CN114990002B - 一种用于生产d-泛酸的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产D‑泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D‑泛酸的方法。所述发酵培养基组成包括:葡萄糖,硫酸铵,酵母提取物,胰蛋白胨,磷酸二氢钾,七水硫酸镁,β‑丙氨酸,VB12,VB1,盐溶液,异亮氨酸,异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷,硫酸卡那霉素,溶剂为水。本发明通过优化培养基组成及发酵参数,能有效提高菌体的生物量,大幅缩短泛酸积累地时间,通过变温控制能够有效改善菌体合成泛酸产量,发酵工艺便于控制,采用pH与补料联控,工艺简单,有利于后期实现工业大规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生产D-泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法。
背景技术
D-泛酸(DPA)又称维生素B5,是一种普遍存在于生物体体内的必需酸性物质。它也是辅酶a生物合成的重要前体,对生物的生长有重要的促进作用。近年来,DPA因其有良好的市场前景和价值,逐渐在食品、饲料、化妆品和制药等行业得到发展和应用。
D-泛酸的合成方法有三种:化学合成法、酶法和生物发酵法。目前,生产D-泛酸的化学合成方法较为成熟,并已在工业上得到广泛应用,其中D-泛酸钙是最终产品。如今,泛酸的工业生产仍然利用化学合成方法。酶法是选择性水解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯或D-泛解酸内酯,以得到单一的D-泛解酸内酯。饲料级DPA是通过在甲醇或乙醇环境中加热DPA的两种前体(D-泛解酸内酯和β-丙氨酸)获得的。化学合成过程有许多局限性,比如,氢氰酸和***造成严重的环境污染和人类危害。由于日益严重的环境污染问题和日益增长的环境意识,已经开始试验使用微生物发酵工艺生产DPA。
D-泛酸在微生物体内合成,由α-酮异戊酸和L-天冬氨酸两种物质经过四步酶促反应生成。四步反应中关键酶酮泛解酸羟甲基转移酶(PanB)、酮泛解酸还原酶(PanE)、L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)、泛酸合成酶(PanC)。PanB最适pH在7.0到7.6之间,最适温度在37℃。PanE 最适pH为7.5,最适温度为25℃。PanD最适温度为37℃,最适pH为7.0。PanC最适pH值为10.0,最适温度为30℃。
直接发酵法是在含有葡萄糖的培养基中,通过微生物菌体代谢β-丙氨酸产生D-泛酸;D-泛酸通过微生物发酵法主要是针对菌种以及培养基进行优化,鲜有对其发酵条件进行***考察。
发明内容
本发明的目的本发明是针对现有工艺技术中存在大肠杆菌生长慢,且D-泛酸产量较低的问题,提供一种用。于生产D-泛酸的发酵培养基以及利用该发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法
本发明采用的技术方案是:
一种用于生产D-泛酸的发酵培养基,组成如下:葡萄糖10~30g/L,硫酸铵5~20g/L,酵母粉1~8 g/L,胰蛋白胨1~8g/L,磷酸二氢钾0.5~2.0 g/L,七水硫酸镁0.1~1.0 g/L,β-丙氨酸 0.5~2 g/L,VB12 0.001~0.005 g/L,VB1 0.001~0.01 g/L,盐溶液0.5~2 mL/L,异亮氨酸80~200 mg/ L,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48~96 mg/L,抗生素硫酸卡那霉素0~100 mg/L(优选30~60 mg/L),溶剂为水;所述盐溶液组成如下:NiCl2·7H2O 0.02 g/L,CuCl2 10 g/L,FeSO4·7H2O 10 g/L,ZnSO4·7H2O 10 g/L,CuSO4 0.2 g/L,溶剂为水。
优选的,所述培养基组成如下:葡萄糖18~22g/L,硫酸铵5~15 g/L,酵母粉1~8 g/L,胰蛋白胨3~6 g/L,磷酸二氢钾0.6~0.8 g/L,七水硫酸镁0.4~0.6 g/L,β-丙氨酸 1.2~2g/L,VB12 0.002 g/L,VB1 0.005 g/L,盐溶液0.5~2 mL/L,异亮氨酸80~200 mg/ L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L,硫酸卡那霉素50 mg/L,溶剂为水。
本发明对发酵培养基配方进行了改进,有效缩短了泛酸产量达到40 g/L的时间。
本发明还涉及利用所述发酵培养基发酵生产D-泛酸的方法,所述方法包括:
(1)将菌株活化后进行种子培养,得到种子液;
(2)将种子液接种至发酵培养基,发酵时搅拌初始转速300~500 r/ min;通过搅拌和通风控制溶氧在15%~25% ;通过流加氨水控制pH在6.8~7.2;培养温度26.0℃~37℃;补料在pH>6.81时开始流加补料培养基,直至发酵结束。
所述补料培养基组成如下:葡萄糖500 g/L,硫酸铵10 g/L,酵母粉1~8 g/L,胰蛋白胨1~8 g/L,磷酸二氢钾14 g/L,七水硫酸镁16 g/L,β-丙氨酸40 g/L,VBl 0.01 g/ L,VB12 0.004 g/L,异亮氨酸160 mg/L,盐溶液2 mL/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 48 mg/L,硫酸卡那霉素100 mg/L。
所述活化培养基组成如下:蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L,pH 6.8~7.0。
所述种子培养基组成如下:蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L,pH 6.8~7.0。
发酵过程温度控制如下:发酵0~12 h,控制温度37℃;发酵12~36 h,控制温度30℃;发酵36~48 h,控制温度28℃;发酵48h直至发酵结束,控制温度26℃。
发酵过程pH控制如下:发酵0~36h,控制pH7.2;发酵36~48 h,控制pH6.8;发酵48h直至发酵结束,控制pH6.5。
本发明通过增加有机氮源的量补加菌体生长的营养物质,减少铵盐的量,减少NH4+对菌株生长的抑制,菌体生长阶段将温度由原来的30℃改为37℃,有效提高菌体生长速率。大肠杆菌耗氧量高,将搅拌与溶氧联控,有效控制在15%-25%,及时补充溶氧不足。补料与pH联控有效避免糖补加过量。连续变温降温,有利于酶的正确表达折叠,更加有利于酶的最适温度,促使泛酸高效合成。
本发明的有益效果主要体现在:本发明通过优化培养基组成及发酵发酵,能有效提高菌体的生物量,大幅缩短泛酸积累地时间,通过变温控制能够有效改善菌体合成泛酸产量,发酵工艺便于控制,采用pH与补料联控,工艺简单,有利于后期实现工业大规模化生产。
附图说明
图1为不同硫酸卡那霉素添加量下OD值和泛酸产量;
图2为不同异亮氨酸添加量下OD值和泛酸产量;
图3为不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷添加量下OD值和泛酸产量;
图4为在不同氮源培养基下OD值和泛酸产量;
图5为实施例14和实施例16发酵过程泛酸和生物OD值对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,该菌株详见前期的专利申请:公开号为“CN113637618A”、发明名称为“一种D-泛酸生产菌、构建方法及应用 ”。从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度30℃,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,pH控制6.8,手动调整转速和通气量,维持溶氧在15%~25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
初始发酵培养基:葡萄糖20 g/L,硫酸铵16 g/L,酵母粉2 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,七水硫酸镁1 g/L,β-丙氨酸 1.5 g/L,VB12 0.002 g/L,VB1 0.005 g/L,盐溶液1 mL/L,异亮氨酸160 mg/ L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L,硫酸卡那霉素50 mg/L。
初始补料培养基:葡萄糖500 g/L,硫酸铵10 g/L,酵母粉2 g/L,磷酸二氢钾14 g/L,七水硫酸镁16 g/L,β-丙氨酸40 g/L,VBl 0.01 g/ L,VB12 0.004 g/L,异亮氨酸160 mg/L,盐溶液2 mL/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L,硫酸卡那霉素100 mg/L。
上述盐溶液配方为:NiCl2·7H2O 0.02 g/L,CuCl2 10 g/L,FeSO4·7H2O 10 g/L,ZnSO4·7H2O 10 g/L,CuSO4 0.2 g/L(下文中盐溶液均为该配方)。
发酵84 h结束,OD值52.8,泛酸产量为17.8 g/L。
实施例2:
以案例1中原始发酵培养基为基础,单因素考察硫酸卡那霉素不同添加量对Escherichia coli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响,硫酸卡那霉素添加量分别为:0mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。
从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12h,得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶(装液量50 mL/250 mL)培养,37 ℃,180 r/min摇床培养12 h,获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基,30 ℃ ,150 rpm,培养48 h,进行取样离心,测量OD值及泛酸含量。
硫酸卡那霉素添加量考察如附图1所示,摇瓶结果显示,不添加硫酸卡那霉素,菌株表达合成D-泛酸不受影响,添加量依次增加至200 mg/L,对泛酸合成促进作用没有很明显,生物量OD值都在6~7之间变化。硫酸卡那霉素的作用一是防止菌体在传代过程中质粒丢失,二是在发酵过程中,防止其他菌体污染,所以在试验在0~200 mg/L对泛酸和生长影响不是很大。
实施例3:
以案例1中原始发酵培养基为基础,考察异亮氨酸不同添加量对Escherichiacoli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响,添加量分别为:0 mg/L、160 mg/L、320 mg/L、640 mg/L。
实验流程:从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶(装液量50mL/250 mL)培养,37 ℃,180 r/min摇床培养12 h,获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基,30 ℃ ,150 rpm,培养48 h,进行取样离心,测量OD值及泛酸含量。
异亮氨酸添加量考察如附图2所示,结果显示不添加异亮氨酸的批次菌体的生物量OD值明显低于添加异亮氨酸的,随着异亮氨酸添加量增加,生物量变化不是很大。不添加异亮氨酸的批次D-泛酸产量最高,随着异亮氨酸添加增加,D-泛酸依次减少。所以异亮氨酸添加量控制在0~320 mg/L较好,太低不利于菌体生长,太高又会反馈抑制泛酸合成。
实施例4:
以案例1中原始发酵培养基为基础,考察异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对Escherichia coli DPA11A合成D-泛酸和生物生长的影响,添加量分别为:0 mg/L、48 mg/L、96 mg/L。
从保藏的工作库中将Escherichia coli DPA11A菌液接入到试管培养基活化后12h,得到活化的种子液。以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶(装液量50 mL/250 mL)培养,37 ℃,180 r/min摇床培养12 h,获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基,30 ℃ ,150 rpm,培养48 h,进行取样离心,测量OD值及泛酸含量。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)不同添加量对D-泛酸合成和菌株生长的影响如附图3所示,不添加诱导剂IPTG,D-泛酸不表达。添加48 mg/L IPTG 泛酸表达,增加至96mg/L时,生物量和泛酸有微弱下降。
实施例5:
氮源单因素优化过程中,以实施例1中不含氮源的简单复合原始发酵培养基(不含氮源,其他组分同实施例1)的基础上,以2%的添加量考察不同有机氮源或无机氮源:胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸铵、氯化铵、玉米浆,筛选最佳用以生长和合成泛酸的氮源。
实验室保藏菌株Escherichia coli DPA11A种子液,以1%的接种量接种至装有LB培养基三角瓶(装液量50 mL/250 mL)培养,37 ℃,180 r/min摇床培养12 h,获得种子液。将种子液以1%接种量接到摇瓶发酵培养基,30 ℃ ,150 rpm,培养48 h,进行取样离心,测量OD值及泛酸含量。
氮源种类考察结果如附图4所示,摇瓶结果显示合成泛酸产量大小依次为:硫酸铵> 酵母粉 > 胰蛋白胨 > 尿素 > 玉米浆 > 大豆蛋白胨 > 氯化铵。氮源对菌体生长OD值大小影响为:酵母粉>胰蛋白胨 >玉米浆> 大豆蛋白胨> 硫酸铵> 尿素>= 氯化铵。
从上述的结果中发现,硫酸铵是所有的氮源中对Escherichia coli DPA11A合成泛酸最有利。对于菌株生长有利有机氮源都优于无机氮源,但是泛酸产量相对较低。为了促进菌体产生更多的泛酸,首先要使菌体的生物量增加,保证足够多的“微生物工厂”产生泛酸,因此在后期选取较优的酵母粉和胰蛋白胨作为考察对象。
实施例6:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度30℃,pH 6.8,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:葡萄糖20 g/L,硫酸铵16 g/L,酵母粉5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,七水硫酸镁1 g/L,β-丙氨酸 1.5 g/L,异亮氨酸0.04 g/L,VB12 0.002 g/L,VB1 0.005 g/L,盐溶液1 mL/L,异亮氨酸80~200 mg/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L,硫酸卡那霉素50 mg/L;
补料培养基:葡萄糖500 g/L,硫酸铵10 g/L,酵母粉2 g/L,胰蛋白胨2 g/L,磷酸二氢钾14 g/L,七水硫酸镁16 g/L,β-丙氨酸40 g/L,VBl 0.01 g/ L,VB12 0.004 g/L,异亮氨酸160 m g/L,盐溶液2 mL/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L,硫酸卡那霉素100mg/L;
发酵84 h结束,OD值51.24,泛酸产量为23.90 g/L。
实施例7:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度33℃,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到5 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值71.4,泛酸产量为12.76 g/L。
实施例8:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度35℃,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到5 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值111.45,泛酸产量为16.95 g/L。
实施例9:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度37℃,pH 6.8,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%~25%。pH>6.81开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值106.95,泛酸产量为19.82 g/L。
实施例10:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度30℃,pH 7.0,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>7.01开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值67.3,泛酸产量为29.32 g/L。
实施例11:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度30℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值145.8,泛酸产量为14.99 g/L。
实施例12:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度37℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值75.60,泛酸产量为31.18 g/L。
实施例13:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度37℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控,14h降温30℃。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值93.80,泛酸产量为39.86 g/L。
实施例14:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度37℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%。pH>7.21开始补料与pH联控,14h降温30℃,36 h降温28℃,48 h降温26℃。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值107.1,泛酸产量为42.27 g/L。
实施例15:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,初始培养温度37℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%;pH>7.21开始补料与pH联控。控制策略:14h降温30℃;36h降温28℃,pH调至6.8 ,pH>6.81补料联控;48h降温26℃,pH调至6.5,pH>6.51补料联控。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:与实施例6相同;
补料培养基:与实施例6相同;
发酵84 h结束,OD值126.6,泛酸产量为28.39 g/L。
实施例16:
试验菌株Escherichia coli DPA11A由浙江工业大学构建,从保藏的工作库中将大肠杆菌甘油管活化接入到试管培养基活化后12 h,得到活化的种子液。将活化的种子液以1%接种到三角瓶LB培养基(装液量100 mL/500 mL),37℃,150 rpm,培养9-10 h,再以10%接种到发酵罐。
发酵培养:接种量10%,发酵罐装液量1 L/2 L,培养温度37℃,pH 7.2,初始转速300 rpm,初始通气量2 L/min,搅拌溶氧联控,适当提高通气量,最大到4 L/min,维持溶氧在15%-25%;pH>7.21开始补料与pH联控。控制策略:F3培养条件37℃,pH7.2,12h降温30℃,36h降温28℃,48h降温26℃。
发酵84h结束后,用高效液相色谱测D-泛酸。
发酵培养基:葡萄糖20 g/L,硫酸铵16 g/L,酵母粉10 g/L,胰蛋白胨5 g/L,磷酸二氢钾2 g/L,七水硫酸镁1 g/L,β-丙氨酸 1.5 g/L,异亮氨酸0.04 g/L,VB12 0.002 g/L,VB1 0.005 g/L,盐溶液1 mL/L,异亮氨酸40 mg/ L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L,硫酸卡那霉素50 mg/L;
补料培养基:葡萄糖500 g/L,硫酸铵10 g/L,酵母粉5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,磷酸二氢钾14 g/L,七水硫酸镁16 g/L,β-丙氨酸40 g/L,VBl 0.01 g/ L,VB12 0.004 g/L,异亮氨酸0.16 g/L,盐溶液2 mL/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L,硫酸卡那霉素100mg/L;
发酵84 h结束,OD值102,泛酸产量为48.54 g/L。
将实施例1、6~12数据进行对比,结果如下表1所示:
表1:2L发酵罐实施例数据对比
备注:实施例1所用培养基及发酵条件为最初的工艺,实施例6~16为逐步改进工艺。
实施例6与实施例1相比,增加一定的有机氮源有利于D-泛酸合成,泛酸提高了44.4%。
在实施例6的基础上,考察温度对菌体生长及泛酸合成影响,结合实施例7、8、9发现温度越高,越利于菌体生长,相对的泛酸合成会随之下降;考察pH对菌体生长及泛酸合成影响,结合实施例10、11发现pH增大,有利于菌体生长,但是对合成泛酸不利。结合泛酸合成过程相关酶的特性,设计实施例12,将温度37℃和pH7.2结合,泛酸合成达到31.18 g/L,突破30 g/L。
大肠杆菌因为原核生物,37℃发酵培养,虽利于生长,但不利于表达酶的正确折叠,易形成包涵体,因此,在保证生长的前提下,通过阶段性降温减缓生长速率有利于泛酸合成。以实施例13发酵工艺控制,泛酸合成达到39.86 g/L。以实施例14工艺进一步降温,泛酸产量达到42.27 g/L,突破40 g/L。
后一步继续提高有机氮源含量,适当降低NH4+的量,有效补充生长所需的营养物质,减少NH4+对菌体生长的抑制。以实施例16为例,泛酸产量达到48.54 g/L。改进后培养基可以提前一天实验产量在40g/L,生长较快,产量较之前有一定提高,提高了10.59%,如附图1所示。
Claims (3)
1.一种发酵生产D-泛酸的方法,所述方法包括:
(1)将菌株活化后进行种子培养,得到种子液;
(2)将种子液接种至发酵培养基,发酵时搅拌初始转速300~500 r/ min;通过搅拌和通风控制溶氧在15%~25% ;通过流加氨水控制pH;培养温度26.0℃~37℃;补料在pH>6.81时开始流加补料培养基,直至发酵结束;所述发酵培养基组成如下:葡萄糖18~22g/L,硫酸铵5~15 g/L,酵母粉1~8 g/L,胰蛋白胨3~6 g/L,磷酸二氢钾0.6~0.8 g/L,七水硫酸镁0.4~0.6g/L,β-丙氨酸 1.2~2 g/L,VB12 0.002 g/L,VB1 0.005 g/L,盐溶液0.5~2 mL/L,异亮氨酸80~200 mg/ L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷48 mg/L,硫酸卡那霉素50 mg/L,溶剂为水;所述补料培养基组成如下:葡萄糖500 g/L,硫酸铵10 g/L,酵母粉1~8 g/L,胰蛋白胨1~8 g/L,磷酸二氢钾14 g/L,七水硫酸镁16 g/L,β-丙氨酸40 g/L,VBl 0.01 g/ L,VB12 0.004 g/L,异亮氨酸160 mg/L,盐溶液2 mL/L,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 96 mg/L,硫酸卡那霉素100mg/L;
发酵过程温度控制如下:发酵0~12 h,控制温度37℃;发酵12~36 h,控制温度30℃;发酵36~48 h,控制温度28℃;发酵48h直至发酵结束,控制温度26℃;
发酵过程pH控制如下:发酵0~36h,控制pH7.2;发酵36~48 h,控制pH6.8;发酵48h直至发酵结束,控制pH6.5。
2.如权利所述要求1所述的方法,其特征在于所述活化培养基组成如下:蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L,pH 6.8~7.0。
3.如权利所述要求1所述的方法,其特征在于所述种子培养基组成如下:蛋白胨10g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 10 g/L,pH 6.8~7.0。
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