CN111675758A - 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，其包含编码基因序列如SEQ ID NO：1所示的重组蛋白。本发明通过对Eg95蛋白进行优化，并以之制备抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，所获疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对羊还没有致病性，同时本发明利用CHO细胞等表达优化后的Eg95蛋白，不仅糖基化水平高，可溶性强，表达量高(能达到2‑3g/L)，还可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

Description

一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，其制备方法与应用，属于动物免疫药物技术领域。

背景技术

包虫病(Hydatidosis，Hydatid Disease)又称棘球蚴病(Echinococcosis)或囊性包虫病(Cystic Echinococcosis，CE)，是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)或多房棘球绦虫(E.multilocularis)的蚴虫感染绵羊和寄生在人体肝、肺等脏器所引起的一种***共患寄生虫病，是中国***规划防治的五大寄生虫病之一。该病流行广、致病能力强，而且难于防治，每年给我国造成较大的经济损失。棘球蚴病呈世界性分布，我国是棘球蚴病发病率最高的国家之一，农业部将其列为二类动物疫病。由于使用药物和包囊摘除的方法治疗包虫病的效果并不理想，因此对于该病来说目前主要以预防为主，基因工程疫苗以其高效性及特异性的特点成为预防该病最理想的方法。

Eg属于扁形动物门、绦虫纲、圆叶目、带绦虫科、棘球属。目前的研究已表明Eg中许多蛋白被证明在绦虫感染的过程中是具有抗原性的，它们可以作为防止Hydatidosis的疫苗候选分子。这些蛋白包括：耐热脂蛋白AgB、脂蛋白Ag5、P-29、E96、E914、脂肪酸连接蛋白FABP、EgA31以及Eg95等(朱佑明，李文桂.细粒棘球绦虫分子生物学研究进展[J].中国寄生虫病防治杂志，2005，18(3)：217-220.)。其中Eg95蛋白是迄今为止发现的最有效的保护性抗原。Eg95蛋白是一种天然六钩蚴抗原，其编码基因全长为715bp，相对分子质量是24.5kDa(Lightowlers M W，Law rence SB，Gauci CG，et al.Vaccination against hydatidoisusing a defined recombinant antigen[J].Parasite Immunol，1996，18(9)：457-462.DOI：10.1111/j.1365-3024.1996.tb01029)。Eg95蛋白含纤连蛋白III型结构域，与免疫蛋白超家族、细胞黏附分子、细胞表面受体和糖结合蛋白有部分同源性，在Eg六钩蚴入侵小肠绒毛上皮的过程中起重要作用。有研究表明Eg95基因在细粒棘球绦虫不同生长阶段均有表达，能用于动物棘球蚴病的有效免疫预防，用其表达产物制成的疫苗保护率高达96％-100％。

近20年来各位学者在研究棘球蚴疫苗上做了大量工作，包括通过大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒、根瘤农杆菌等***表达相关重组蛋白的基因工程疫苗。如CN108066755A提供了一种利用大肠杆菌表达***表达得到重组Eg95蛋白从而制备基因工程亚单位疫苗的方法，但是大肠杆菌表达***表达蛋白的折叠型较差，且易形成包涵体，因此表达量较低。又如，CN102732436A公开了一种毕赤酵母重组表达Eg95蛋白的方法，其用甲醇作为诱导剂有一定的危害，且毕赤酵母表达***的糖基化水平相对较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种重组蛋白，包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白的编码基因，其包括序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO：1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例还提供了包含所述编码基因的重组载体。

本发明实施例还提供了包含所述编码基因的宿主细胞，主要为哺乳动物细胞。

进一步的，所述宿主细胞可以由哺乳动物细胞被所述重组载体转染后获得。

本发明实施例还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的重组蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了一种制备所述重组蛋白的方法，其包括：

构建重组表达载体，所述重组杆表达载体包含所述的重组蛋白的编码基因；

将所述重组表达载体导入宿主细胞中，并在允许蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞，之后从所述宿主细胞的细胞培养物中分离和回收重组蛋白。

本发明实施例还提供了一种制备所述重组蛋白的制备方法，其包括：

将所述重组蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

将所述重组表达载体转染宿主细胞，通过选择、筛选得到悬浮稳定高效表达所述重组蛋白的宿主细胞；

发酵培养所述悬浮稳定高效表达重组蛋白的宿主细胞，之后从细胞培养物中分离、纯化所述重组蛋白。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备羊包虫检测试剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受羊包虫感染的药剂中的用途。

本发明实施例还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例提供了一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受羊包虫感染的试剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受羊包虫感染的药剂的用途。

较之现有技术，本发明实施例采用将Eg95蛋白与串联重复表位、羊IgG的Fc片段等组合的方式对Eg95蛋白进行优化，所获重组Eg95蛋白稳定，能够形成二聚体，且免疫效果好，利用所述重组蛋白制备的抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，只需要很少量就能提供很好的免疫效果，对羊等哺乳动物还没有致病性，同时本发明实施例利用CHO细胞等表达优化后的Eg95蛋白，不仅糖基化水平高，可溶性强，表达量高(能达到2-3g/L)，还可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是实施例1中密码子优化后Eg95的基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.3kbp位置出现目的条带。

图2是实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.3kbp位置出现目的条带。

图3是实施例1中真核表达载体pCI-Eg95-GS的结构示意图。

图4是实施例3所获细胞培养物的SDS-PAGE检测图谱。

图5是实施例4中SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面提供的一种重组蛋白包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

即，本发明实施例提供的重组Eg95蛋白序列可以是原始序列，增加或截短的序列。

进一步的，本发明实施例中通过将Eg95蛋白加上串联重复表位加上羊IgG的Fc片段，从而获得优化后的Eg95蛋白，该重组蛋白稳定，能够形成二聚体，免疫效果好。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述重组蛋白的编码基因，其包括序列如SEQ ID NO：1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO：1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类重组载体，其中包含有所述重组蛋白的编码基因。所述重组载体可以是真核表达载体，例如可以选自但不限于pSV2-GS、pCI-GS、pcDNA4-GS，优选为pCI-GS。

本发明实施例的另一个方面还提供了一类宿主细胞，其中包含有所述重组蛋白的编码基因。

进一步的，所述宿主细胞可以是用包含所述重组蛋白的编码基因的重组载体转染而形成。

进一步的，所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO细胞系，其可以选自但不限于DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株等，优选为CHO-S

本发明实施例的另一个方面还提供了一种免疫组合物，其包括：所述的重组蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。进一步的，所述医药学上可接受的载剂包括但不限于MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素等中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种制备所述重组蛋白的方法，其包括：

将所述重组蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

以所述重组表达载体转染宿主细胞，并筛选出悬浮稳定高效表达所述重组蛋白的宿主细胞，再发酵培养，之后从细胞培养物中分离和回收所述重组蛋白。

其中，所述真核表达载体、宿主细胞可以是如前所述。

在本发明的以上实施例中，通过采用真核表达***，并使用悬浮培养CHO细胞等宿主细胞进行表达，糖基化水平高，可溶性强，表达水平高(可达2-3g/L)，免疫效果好。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备羊包虫检测试剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在生产用于在受试动物中诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在生产用于预防动物受羊包虫感染的药剂中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述重组蛋白或所述免疫组合物在制备抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗中的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面提供了一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗，其包含前述的任一种免疫组合物。进一步的，所述疫苗还可包含医药学上可接受的载剂。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于检测动物受羊包虫感染的试剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于在受试动物中诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含所述重组蛋白编码基因的重组载体或宿主细胞在生产用于预防动物受羊包虫感染的药剂的用途。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向羊等受试动物施用所述抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗。

相应的，本发明实施例的另一个方面也涉及一种保护受试动物免受羊包虫感染的方法，所述方法包括向羊等受试动物施用所述抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗。

本发明实施例的另一个方面还提供一种适用于在受试动物中产生针对羊包虫感染的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的重组蛋白以及佐剂分子。

进一步的，所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方式中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

进一步的，所述佐剂可以优选采用苏州世诺生物技术有限公司生产的相关佐剂，以提高疫苗效果。

在一些实施方式中，一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗的制备方法具体包括：

1)克隆包含优化后的Eg95蛋白编码基因的真核表达载体；

2)转染CHO细胞，通过选择、筛选得到悬浮稳定高效表达Eg95蛋白的CHO细胞株；

3)发酵培养步骤2)筛选出的细胞株，纯化后得到重组Eg95蛋白；

4)将重组Eg95蛋白充分混合，然后与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

本发明以上实施例提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2-3g/L，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。

本说明书所用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

如本说明书所述的“佐剂”意指被添加到本说明书所述的疫苗中来增强由下文所述编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本说明书所述的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab′)2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本说明书所述的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本说明书所述的“免疫反应”意指响应于抗原如羊包虫感染共有抗原的引入，宿主的免疫***(例如动物的免疫***)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本说明书所述的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

在本说明书中，核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

在本说明书中，所述编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

在应用时，可将本发明的重组蛋白与医药学上可接受的载体，制成亚单位疫苗组合物，将有效量接种于羊等哺乳动物。在一实施例中，前述医药学上可接受的载剂包含佐剂及/或免疫增效剂，其中前述佐剂的种类不限，其具体例子可包括但不限于铝胶佐剂、油质佐剂(例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等)或上述的任意组合。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明中通过使用真核表达***和CHO细胞表达重组蛋白，所获重组蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对羊等动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，也大大降低了疫苗生产成本，可以大规模批量生产，质控容易，安全性高，免疫原性好，批次间稳定。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1重组真核表达载体pCI-Eg95-GS的构建

1.Eg95基因扩增与纯化在上海桑尼生物科技有限公司合成了密码子优化后的Eg95基因(SEQ ID NO：1)并克隆到pUC-57载体上，得到pUC-Eg95质粒载体。以pUC-Eg95作为模板，Eg95-F、Eg95-R作为引物进行PCR扩增(Eg95-F、Eg95-R的基因序列如SEQ ID NO：3、4所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 Eg95基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.3kbp附近的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切将pCI-GS质粒和纯化后的Eg95基因PCR产物分别使用Hind III、EcoR I 37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 Eg95基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接将酶切过的pCI-GS质粒和Eg95基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 Eg95基因与pCI-GS质粒连接体系

4.转化取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，Eg95-F和Eg95-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.3kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-Eg95-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

实施例2表达Eg95蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞 取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2质粒与细胞混合 取实施例1中pCI-Eg95-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转 280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板 稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

另外按照上面的实施例方法构建表达如表5所示蛋白的细胞株：

表5

实施例3 SDS-PAGE检测

将实施例2中收获的Eg95蛋白的细胞培养物上清以及将Eg95蛋白细胞培养物上清使用糖苷内切酶Endo H_f处理后进行SDS-PAGE检测，同时设置将Eg95蛋白的细胞培养物上清加入没有添加β-巯基乙醇的上样缓冲溶液中进行SDS-PAGE检测，并使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×SDS凝胶上样缓冲液(取1mol/l Tris-HCI(pH6.8)1.25mL，溴酚蓝25mg，甘油2.5ml，SDS 0.5g溶于ddH₂O中，定容至5mL，0.5mL/管分装，室温保存，使用前每管加入25μl β-巯基乙醇混匀)，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图4所示，Eg95蛋白在分子量约45kDa附近出现目的条带，使用糖苷内切酶Endo Hf处理后的Eg95蛋白在分子量约42kDa附近出现目的条带，不加β-巯基乙醇的对照组在分子量约90kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例4 Western Blot检测

将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，羊源抗Eg95阳性血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的兔抗羊多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例5蛋白含量与琼扩检测

将实施例2中收获的CHO细胞培养上清液中Eg95蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释羊抗Eg多抗血清至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1％BSA封闭1h。加入不同浓度的抗原标准品(通过粒子交换层析，疏水层析，分子筛纯化得到的蛋白)和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测Eg95蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-即HRP标记的兔抗羊IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Eg95蛋白的量。

按照实施例5，大规模制备的Eg95蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的平均含量达到2.43g/L。

使用琼扩方法检测表达的Eg95蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入Eg琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：Eg95蛋白琼扩效价为1：2048。

实施例6疫苗制备

将适量CHO细胞表达的Eg95蛋白稀释后加入到MONTANIDE ISA 201VG佐剂中(体积比为46∶54)，使得最终蛋白浓度为100μg/ml，乳化，质检合格后置于4℃保存。以同样的方法将实施例2中的对照1组、对照2组和对照3组分别制备成疫苗。

实施例7免疫实验

试验一：

用4～6月龄绵羊50头，随机分为5组，每组10只，其中4组为免疫组，分别颈部皮下注射实施例6中制备亚单位疫苗1ml(疫苗浓度调至50μg/ml)，另外1组为不免疫阴性对照组，首次免疫四周后加强免疫一次。分别首免前、一免后14天、28天、42天(二免后14天)、56天(二免后28天)分别进行颈静脉采血，分离血清，使用IDXEE公司抗体ELISA试剂盒进行抗体检测，结果如表6所示。

表6

结果判定：OD_450nm≤0.3±0.05，判为阴性；OD_450nm＞0.6±0.05，判为阳性

试验二：

在免疫后一周采集抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，分装6板，分别采用100μl疫苗进行刺激，24h收集上清，用于细胞因子ELISA的检测。分别采用绵羊IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α ELISA试剂盒进行检测，具体操作如下：在酶标包被板上标准品加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动摇匀。用封板膜封板后置37℃温育30min，去液体甩干，每孔加洗涤液静置30秒后弃去，如此重复五次，拍干。除空白板每孔加入酶标试剂50μl，同上温育洗涤。每孔加入显色剂A50μl和B50μl，摇匀，37℃避光显色15min。每孔加终止液50μl，终止反应。在15min以内，以450nm波长依序测量吸光度。具体结果见表7。

表7

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacagga atacaaaggt atgggtgtgg agacccgcac caccgaaacg 120

cccctgcgca aacacttcaa cctgacgcct gtcggttccc agggtatccg cctgtcctgg 180

gaggtgcaac acctgagtga cctgaagggt actgacatct ccctcaaagc cgtgaaccct 240

tccgaccccc tcgtctacaa acgccaaacc gctaagttct ccgacggtca actgaccatt 300

ggtgagctca aaccctccac cctgtataaa atgaccgtgg aggccgtaaa ggccaaaaag 360

accatcctcg gtttcaccgt ggacatcgaa accccccgcg ctggtaaaaa ggagtccacc 420

gtgtccgacg gtcaactgac cattggtgag ctcaaaccct ccaccctgta taaaatgacc 480

gtgtccgacg gtcaactgac cattggtgag ctcaaaccct ccaccctgta taaaatgacc 540

gtgcccggat gcccggaccc atgcaaacat tgccgatgcc caccccctga gctccccgga 600

ggaccgtctg tcttcatctt cccaccgaaa cccaaggaca cccttacaat ctctggaacg 660

cccgaggtca cgtgtgtggt ggtggacgtg ggccaggatg accccgaggt gcagttctcc 720

tggttcgtgg acaacgtgga ggtgcgcacg gccaggacaa agccgagaga ggagcagttc 780

aacagcacct tccgcgtggt cagcgccctg cccatccagc accaagactg gactggagga 840

aaggagttca agtgcaaggt ccacaacgaa gccctcccgg cccccatcgt gaggaccatc 900

tccaggacca aagggcaggc ccgggagccg caggtgtacg tcctggcccc accccaggaa 960

gagctcagca aaagcacgct cagcgtcacc tgcctggtca ccggcttcta cccagactac 1020

atcgccgtgg agtggcagaa aaatgggcag cctgagtcgg aggacaagta cggcacgacc 1080

acatcccagc tggacgccga cggctcctac ttcctgtaca gcaggctcag ggtggacaag 1140

aacagctggc aagaaggaga cacctacgcg tgtgtggtga tgcacgaggc tctgcacaac 1200

cactacacac agaagtcgat ctctaagcct ccgggtaaac atcatcatca tcatcattga 1260

tgagaattc 1269

<210> 2

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr

20 25 30

Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser

35 40 45

Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys

50 55 60

Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val

65 70 75 80

Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly

85 90 95

Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys

100 105 110

Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg

115 120 125

Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly

130 135 140

Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Ser Asp Gly Gln

145 150 155 160

Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val

165 170 175

Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu

180 185 190

Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

210 215 220

Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn

225 230 235 240

Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

245 250 255

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp

260 265 270

Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu Pro

275 280 285

Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu

290 295 300

Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile

325 330 335

Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr

340 345 350

Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr

355 360 365

Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr

370 375 380

Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

385 390 395 400

Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys His His His His His His

405 410

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcc 34

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

gaattctcat caatgatgat gatgatgatg tttacccgga ggcttagag 49

<210> 5

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacagga atacaaaggt atgggtgtgg agacccgcac caccgaaacg 120

cccctgcgca aacacttcaa cctgacgcct gtcggttccc agggtatccg cctgtcctgg 180

gaggtgcaac acctgagtga cctgaagggt actgacatct ccctcaaagc cgtgaaccct 240

tccgaccccc tcgtctacaa acgccaaacc gctaagttct ccgacggtca actgaccatt 300

ggtgagctca aaccctccac cctgtataaa atgaccgtgg aggccgtaaa ggccaaaaag 360

accatcctcg gtttcaccgt ggacatcgaa accccccgcg ctggtaaaaa ggagtccacc 420

gtgtccgacg gtcaactgac cattggtgag ctcaaaccct ccaccctgta taaaatgacc 480

gtgtccgacg gtcaactgac cattggtgag ctcaaaccct ccaccctgta taaaatgacc 540

gtgcatcatc atcatcatca ttgatgagaa ttc 573

<210> 6

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacagga atacaaaggt atgggtgtgg agacccgcac caccgaaacg 120

cccctgcgca aacacttcaa cctgacgcct gtcggttccc agggtatccg cctgtcctgg 180

gaggtgcaac acctgagtga cctgaagggt actgacatct ccctcaaagc cgtgaaccct 240

tccgaccccc tcgtctacaa acgccaaacc gctaagttct ccgacggtca actgaccatt 300

ggtgagctca aaccctccac cctgtataaa atgaccgtgg aggccgtaaa ggccaaaaag 360

accatcctcg gtttcaccgt ggacatcgaa accccccgcg ctggtaaaaa ggagtccacc 420

gtgcccggat gcccggaccc atgcaaacat tgccgatgcc caccccctga gctccccgga 480

ggaccgtctg tcttcatctt cccaccgaaa cccaaggaca cccttacaat ctctggaacg 540

cccgaggtca cgtgtgtggt ggtggacgtg ggccaggatg accccgaggt gcagttctcc 600

tggttcgtgg acaacgtgga ggtgcgcacg gccaggacaa agccgagaga ggagcagttc 660

aacagcacct tccgcgtggt cagcgccctg cccatccagc accaagactg gactggagga 720

aaggagttca agtgcaaggt ccacaacgaa gccctcccgg cccccatcgt gaggaccatc 780

tccaggacca aagggcaggc ccgggagccg caggtgtacg tcctggcccc accccaggaa 840

gagctcagca aaagcacgct cagcgtcacc tgcctggtca ccggcttcta cccagactac 900

atcgccgtgg agtggcagaa aaatgggcag cctgagtcgg aggacaagta cggcacgacc 960

acatcccagc tggacgccga cggctcctac ttcctgtaca gcaggctcag ggtggacaag 1020

aacagctggc aagaaggaga cacctacgcg tgtgtggtga tgcacgaggc tctgcacaac 1080

cactacacac agaagtcgat ctctaagcct ccgggtaaac atcatcatca tcatcattga 1140

tgagaattc 1149

<210> 7

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacagga atacaaaggt atgggtgtgg agacccgcac caccgaaacg 120

cccctgcgca aacacttcaa cctgacgcct gtcggttccc agggtatccg cctgtcctgg 180

gaggtgcaac acctgagtga cctgaagggt actgacatct ccctcaaagc cgtgaaccct 240

tccgaccccc tcgtctacaa acgccaaacc gctaagttct ccgacggtca actgaccatt 300

ggtgagctca aaccctccac cctgtataaa atgaccgtgg aggccgtaaa ggccaaaaag 360

accatcctcg gtttcaccgt ggacatcgaa accccccgcg ctggtaaaaa ggagtccacc 420

gtgcatcatc atcatcatca ttgatgagaa ttc 453

Claims (10)

1.一种重组蛋白，包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述重组蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因包括序列如SEQ IDNO：1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO：1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

3.包含权利要求2所述编码基因的重组载体；优选的，所述重组载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS，尤其优选为pCI-GS。

4.包含权利要求2所述编码基因的宿主细胞；优选的，所述宿主细胞包括CHO细胞系，优选自DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株，尤其优选为CHO-S细胞。

5.一种免疫组合物，其特征在于包括：权利要求1所述的重组蛋白；以及，医药学上可接受的载剂。

6.如权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于：所述医药学上可接受的载剂包括MONTANIDE ISA 206 VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素中的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 201 VG。

7.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于包括：

将权利要求1所述重组蛋白的编码基因克隆到真核表达载体上，获得重组表达载体；

以所述重组表达载体转染宿主细胞，并筛选出悬浮稳定高效表达所述重组蛋白的宿主细胞，再发酵培养，之后从细胞培养物中分离和回收所述重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS，优选为pCI-GS；和/或，所述宿主细胞包括CHO细胞系，优选自DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株，尤其优选为CHO-S细胞。

9.如权利要求1所述重组蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在制备羊包虫检测试剂，在生产用于在受试动物中诱导针对羊包虫抗原的免疫反应的药剂，或者，在生产用于预防动物受羊包虫感染的药剂中的用途。

10.如权利要求1所述重组蛋白或权利要求5或6所述免疫组合物在制备抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗中的用途。

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