和淋巴组织中发现的任何单核细胞、非吞噬白细胞，例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括外周血单个核细胞，其可包括在外周血中具有单个核的任何细胞。例如，在本申请中，所述外周血单个核细胞可以包括T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括巨噬细胞。巨噬细胞是一种可以吞噬和消化细胞碎片、 微生物、癌细胞和那些所有缺少正常细胞表面表达的表面标志的其他物质，这个过程叫做吞噬作用。巨噬细胞几乎存在于所有组织中，通过阿米巴运动寻找可能的病原物。它们除了在非专一的天然免疫反应中起重要作用外，还可以通过招募其他免疫细胞类型，如淋巴细胞，帮助启动获得性免疫。
在某些情形中，所述细胞与野生型细胞相比，所述细胞中CD70的表达和/或活性降低。
在某些情形中，所述细胞与野生型细胞相比，所述细胞敲除了CD70。
例如，可以利用锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9***敲除CD70。例如，可以包括使用Cas9-gRNA***敲除CD70。所述“Cas9-gRNA***”也可称为“CRISPR/Cas9***”，是一种用于生物体中位点特异性基因组靶向的工具。例如，它可以是II型CRISPR/Cas***，它是一种原核适应性免疫反应***，该***使用非编码RNA指导Cas9核酸酶诱导位点特异性DNA切割。通过细胞DNA修复机制，可以通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)途径修复这种DNA损伤。可以利用CRISPR/Cas9***创建一种简单的RNA可编程方法来介导哺乳动物细胞中的基因组编辑，并可以用于生成基因敲除(通过***/缺失)或敲入(通过HDR)。
药物组合物
另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述的嵌合抗原受体、所述的分离的抗原结合蛋白、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。除非与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。在本申请中，所述药学上可接受的赋形剂可以包括在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。例如，所述赋形剂可以包括片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。例如，所述赋形剂可以包括中药丸剂中的酒、醋、药汁等。例如，所述赋形剂可以包括半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分。例如，所述赋形剂可以包括液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
所述药物组合物可以用来治疗与CD70的表达相关的疾病或病症，例如用于治疗白血病(例如，AML)或肾癌。
用途和方法
另一方面，本申请提供了所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核 酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与CD70的表达相关的疾病或病症。
另一方面，本申请提供了预防或治疗与CD70的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
在某些情形中，本申请所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括白血病(例如，AML)或肾癌。
本申请所述药物组合物及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用，诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的药物组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状，诸如炎症、免疫疾病及感染性疾病。
另一个方面，本申请提供了制备本申请所述分离的抗原结合蛋白和所述的嵌合抗原受体的方法。所述方法可包括，在使得所述分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。
例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
在某些情形中，所述方法还可包括收获(例如分离和/或纯化)本申请所述分离的抗原结合蛋白的步骤。例如，可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析，还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述分离的抗原结合蛋白。例如，还可以通过使用高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
在本申请中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，Freireich等人描述了动物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(Freireich et al.，Cancer Chemother.Rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.，537(1970)。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和 用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1获取CD70单域抗体VHH基因序列并检测其亲和力
1.1构建单域抗体免疫文库：
使用具有C-末端人IgG Fc标签的重组人CD70抗原(Acrobiosystems:CDL-H82Q9)进行羊驼免疫。总共免疫四次，免疫间隔时间约3周。第一次免疫使用0.5mg重组人CD70抗原与CFA(完全弗氏佐剂)1:1混匀乳化后皮下注射，计为第一天。后面三次免疫使用0.25mg重组人CD70抗原与IFA(不完全弗氏佐剂)1:1混匀乳化后皮下注射，期间通过取血采样评估免疫反应效果。在第七十天，取外周血通过梯度离心分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过两轮聚合酶链式反应(PCR)扩增羊驼重链免疫球蛋白的可变区VHH序列，将扩增出来的VHH***噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体VHH基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。
1.2筛选CD70特异性抗体序列：
利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性的单域抗体。将人CD70His融合蛋白(Acrobiosystems:CDL-H82Q9)包被到96孔板中，通过Elisa实验筛选3-5轮，将CD70特异性的噬菌体逐步得到富集。挑选大量阳性克隆进行Elisa检测并对阳性克隆筛选和测序，根据序列比对确定独特的克隆并将其序列分为框架区FR和互补决定区CDR。通过以上方法，共获得13株亲和力较高的靶向人CD70的单域抗体(sdAb)。这13株抗体分别命名为CD70-sdAb-1C(氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，核酸序列如SEQ ID NO:47所示)、CD70-sdAb-1E(氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，核酸序列如SEQ ID NO:48所示)、CD70-sdAb-1F(氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、核酸序列如SEQ ID NO:49所示)、CD70-sdAb-1G(氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，核酸序列如SEQ ID NO:50所示)、CD70-sdAb-1H(氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，核酸序列如SEQ ID NO:51所示)、CD70-sdAb-3H(氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，核酸序列如SEQ ID NO:52所示)、CD70-sdAb-5A(氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示，核酸序列如SEQ ID NO:53所示)、CD70-sdAb-5B(氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，核酸序列如SEQ ID NO:54所示)、CD70-sdAb-5H(氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，核酸序列如SEQ ID NO:55所示)、CD70-sdAb-7D(氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，核酸序列如SEQ ID NO:56所示)、CD70-sdAb-H3(氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，核酸序列如SEQ ID NO:57所示)、 CD70-sdAb-L2(氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，核酸序列如SEQ ID NO:58所示)、CD70-sdAb-L1(氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，核酸序列如SEQ ID NO:59所示)。
1.3检测抗体的亲和力
将CD70-sdAb-1E，CD70-sdAb-1G，CD70-sdAb-3H，CD70-sdAb-L2氨基酸序列的C端分别连接上人的Fc结构域(如SEQ ID NO:94所示)，并在HEK293中表达这4个融合了Fc的蛋白，纯化后使用Biacore T200(GE)，Protein A chip(GE,Cat#29127556)检测这4个sdAb-Fc与CD70蛋白(ACRO Biosystems，CDL-H82Q9)的亲和力，结果如表1所示。
从抗体的平衡解离常数KD可以看出，筛选到的这些抗体针对CD70都有较高的亲和力，KD值都在1nM以下。
表1不同单域抗体与CD70结合的亲和力
| 抗体 | 类型 | 靶蛋白 | KD(M) |
| CD70-sdAb-1E | VHH | CD70 | 1.683E-10 |
| CD70-sdAb-1G | VHH | CD70 | 2.65E-10 |
| CD70-sdAb-3H | VHH | CD70 | 3.005E-10 |
| CD70-sdAb-L2 | VHH | CD70 | 9.757E-10 |
使用不同浓度的CD70-sdAb-1E，CD70-sdAb-1G，CD70-sdAb-3H，CD70-sdAb-L2对应的sdAb-Fc抗体蛋白对肾癌786-O细胞系(表达CD70)和786-O-KO(CD70)细胞系(用CRISPR敲除了CD70基因，因此不表达CD70)进行染色，流式细胞术分析阳性细胞比例，分别绘制如图2A-2D所示的曲线，计算得出这4种抗体CD70-sdAb-1E，CD70-sdAb-1G，CD70-sdAb-3H，CD70-sdAb-L2对应的EC50分别是14.14μg/ml,5.70μg/ml,10.76μg/ml,11.65μg/ml。
实施例2全基因合成CD70嵌合抗原受体分子并构建慢病毒表达载体
将获得的13株sdAb都分别构建到慢病毒载体上来筛选出更有效的靶向CD70的嵌合抗原受体。
2.1基因合成含有不同sdAb的靶向CD70的嵌合抗原受体的基因序列：
靶向CD70的嵌合抗原受体具体包括：人CD8α信号肽、靶向人CD70的单域抗体VHH序列、人CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导结构域和CD3zeta胞内信号传导结构域，它们按照依次串联的方式连接(图1)。13种不同的嵌合抗原受体分子(CAR分子)分别命名为CD70-CAR-1C(氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示，核酸序列如SEQ ID NO:73所示)、CD70-CAR-1E(氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示，核酸序列如SEQ ID NO:74所示)、CD70-CAR-1F(氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示，核酸序列如SEQ ID NO:75所 示)、CD70-CAR-1G(氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示，核酸序列如SEQ ID NO:76所示)、CD70-CAR-1H(氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示，核酸序列如SEQ ID NO:77所示)、CD70-CAR-3H(氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示，核酸序列如SEQ ID NO:78所示)、CD70-CAR-5A(氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，核酸序列如SEQ ID NO:79所示)、CD70-CAR-5B(氨基酸序列SEQ ID NO:67所示，核酸序列如SEQ ID NO:80所示)、CD70-CAR-5H(氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示，核酸序列如SEQ ID NO:81所示)、CD70-CAR-7D(氨基酸序列如SEQ ID NO:69所示，核酸序列如SEQ ID NO:82所示)、CD70-CAR-H3(氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示，核酸序列如SEQ ID NO:83所示)、CD70-CAR-L2(氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示，核酸序列如SEQ ID NO:84所示)、CD70-CAR-L1(氨基酸序列如SEQ ID NO:72所示，核酸序列如SEQ ID NO:85所示)。13种不同的靶向CD70的嵌合抗原受体基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆至pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)上。为了便于后续构建到慢病毒载体上，在合成基因时分别在基因5’端和3’端添加限制性内切酶BamHI(NEB:R3136S)和SalI(NEB:R3138S)酶切位点。参考专利CN111909966A的制备方法，基于已有专利US20170369581中靶向CD70的单抗41D12的VL和VH序列，获取CD70-CAR-03核酸序列(SEQ ID NO:93)，制备对应的慢病毒和对应的CAR-T细胞作为实施例中的阳性对照。
2.2克隆靶向CD70的嵌合抗原受体基因序列至慢病毒载体：
利用BamHI和SalI两个酶切位点将靶向CD70的嵌合抗原受体基因序列分别从pUC57载体上双酶切下来，酶切条带经琼脂糖凝胶电泳检测后分别进行胶回收纯化(QIAGEN：28706)得到靶向CD70嵌合抗原受体DNA片段。将酶切回收的靶向CD70嵌合抗原受体DNA片段通过T4连接酶(NEB：M0202S)克隆至慢病毒载体pCGK(PCT/CN2019/090605)上，经转化酶切测序验证后得到13个含有靶向CD70的嵌合抗原受体基因序列的重组质粒:CD70-CAR-1C-pCGK、CD70-CAR-1E-pCGK、CD70-CAR-1F-pCGK、CD70-CAR-1G-pCGK、CD70-CAR-1H-pCGK、CD70-CAR-3H-pCGK、CD70-CAR-5A-pCGK、CD70-CAR-5B-pCGK、CD70-CAR-5H-pCGK、CD70-CAR-7D-pCGK、CD70-CAR-H3-pCGK、CD70-CAR-L2-pCGK、CD70-CAR-L1-pCGK。将13个重组质粒送苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，测序引物为：
Lenti-For:TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID NO:86)
Lenti-Rev：CCTCATAAAGAGACAGCAACCAGG(SEQ ID NO:87)
测序验证13个重组质粒均构建正确。
实施例3制备含有靶向CD70嵌合抗原受体分子的慢病毒
3.1大提重组质粒：
(1)转化重组质粒和摇菌：将测序验证正确的重组质粒重新转化大肠杆菌stbl3(购自北京科瑞思博公司)。第二天从转化好的平板上挑取单克隆到3ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基的摇菌管中，30℃220rpm，摇床振荡培养8h。按照1:500接种量将活化好的菌液接种到250ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基中，30℃220rpm，摇床振荡培养12-16h。
(2)提取重组质粒：使用Qiagen HiSpeed Plasmid Maxi Kit试剂盒(货号：12662)，根据试剂盒提供的实验流程来提取质粒。
(3)检测抽提质粒的质量：提取的重组质粒使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)测定重组质粒浓度进而判断重组质粒的纯度，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测超螺旋质粒含量。
3.2培养293T细胞：
液氮中取出冻存的293T细胞(购自ATCC)，在37℃水浴锅内不断摇动促其融化。用消毒酒精擦拭冻存管口后，转移到提前已加入10ml预热的DMEM完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素)的15ml离心管中，轻轻吹匀，1000rpm离心3min，吸弃上清。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹匀后接种到10cm培养皿中，在37℃含5％CO
2的细胞培养箱中培养。第二天当细胞密度达到80％-90％时对293T细胞进行传代，先用移液管吸掉培养基接着用10ml PBS清洗1次293T细胞，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入培养箱1-2min(期间需要拿出在显微镜下观察细胞是否变圆)。细胞变圆后加1ml的DMEM完全培养基终止消化，转移到15ml离心管中，1000rpm离心3min，吸弃上清。根据实验需要，按照1:3或1:5的比例传代，将293T细胞接种到新的10cm培养皿中继续培养或者冻存。
3.3接种293T细胞到培养瓶中：
复苏的293T细胞一般培养传2代以上后，就可以用来包装慢病毒。首先培养的293T细胞经胰蛋白酶消化混匀后，根据计数结果，按照约1.7×10
7个/T175瓶(30ml培养基培养)接种293T细胞，轻轻摇匀后置于37℃含5％CO
2的细胞培养箱中培养过夜使其细胞密度达到70-80％时可转染。
3.4PEI法转染293T细胞：
第二天，质粒转染前培养基需换成有10％FBS但无双抗的DMEM培养基。首先准备质粒复合物：15ml离心管中加入1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific；31985-070)，再依次 加入病毒载体质粒：18μg，psPAX2质粒(Addgene；货号：12260)：9μg，pMD2.G质粒(Addgene；货号：12259)：18μg，以上质粒都加入后轻轻混匀后静置5min。病毒重组质粒共有13种(CD70-CAR-1C-pCGK、CD70-CAR-1E-pCGK、CD70-CAR-1F-pCGK、CD70-CAR-1G-pCGK、CD70-CAR-1H-pCGK、CD70-CAR-3H-pCGK、CD70-CAR-5A-pCGK、CD70-CAR-5B-pCGK、CD70-CAR-5H-pCGK、CD70-CAR-7D-pCGK、CD70-CAR-H3-pCGK、CD70-CAR-L2-pCGK、CD70-CAR-L1-pCGK)，需要包13种病毒，每个病毒重组质粒分别加入。再准备转染试剂复合物：将67.5μl(2mg/ml)PEI(polysciences：24765)加入到1.5ml Opti-MEM内混匀，室温静置5min，孵育结束再将转染试剂复合物加入到质粒复合物中，混匀后静置20min。最后将转染复合物慢慢逐滴加入到293T细胞中，轻轻混匀，37℃含5％CO
2的细胞培养箱中培养。
3.5收集慢病毒收集并浓缩：
重组质粒转染293T细胞48h后收取细胞培养基上清到50ml离心管中，2000rpm离心10min去除细胞碎片。使用Millipore的0.45μm滤膜过滤细胞上清，将滤液转移到专用离心管中，配平后使用超速离心机25000rpm超速离心2h。超离结束后倒掉滤液，使用无血清培养基重悬慢病毒，并将慢病毒分装后保存在-80℃超低温冰箱中。按照该流程分别制备含有CD70-CAR-1C-pCGK、CD70-CAR-1E-pCGK、CD70-CAR-1F-pCGK、CD70-CAR-1G-pCGK、CD70-CAR-1H-pCGK、CD70-CAR-3H-pCGK CD70-CAR-5A-pCGK、CD70-CAR-5B-pCGKCD70-CAR-5H-pCGK、CD70-CAR-7D-pCGK、CD70-CAR-H3-pCGK、CD70-CAR-L2-pCGK、CD70-CAR-L1-pCGK的慢病毒。
实施例4复苏人原代T细胞先敲除CD70基因再激活
将人外周血单个核细胞(PBMCs，购自上海妙顺生物)从液氮中取出对其复苏计数后，对复苏的细胞使用CRISPR/Cas9电转将CD70 sgRNA-19导入到T细胞中敲除T细胞中的CD70基因。细胞处理操作流程参考专利WO2019/011118实施例3进行。同时选择未敲除的T细胞(对照T细胞)做阴性对照。细胞敲除的第2天按照细胞与磁珠1:3的比例加入偶联有CD3/CD28抗体的磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活敲除CD70的T细胞，同时培养基中添加300IU的IL-2(PeproTech：200-02)。
实施例5制备CD70敲除的靶向CD70的CAR-T细胞
细胞激活第2天，对敲除CD70的T细胞计数后将其细胞浓度调至为1×106/ml，每孔接种500μl细胞到24孔中，分别将含有CD70-CAR-1C-pCGK、CD70-CAR-1E-pCGK、 CD70-CAR-1F-pCGK、CD70-CAR-1G-pCGK、CD70-CAR-1H-pCGK、CD70-CAR-3H-pCGKCD70-CAR-5A-pCGK、CD70-CAR-5B-pCGK、CD70-CAR-5H-pCGK、CD70-CAR-7D-pCGKCD70-CAR-H3-pCGK、CD70-CAR-L2-pCGK、CD70-CAR-L1-pCGK的慢病毒加入到T-KO细胞培养孔内转染T细胞，未转染的T-KO细胞作为阴性对照，得到不同组别的可表达靶向人CD70抗原的嵌合抗原受体T细胞，命名为CD70 KO-CAR-1C、CD70 KO-CAR-1E、CD70 KO-CAR-1F、CD70 KO-CAR-1G、CD70 KO-CAR-1H、CD70 KO-CAR-3H、CD70 KO-CAR-5A、CD70 KO-CAR-5B CD70 KO-CAR-5H、CD70 KO-CAR-7D、CD70 KO-CAR-H3、CD70 KO-CAR-L2、CD70 KO-CAR-L1。同时按照相似流程制备阳性对照CAR：CD70-CAR-03对应的CAR-T细胞，命名为：CD70KO-CAR-03。继续培养各组T细胞至静息态。同时取各组CAR-T细胞，提取各组细胞的基因组，通过PCR和TIDE分析确定在这些CAR-T细胞中，CD70已经被成功敲除。对照T细胞CT-KO、CD70 KO-CAR-1C、CD70 KO-CAR-1E、CD70 KO-CAR-1F、CD70 KO-CAR-1G、CD70 KO-CAR-1H、CD70 KO-CAR-3H、CD70 KO-CAR-5A、CD70 KO-CAR-5B、CD70 KO-CAR-5H、CD70 KO-CAR-7D、CD70 KO-CAR-H3、CD70 KO-CAR-L2、CD70 KO-CAR-L1细胞敲除效率如表2所示。
表2不同组别CAR-T细胞的敲除效率
实施例6检测靶向CD70 CAR在T细胞内的表达情况
通过荧光抗体染色和流式细胞术检测实施例5制得的靶向CD70 CAR在各组T细胞内的表达情况，具体步骤：分别离心收集慢病毒感染48h的靶向CD70 CAR-T细胞和慢病毒未感染的T细胞和T-KO细胞，加入生物素化人CD70蛋白(100μg/ml)(Acrobiosystems:CDL-H82Q9)，4℃避光孵育30分钟，孵育结束用PBS清洗1次。使用适量体积PBS重悬后加入二抗PE-Streptavidin(BD Biosciences：554061)，4℃避光孵育20分钟，PBS清洗1次后再用适量的PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测靶向CD70的CAR在敲除CD70的T细胞表面的表达效率。结果如图3所示，靶向CD70的CAR在敲除CD70的T细胞表面的表达效率较高。
实施例7靶向CD70 CAR-T与不同的靶细胞共培养后检测细胞因子的分泌
7.1细胞共培养：首先检测CD70在786-O(购自中国科学院细胞库)，THP-1细胞、Raji细胞、K562细胞和293T细胞内的表达情况。取一定体积的细胞，使用CD70抗体染色后流式细胞仪分析，发现Raji、THP-1和786-O细胞高表达CD70，K562和293T细胞不表达CD70。使用能表达CD70基因(Genebank：NM_001252.5)的慢病毒转染293T细胞，制备得到表达CD70蛋白的293T.CD70细胞系。慢病毒制备流程参见实施例3。对实施例5制得的13种靶向CD70的CAR-T细胞(CD70 KO-CAR-1C、CD70 KO-CAR-1E、CD70 KO-CAR-1F、CD70 KO-CAR-1G、CD70 KO-CAR-1H、CD70 KO-CAR-3H、CD70 KO-CAR-5A、CD70 KO-CAR-5B CD70 KO-CAR-5H、CD70 KO-CAR-7D、CD70 KO-CAR-H3、CD70 KO-CAR-L2、CD70 KO-CAR-L1)和对照T-KO细胞计数后将浓度调至5×10
5/ml，然后按照100ul每孔接种到平底96孔板中。每个靶向CD70的CAR-T细胞设置3个重复，将已接种好的靶向CD70的CAR-T和T-KO细胞暂时放置于37℃孵育。将靶细胞Raji(购自中国科学院细胞库)、786-O、THP-1、表达CD70蛋白的293T.CD70、不表达CD70蛋白的阴性细胞K562(中国科学院细胞库)和293T(ATCC)按照效靶比1:1即细胞浓度5×10
5/ml，100μl/孔，加入到靶向CD70的CAR-T细胞或者对照T-KO细胞中共培养。
7.2将上述细胞共培养24h后的上清转移到新的96孔板，使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific；货号88-7316)按照试剂盒提供的标准流程检测CAR-T细胞IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌。ELISA平板制备和细胞上清中细胞因子的检测按照试剂盒提供的标准流程 操作。结果如图4所示，靶向CD70的CAR-T细胞分别与Raji、THP-1和786-O细胞共培养，能够分泌白介素-2和干扰素γ。
实施例8靶向CD70 CAR-T与不同的靶细胞共培养后检测杀伤能力
8.1细胞铺板：使用带有荧光素酶(GenBank:AAR29591.1)的慢病毒转染786-O细胞、THP-1细胞、K562细胞和293T细胞，制备得到标记有荧光素酶的细胞系，分别命名为：780-O.luc细胞、THP-1.luc细胞、K562.luc细胞和293T.luc细胞。慢病毒制备流程参见实施例3。将标记有荧光素酶的细胞系，按照细胞浓度1×10
5/ml，50μl/孔铺至96孔平底不透明白板中。设置2.5：1、1：1和0.5：1三个效靶比将靶向CD70 CAR-T细胞与THP-1共培养，1：1、0.5：1和0.25：1三个效靶比将靶向CD70 CAR-T细胞与786-O细胞共培养，2.5:1、1:1和0.5:1共三个效靶比将靶向CD70的CAR-T细胞分别与K562细胞和293T细胞共培养，靶向CD70的CAR-T细胞分别是CD70 KO-CAR-1C、CD70 KO-CAR-1E、CD70 KO-CAR-1F、CD70 KO-CAR-1G、CD70 KO-CAR-1H、CD70 KO-CAR-3H、CD70 KO-CAR-5A、CD70 KO-CAR-5B CD70 KO-CAR-5H、CD70 KO-CAR-7D、CD70 KO-CAR-H3、CD70 KO-CAR-L2、CD70 KO-CAR-L1，并将对照T-KO细胞与靶细胞共培养，每个靶向CD70的CAR-T为3个重复。将96孔板放置于37℃5％CO
2细胞培养箱中培养过夜。
8.2细胞共培养24h后测定靶细胞剩余的荧光素酶活性(相对光单位，RLU)，来检测每种靶向CD70的CAR-T对不同靶细胞的杀伤能力。具体步骤为：共培养后的细胞直接加入100μl的D-luciferin底物(Thermo Fisher Scientific：88293)混匀避光显色5min，并用酶标仪以化学发光模式检测荧光强度。在不存在效应细胞的情况下，通过将培养基加入靶细胞来获得最大荧光素酶活性作为对照。结果如图5所示，靶向CD70的CAR-T对THP-1(急性髓系白血病细胞株)和786-O(肾癌细胞株)有杀伤作用。
实施例9靶向CD70 CAR-T在急性髓系白血病动物模型上的活性
THP-1 Luc肿瘤细胞为表达luciferase荧光素酶的人急性髓系白血病细胞，在常规复苏后扩增培养，至少传代2次后收获对数生长期的细胞，以不含血清的培养基重悬。取6-8周的雌性NOG小鼠，所有动物无菌条件尾静脉接种含有5×10
6个细胞的PBS悬液0.1mL。尾静脉接种THP-1Luc细胞后7-11天，根据肿瘤信号强度筛选33只动物随机分为11组，单次静脉给药注射如下细胞：缓冲液组(PBS)、对照T细胞组T-KO、CD70 KO-CAR-1C、CD70 KO-CAR-1E、CD70 KO-CAR-1F、CD70 KO-CAR-1G、CD70 KO-CAR-3H、CD70 KO-CAR-H3、CD70 KO-CAR-L2、CD70 KO-CAR-L1，CD70 KO-CAR-03(阳性对照)，每组3只小鼠。提前准备预热的1640完全培养基，转移到15mL离心管，每管5mL。将冻存管自低温保存场 所中取出后迅速置37℃水浴，水浴溶解后将细胞转移到15mL离心管中，与培养基混匀。取适量细胞，使用台盼蓝计数细胞密度和活力。细胞以1800rpm条件下离心5min，用PBS调整供试品细胞密度。供试品各组动物以3×10
6个T细胞/只(约1.5×10
6个CAR阳性细胞)给予细胞，在200μl PBS中注射。
在D7、D14、D21、D28、D35、D49天，所有动物腹腔注射150mg/kg的D-荧光素钾(Thermo Fisher Scientific)。注射后10～15min于异氟烷麻醉下以Bruker小动物成像仪拍摄化学发光信号，成像时间180s。
结果：实验结果见图6。图6可以显示，在本实验条件下，所有组别的CAR-T相比较于对照T-KO组和缓冲液组(PBS)都明显可以抑制肿瘤细胞的增殖。和阳性对照CD70 KO-CAR-03相比，CD70 KO-CAR-L2，CD70 KO-CAR-1E，CD70 KO-CAR-1G，CD70 KO-CAR-3H这4组具有更强的抗肿瘤活性(表3)。
表3小鼠CAR-T注射后第49天每组平均生物荧光值排序(从低到高)
| CAR组别 | 生物荧光(photon/second) |
| CD70 KO-CAR-L2 | 800667 |
| CD70 KO-CAR-1E | 9273667 |
| CD70 KO-CAR-1G | 14689667 |
| CD70 KO-CAR-3H | 42893667 |
| CD70 KO-CAR-03 | 193150333 |
| CD70 KO-CAR-L1 | 258283667 |
| CD70 KO-CAR-1C | 340223667 |
| CD70 KO-CAR-H3 | 430557000 |
| CD70 KO-CAR-1F | 2999083667 |
实施例10靶向CD70 CAR-T在肾癌动物模型上的活性
786-O肿瘤细胞为人肾癌细胞，在常规复苏后扩增培养，至少传代2次后收获对数生长期的细胞，以不含血清的培养基重悬至1×10
7个/mL。取45只6-8周的雌性NOG小鼠，将786-O细胞重悬在PBS和Matrigel基质1:1混合的溶液中，所有动物无菌条件皮下接种细胞悬液0.2mL(含5×10
6个786-O细胞)，接种于小鼠的右后背。接种786-O细胞后约33天，待肿瘤体积达到120-150mm
3时，筛选30只动物随机分为6组，单次静脉给药注射如下细胞：对照T细胞组T-KO、CD70 KO-CAR-1E，CD70 KO-CAR-1G，CD70 KO-CAR-3H，CD70 KO-CAR-L2，CD70 KO-CAR-03(阳性对照)，每组5只小鼠。提前准备预热的1640完全 培养基，转移到15mL离心管，每管5mL。将冻存管自低温保存场所中取出后迅速置37℃水浴，水浴溶解后将细胞转移到15mL离心管中，与培养基混匀。取适量细胞，使用台盼蓝计数细胞密度和活力。细胞以1800rpm条件下离心5min，用PBS调整供试品细胞密度。供试品各组动物以2×10
6个T细胞/只(约1×10
6个CAR阳性细胞)给予细胞，在200ul PBS中注射。给药后，每周三次测量肿瘤直径计算肿瘤体积，一直观察到给药后第41天。
结果：实验结果见图7。图7可以显示，在本实验条件下，所有组别的CAR-T相比较于对照T-KO组都明显可以抑制肿瘤。和阳性对照CD70 KO-CAR-03相比，CD70 KO-CAR-1E，CD70 KO-CAR-1G，CD70 KO-CAR-3H，CD70 KO-CAR-L2这4组都具有更强的抗肿瘤活性，与上述急性髓系白血病动物模型上的结果一致。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。
Claims (60)
- 嵌合抗原受体，其包含靶向部分，所述靶向部分包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-2中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：a)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:3；b)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:4；c)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:5；d)HCDR1：SEQ ID NO:6，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:8；e)HCDR1：SEQ ID NO:9，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:10；f)HCDR1：SEQ ID NO:11，HCDR2：SEQ ID NO:12，和HCDR3：SEQ ID NO:13；g)HCDR1：SEQ ID NO:14，HCDR2：SEQ ID NO:15，和HCDR3：SEQ ID NO:16；h)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；i)HCDR1：SEQ ID NO:20，HCDR2：SEQ ID NO:21，和HCDR3：SEQ ID NO:22；j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；k)HCDR1：SEQ ID NO:26，HCDR2：SEQ ID NO:27，和HCDR3：SEQ ID NO:28；l)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:30，和HCDR3：SEQ ID NO:31；m)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:32，和HCDR3：SEQ ID NO:33。
- 根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括VHH。
- 根据权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包含SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含信号肽。
- 根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述信号肽包含源自选自下组蛋白的信号肽或其组合：CD8、4-1BB、GM-CSF、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
- 根据权利要求7-8中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述信号肽包括源自CD8的信号 肽。
- 根据权利要求7-9中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求7-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述信号肽的C端与所述靶向部分的N端连接。
- 根据权利要求1-11中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含铰链区。
- 根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含源自选自下组的蛋白的铰链区或其组合：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1和CH2CH3。
- 根据权利要求12-13中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包括源自所述CD8中的CD8a的铰链区。
- 根据权利要求12-14中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求12-15中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区的N端与所述靶向部分的C端连接。
- 根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含跨膜结构域。
- 根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含源自选自下组蛋白的跨膜结构域或其组合：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、CTLA-4、LAG-3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3ζ、细胞因子受体、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεR、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。
- 根据权利要求17-18中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包括源自所述CD8中的CD8a的跨膜结构域。
- 根据权利要求17-19中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求17-20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域的N端与所述铰链区的C端连接。
- 根据权利要求1-21中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含共刺激信号传导结构域。
- 根据权利要求22所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含源自选自下组的蛋白的共刺激信号传导结构域或其组合：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、CD80、CD86、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM、NKG2D、NKG2C、B7-H3、 2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、ICOS-L、CD30L、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、淋巴毒素β受体、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
- 根据权利要求22-23中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包括源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
- 根据权利要求22-24中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求22-25中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导结构域的N端与所述跨膜结构域的C端连接。
- 根据权利要求1-26中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含胞内信号传导结构域。
- 根据权利要求27所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含源自选自下组的蛋白的胞内信号传导结构域或其组合：CD3zeta、CD3delta、CD3gamma、CD3ε、CD79a、CD79b、CD66d、CD5、CD22、FcRγ、FcRβ、FcRε、FceRIγ、FceRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒(BLV)gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒(SIV)PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV)K1、DAP10、DAP12和至少包含一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的结构域。
- 根据权利要求27-28中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包括源自CD3zeta的胞内信号传导结构域。
- 根据权利要求27-29中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求27-30中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域的N端与所述共刺激信号传导结构域的C端连接。
- 根据权利要求1-31中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含SEQ ID NO:60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72任一项所示的氨基酸序列。
- 分离的抗原结合蛋白，其以1nM或更低的K D值特异性结合CD70。
- 根据权利要求33所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:1、6、9、11、14、17、20、23、26和29中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求34所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、7、12、15、18、21、24、27、30和32中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求34-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:3、4、5、8、10、13、16、19、22、25、28、31和33中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求33-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其为抗体或其抗原结合片段。
- 根据权利要求37所述的分离的抗原结合蛋白，其为VHH或其抗原结合片段。
- 根据权利要求37-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
- 根据权利要求33-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下组中任意一组的氨基酸序列：a)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:3；b)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:4；c)HCDR1：SEQ ID NO:1，HCDR2：SEQ ID NO:2，和HCDR3：SEQ ID NO:5；d)HCDR1：SEQ ID NO:6，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:8；e)HCDR1：SEQ ID NO:9，HCDR2：SEQ ID NO:7，和HCDR3：SEQ ID NO:10；f)HCDR1：SEQ ID NO:11，HCDR2：SEQ ID NO:12，和HCDR3：SEQ ID NO:13；g)HCDR1：SEQ ID NO:14，HCDR2：SEQ ID NO:15，和HCDR3：SEQ ID NO:16；h)HCDR1：SEQ ID NO:17，HCDR2：SEQ ID NO:18，和HCDR3：SEQ ID NO:19；i)HCDR1：SEQ ID NO:20，HCDR2：SEQ ID NO:21，和HCDR3：SEQ ID NO:22；j)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:24，和HCDR3：SEQ ID NO:25；k)HCDR1：SEQ ID NO:26，HCDR2：SEQ ID NO:27，和HCDR3：SEQ ID NO:28；l)HCDR1：SEQ ID NO:29，HCDR2：SEQ ID NO:30，和HCDR3：SEQ ID NO:31；m)HCDR1：SEQ ID NO:23，HCDR2：SEQ ID NO:32，和HCDR3：SEQ ID NO:33。
- 根据权利要求33-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括VHH。
- 根据权利要求33-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:39、34、35、36、37、38、44、40、41、42、43、45和46任一项所示的氨基酸序列。
- 分离的核酸分子，其编码权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
- 根据权利要求43所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:47-59和/或SEQ ID NO:73-85中任一项所示的核酸序列。
- 载体，其包含权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子。
- 根据权利要求45所述的载体，其包括病毒载体。
- 根据权利要求45-46中任一项所述的载体，其包括慢病毒载体。
- 细胞，其包含权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子，和/或权利要求45-47中任一项所述的载体。
- 根据权利要求48所述的细胞，其包括免疫细胞。
- 根据权利要求48-49中任一项所述的细胞，其中所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
- 根据权利要求48-50中任一项所述的细胞，其包括T细胞。
- 根据权利要求48-51中任一项所述的细胞，其与相应的野生型细胞相比，所述细胞中CD70的表达和/或活性降低。
- 根据权利要求48-52中任一项所述的细胞，其与相应的野生型细胞相比，所述细胞敲除了CD70。
- 药物组合物，其包含权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求45-47中任一项所述的载体，权利要求48-53中任一项所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
- 权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求45-47中任一项所述的载体，权利要求48-53中任一项所述的细胞，和/或权利要求54所述的药物组合物，其用于治疗与CD70的表达相关的疾病或病症。
- 根据权利要求55所述的用途，其中所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓系白血病(AML)或肾癌。
- 权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求45-47中任一项所述的载体，权利要求48-53中任一项所述的细胞，和/或权利要求54所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与CD70的表达相关的疾病或病症。
- 根据权利要求57所述的用途，其中所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓系白血病(AML)或肾癌。
- 预防和/或治疗与CD70的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-32中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求33-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求43-44中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求45-47中任一项所述的载体，权利要求48-53中任一项所述的细胞，和/或权利要求54所述的药物组合物。
- 根据权利要求59所述的方法，其中所述与CD70的表达相关的疾病或病症包括急性髓性白血病(AML)或肾癌。
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