CN114980801A - 阿尔茨海默氏病的评价和治疗方法及其应用 - Google Patents

阿尔茨海默氏病的评价和治疗方法及其应用 Download PDF

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Abstract

描述了确定阿尔茨海默氏病的风险的方法及其应用。通常，***和方法利用分析物测量，诸如二羧酸水平，以确定阿尔茨海默氏病的风险。基于阿尔茨海默氏病风险，可以进行诊断或治疗。

Description

阿尔茨海默氏病的评价和治疗方法及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月12日提交的Fonteh等人的标题为“阿尔茨海默氏病的评价和治疗方法及其应用”的美国临时申请系列号62/860,672的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容一般涉及评价发生阿尔茨海默氏病的风险的方法(process)及其应用，且更具体地涉及用于评价与阿尔茨海默氏病相关的脂质代谢物的方法和***及其应用，包括治疗。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)是最常见的痴呆形式，是美国第六大死因，也是非洲裔美国人的第四大死因。AD的特征是脑中的细胞外β-淀粉样沉积物，随后是过度磷酸化的tau蛋白的细胞内神经原纤维缠结，并伴有神经元损失。所有减少痴呆中淀粉样沉积物的尝试在预防或减缓神经变性和认知功能方面都没有成功，因此努力现在集中于在病理学的早期阶段的治疗。但是，选择具有早期AD病理学的患者的方法受限于早期病理生理学的不完全了解以及预测认知健康(CH)个体中AD发病的生物标志物的缺乏。旨在改进这一选择过程的目的包括在具有常染色体显性AD的突变携带者中的临床试验，根据每个人的家族史，其估计的临床发病率更可靠。这种早发性障碍是罕见的，并且在病理学上与散发性AD不同，对于后者，非侵入性的、广泛使用的预测性生物标志物的缺乏是在症状出现之前适当地设计个体试验的重大瓶颈。
AD的主要的经验证的生物标志物在很大程度上依赖于AD的已知淀粉样蛋白/tau病理学的分子变化，表现为脑脊液(CSF)中β-淀粉样蛋白减少和tau增加，和/或通过正电子发射断层摄影术(PET)确定的脑淀粉样蛋白或tau增加。由于PET成像和CSF收集的侵入性、这些程序的高昂费用，这些技术并非可广泛得到或适用于许多患者，并且尽管可用于区分临床组，但它们在预测临床恶化的发作方面可能有10-20年的不准确度。来自侵入性研究的其它候选生物标志物包括脑脊液蛋白、tau或淀粉样蛋白的血液测量、代谢物或外来体；以及来自非侵入性尿液收集的神经丝蛋白(neural thread protein)。这些初步候选物都没有被接受或验证，并且人们仍然广泛认识到对更具预测性的分子生物标志物的需求。
发明内容
许多实施方案涉及基于他们的二羧酸量确定个体患阿尔茨海默氏病的风险的方法。在这些实施方案中的许多中，从个体获得生物样品并且确定生物样品中的二羧酸量。各种实施方案还针对基于具有阿尔茨海默氏病高风险的个体的进一步诊断试验和治疗。
在一个实施方案中，一种方法是确定个体患阿尔茨海默氏病的风险。所述方法获得个体的生物样品，其中所述生物样品含有二羧酸。所述方法将二羧酸分子的内标添加到生物样品中。并且所述方法对生物样品进行测定以确定样品中至少一个长二羧酸种类的量。至少一个长二羧酸种类(species)的确定量指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
在另一个实施方案中，生物样品是尿液。
在另一个实施方案中，所述测定是与质谱法组合的气相色谱法。
在另一个实施方案中，所述方法在进行与质谱法组合的气相色谱法之前进一步将生物体内的二羧酸转化为双五氟苄基酯。
在又一个实施方案中，二羧酸分子的内标包括琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)或癸二酸(C10)。
在另一个实施方案中，二羧酸分子的内标是一组具有已知浓度的氘代二羧酸分子。
在再另一个实施方案中，至少一个长二羧酸种类的量是测量的一组一个或多个二羧酸种类的相对量。
在再另一个实施方案中，至少一个长二羧酸种类的量是浓度。
在再另一个实施方案中，个体的至少一个长二羧酸种类的确定量大于阈值。并且基于至少一个长二羧酸种类的量大于阈值，确定所述个体具有患阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，至少一个长二羧酸种类是庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)、癸二酸(C10)、不饱和的C7、C8、C9或C10二羧酸种类或被取代的C7、C8、C9或C10二羧酸种类。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步对生物样品进行测定以确定样品中至少一个短二羧酸种类的相对量。并且所述方法确定至少一个长二羧酸种类的相对量与至少一个短二羧酸种类的相对量的比率。确定的比率指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
在再另一个实施方案中，所确定的个体比率大于阈值，并且其中基于该比率大于阈值，确定所述个体具有患阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率。
在再另一个实施方案中，至少一个短二羧酸种类是琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、不饱和的C4或C5二羧酸种类或被取代的C4或C5二羧酸种类。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步获得个体的至少第二生物样品。每个获得的生物样品含有二羧酸，并且在两个不同的时间点获得至少两个生物样品。所述方法将二羧酸分子的内标添加到每个生物样品中。并且所述方法对每个生物样品进行测定以确定至少一个长二羧酸种类的浓度。至少一个长二羧酸种类的浓度随时间的变化(temporalchange)指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
在再另一个实施方案中，长二羧酸种类的浓度随时间的增加指示阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，大于阈值的长二羧酸种类的浓度随时间的增加指示阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中长二羧酸种类的浓度随时间的增加。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步对生物样品进行测定以确定每个样品中至少一个短二羧酸种类的浓度。并且所述方法确定在每个时间点至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率。所确定比率的时间变化指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
在再另一个实施方案中，至少一个长二羧酸种类的浓度随时间增加至至少一个短二羧酸种类的浓度指示阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，大于阈值的至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率随时间的增加指示阿尔茨海默氏病的高风险。
在再另一个实施方案中，阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率随时间的增加。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步确定，所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中。并且所述方法施用诊断试验以进一步评估个体的阿尔茨海默氏病。
在再另一个实施方案中，所述诊断试验是认知试验、神经心理学试验或医学成像。
在再另一个实施方案中，所述诊断试验是小型精神状态检查(Mini Mental StateExam)或蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment)。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步确定，所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中。并且所述方法对个体的阿尔茨海默氏病施用认知锻炼。
在再另一个实施方案中，所述认知锻炼是利用记忆、推理或信息处理中的至少一种的活动。
在再另一个实施方案中，所述方法进一步确定，所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中。并且所述方法为个体的阿尔茨海默氏病施用药物。
在再另一个实施方案中，所述药物是胆碱酯酶抑制剂或N-甲基D-天冬氨酸(asparate)受体激动剂。
附图说明
参考以下附图和数据图将更全面地理解说明书和权利要求，它们作为本发明的示例性实施方案呈现并且不应解释为本发明的范围的完整叙述。
图1A解释了根据本发明的一个实施方案，基于源自二羧酸测量数据的他们的AD风险来治疗个体的方法。
图1B解释了根据本发明的一个实施方案确定相对二羧酸浓度的方法。
图2提供的饼图详细说明了根据本发明的各种实施方案使用的健康个体的尿液中的DCA的平均比例。
图3提供的条形图详细说明了根据本发明的各种实施方案使用的阿尔茨海默氏病患者(AD)和健康对照(CH)之间的各种DCA种类的差异。
图4A和4B各自提供了一个点图，其详细说明了根据本发明的各种实施方案使用的AD患者、具有病理性淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-PAT)和具有正常淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-NAT)之间的各种DCA种类的差异。
图5提供的图对比了根据本发明的各种实施方案使用的AD患者、具有病理性淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-PAT)和具有正常淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-NAT)中的短DCA种类(C4+C5)和长DCA种类(C7+C8+C9)。
图6提供的ROC曲线显示了根据本发明的各种实施方案使用的区分具有病理性淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-PAT)和具有正常淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-NAT)的特异性和灵敏性。
图7至11各自提供的图描绘了根据本发明的各种实施方案使用的在AD患者和健康对照中各种DCA种类与临床协变量的Spearman相关性。
图12提供的方案解释了根据本发明的各种实施方案使用的区分AD患者、具有病理性淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-PAT)和具有正常淀粉样蛋白/tau的健康对照(CH-NAT)的各种DCA种类之间的相关性。
图13提供了根据本发明的一个实施方案通过气相色谱法和质谱法联用测定的各种DCA种类的光谱描述。
发明详述
现在转向附图和数据，根据本发明的各种实施方案，描述了基于其阿尔茨海默氏病(AD)的风险的评估和治疗个体的方法和过程(process)及其应用。在几个实施方案中，收集个体的分析物测量值并用于确定个体的AD风险。在某些实施方案中，将脂质代谢物用于确定AD风险；在某些特定实施方案中，将二羧酸(DCA)用于确定AD风险。许多实施方案利用个体的AD风险确定来对该个体进行进一步的诊断或治疗。在某些情况下，要进行的诊断是认知试验、神经心理学试验、医学成像或其任意组合。在某些情况下，要进行的治疗可以包括药物、饮食补充物、认知锻炼和其任意组合。
几个实施方案利用DCA的相对浓度来评估个体的AD风险。应当理解，DCA包括不饱和的和/或被取代的DCA。基于最近的研究发现，现在理解，随着AD发展，在尿***中的各种DCA会增加或减少。此外，能够在认知减退开始之前及早检测到DCA选区(constituency)的变化。基于这些发现，在某些实施方案中，琥珀酸(C4)和/或戊二酸(C5)的相对减少指示AD病理学。以类似的方式，在某些实施方案中，庚二酸(C7)、辛二酸(C8)和/或壬二酸(C9)的相对增加指示AD病理学。并且在某些实施方案中，短DCA(C4+C5)的量的减少和/或长DCA(C7+C8+C9)的量的增加指示AD病理学。在某些实施方案中，DCA的相对比率用于确定AD风险。
指示AD风险的分析物
根据本发明的一个实施方案，使用分析物测量来确定个体的AD风险的方法显示在图1A中。该实施方案涉及确定个体的DCA的相对浓度。在某些实施方案中，所获得的知识用于执行进一步诊断和/或治疗个体。例如，该方法可以用于鉴定具有指示AD风险的特定DCA选区的个体，并用药物、饮食补充物、认知锻炼或其任意组合治疗该个体。
在许多实施方案中，待测量的分析物是脂质代谢物，尤其是DCA。存在许多在尿液中代谢和***的DCA，包括琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、己二酸(C6)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)、癸二酸(C10)、不饱和的DCA和被取代的DCA。不饱和的DCA是具有至少一个碳-碳双键的DCA，并且包括(但不限于)马来酸、富马酸、葡糖酸、愈伤酸、粘康酸(muconicacid)、戊炔二酸(glutinic acid)、柠康酸(citraconic acid)、甲基富马酸(mesconicacid)和衣康酸(itaconic acid)。被取代的DCA是其上连接了有机基团的DCA，所述有机基团包括(但不限于)羟基、氧代和氨基取代基。被取代的DCA的例子包括(但不限于)羟丙二酸、丙酮二酸、苹果酸、酒石酸、草酰乙酸、丙酮二羧酸、α-羟基戊二酸、α-酮戊二酸、二氨基庚二酸和葡糖二酸。现在已知DCA的相对浓度指示AD病理学，即使在认知减退开始之前的早期阶段。因此，一组DCA(包括不饱和的和被取代的DCA)的测量可以用于评估个体的AD风险。在某些实施方案中，使用分析物测量代替标准AD诊断试验。在各种实施方案中，分析物测量用于确定是否应当通过随后的诊断试验(诸如神经学试验和医学成像)进一步评估个体的AD。
方法100开始于从个体获得和测量(101)分析物，诸如DCA。在许多情况下，从尿液样品中测量分析物，但在某些情况下，可以使用其它来源，诸如血液提取、粪便样品或活组织检查。在某些实施方案中，在禁食期间或在受控的临床评估中提取个体的分析物。已知许多从个体中提取分析物的方法，并且可以用于本发明的各种实施方案中。在几个实施方案中，在一段时间内提取分析物并在每个时间点测量，从而导致分析物的动态分析。在这些实施方案的一些中，以周期性(例如，每月、每季、每年)测量分析物。
在许多实施方案中，个体是对其分析物提取和测量的任何个体。在某些实施方案中，个体尚未被诊断为患有AD或处于发生AD的风险中。在这些实施方案的一些中，个体是认知健康的或被诊断为认知健康的，如通过经典AD试验所确定的，所述经典AD试验包括(但不限于)神经学试验和医学成像。在这些实施方案的一些中，个体患有轻度痴呆或被诊断为轻度痴呆，如通过经典AD试验所确定的，所述经典AD试验包括(但不限于)神经学试验和医学成像。在许多这样的实施方案中，通过AD组织认可的标准确定AD评估，诸如由国家老龄化研究所(National Institute of Aging，NIA)提供的指南。应当理解，根据本发明的各种实施方案可以利用用于诊断的任何备受推崇的AD组织指南。
在几个实施方案中，要用于指示AD风险的分析物包括(但不限于)脂质，尤其是DCA。可以通过多种方法检测和测量DCA，所述方法包括色谱法和质谱法，尤其是气相色谱法和质谱法联用(GC-MS)。在几个实施方案中，将内标添加到含有DCA的样品中以进行测量。在某些实施方案中，标准品是具有已知浓度的氘代DCA。
在几个实施方案中，通过进行单个时间点测量来执行DCA测量。在许多实施方案中，通过在一段时间内进行多个时间点测量来执行DCA测量，这提供了DCA随时间的变化(增加或减少)。各种实施方案包含相关性，其可以通过多种方法计算，诸如Spearman相关性方法。许多实施方案利用包含分析物测量的计算模型，诸如线性回归模型。通过计算针对多个假设进行校正的p值，可以确定显著性。但是，应当指出，存在若干相关性、计算模型和统计方法，其可以利用分析物测量并且也可能落入本发明的一些实施方案内。
使用DCA的测量，方法100确定(103)个体的AD风险的指示。在许多实施方案中，相关性和/或计算模型可以用于指示AD风险的结果。在几个实施方案中，确定分析物相关性或建模AD风险被用于早期检测。在各种实施方案中，分析物的测量可以用作前体指示物以确定是否进行进一步诊断。
基于所进行的研究，已经发现几个DCA测量值与AD病理学相关，且因此可以作为替代物来确定AD风险。相关的DCA包括(但不限于)琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)、短DCA的组合(C4+C5)、和/或长DCA的组合(C7+C8+C9+C10)。在某些实施方案中，琥珀酸(C4)和/或戊二酸(C5)随时间的减少指示AD的高风险。以类似的方式，在某些实施方案中，庚二酸(C7)、辛二酸(C8)和/或壬二酸(C9)随时间增加指示AD的高风险。在某些实施方案中，随时间一种或多种短DCA种类(C4+C5)的量的减少和/或一种或多种长DCA种类(C7+C8+C9+C10)的量的增加指示AD的高风险。短和/或长DCA可以以任何适当的方式组合，所述方式包括(但限于)求和、平均和加权平均。
此外，DCA测量可以是DCA的浓度或DCA的相对量。DCA的相对量可以是相对于测量的一组一种或多种DCA。在某些情况下，每个DCA测量是特定DCA的量与测量的DCA的总量之比。
在某些实施方案中，分析长DCA与短DCA的比率，这可以以多种方式进行。在某些实施方案中，长DCA(C7+C8+C9+C10)与短DCA(C4+C5)的高比率指示AD的高风险。可替换地，短DCA(C4+C5)与长DCA(C7+C8+C9+C10)的低比率指示AD的高风险。同样，在某些实施方案中，长DCA(C7+C8+C9+C10)与短DCA(C4+C5)的比率随时间的增加，反之亦然，指示AD的高风险。应当理解，可以利用短DCA和长DCA之间的任何比率。因此，各种实施方案利用C4和/或C5(单独或组合)与C7和/或C8和/或C9和/或C10(单独或任何组合)的比率。
在某些实施方案中，利用阈值确定DCA测量或比率是否指示AD的高风险。例如，在某些实施方案中，大于阈值的一个或多个长DCA种类(C7+C8+C9+C10)的量指示AD的高风险。同样，在某些实施方案中，小于阈值的一个或多个短DCA种类(C4+C5)的量指示AD的高风险。在某些实施方案中，大于阈值的一个或多个长DCA种类(C7+C8+C9+C10)的量随时间的增加指示AD的高风险。在某些实施方案中，小于阈值的一个或多个短DCA种类(C4+C5)的量随时间的减少指示AD的高风险。在某些实施方案中，大于阈值的长DCA(C7+C8+C9+C10)与短DCA(C4+C5)的高比率指示AD的高风险。可替换地，小于阈值的短DCA(C4+C5)与长DCA(C7+C8+C9+C10)的低比率指示AD的高风险。同样，在某些实施方案中，大于阈值的长DCA(C7+C8+C9+C10)与短DCA(C4+C5)的比率随时间的增加，反之亦然，指示AD的高风险。可以通过任何适当的方式确定阈值。在各种实施方案中，通过认知健康的个体、患有AD的个体或其任何组合的群体的DCA测量和比率确定阈值。
确定个体的AD风险后，可以任选地对个体进行进一步的诊断或治疗(105)。在许多实施方案中，要进行的诊断是认知试验、神经心理学试验、医学成像或其任意组合。在许多实施方案中，要进行的治疗需要药物、饮食补充物、认知锻炼或其任意组合。在某些实施方案中，由医学专业人员(诸如医生、护士、营养师或类似人员)治疗个体。各种实施方案涉及自我治疗，使得具有特定AD风险的个体基于其指示的AD风险的知识摄入药物、饮食补充物、改变其饮食或认知锻炼。
虽然上文描述了确定个体的AD风险的具体例子，但本领域普通技术人员可以理解，该方法的各个步骤可以以不同的顺序执行，并且根据本发明的一些实施方案，某些步骤可以是任选的。因此，应该清楚的是，可以根据特定应用的要求适当地使用该方法的各个步骤。此外，根据本发明的各种实施方案可以利用用于确定适合于给定应用的要求的个体的AD风险的多种方法中的任一种。
测量AD风险的分析物的方法
在几个实施方案中，检测和测量生物标志物，并且基于生物标志物的相对量，可以确定AD风险。可以用于实践本发明的生物标志物包括(但不限于)脂质，尤其是DCA。相关的DCA包括(但不限于)琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)、C4+C5的组合和/或C7+C8+C9的组合。注意，在某些实施方案中，可以使用C7+C8+C9+C10的组合代替C7+C8+C9。
检测和测量生物标志物的水平
通过多种合适的方法可以确定生物样品(例如，尿样品)中的分析物生物标志物。合适的方法包括色谱法(例如，高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC))、质谱法(例如，MS、MS-MS)、NMR、酶或生化反应、免疫测定及其组合。例如，质谱法可以与色谱方法诸如液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)或电泳组合，以将被测代谢物与生物样品中的其它组分分离。参见，例如，Hyotylainen(2012)Expert Rev.Mol.Diagn.12(5):527-538；Beckonert等人(2007)Nat.Protoc.2(11):2692-2703；O’Connell(2012)Bioanalysis4(4):431-451；和Eckhart等人(2012)Clin.Transl.Sci.5(3):285-288；其公开内容通过引用并入本文。可替换地，可以使用生物化学或酶测定法测量分析物。在另一个实施例中，可以通过色谱法分离生物标志物，并且可以通过分析色谱图通过洗脱的生物标志物的峰面积的积分来确定生物标志物的相对水平。
用于检测样品中的生物标志物的方法具有许多应用。例如，生物标志物可用于随着其年龄增长监测个体。在几个实施方案中，在个体表现出认知减退的迹象之前执行检测DCA的方法，这有助于早期检测和早期治疗选择。
与质谱法组合的气相色谱法
在图1B中提供了利用与质谱法组合的气相色谱法(GC-MS)确定DCA组分的相对浓度的方法。方法150开始于获得和制备(151)要检查的个体的生物样品。生物样品可以包括含有DCA组分的任何样品，包括尿样品、抽出的血液、抽出的脑脊液、粪便样品或组织活组织检查。在几个实施方案中，为了便于采集，使用了尿样品。
一旦获得生物样品，就可以准备它用于分析。通过任何合适的方法，诸如(例如)离心，可以除去生物样品中的碎片和细胞。此外，可以将样品稀释和/或浓缩到适当的程度。可以对生物样品进行各种分析以标准化并确保样品符合适当的标准。例如，在某些实施方案中，可以将尿样品稀释10至20倍，并使用各种蛋白(例如，肌酸酐、白蛋白)来标准化生物样品。
方法150还向生物样品添加(153)DCA分子的内标。在某些实施方案中，使用DCA分子的氘代标准品，其可从各种供应商获得，诸如Cambridge Isotope Laboratory(Tewksbury,MA)。在其中混合内标后，可以准备生物样品用于色谱法和光谱测定法。在某些实施方案中，在GC-MS分析之前将DCA分子(包括氘代DCA标准品)转化为双五氟苄基酯。关于准备用于GC-MS分析的DCA分子的详细解释，参见在示例性实施方案中的“二羧酸提取和衍生化”部分。
方法150进一步执行(155)GC-MS以确定相对DCA浓度。DCA具有两个反应性羧酸基团，其允许检测母体质量M+2PFB。[M+1PFB]-羧酸根离子(m/z)。已证明使用GC-MS确定相对DCA浓度是可靠的和可再现的(数据参见示例性实施方案)。
生化和酶测定
各种实施方案涉及用于检测样品中的DCA的产色、化学发光和/或荧光方法。因此，进行生化或酶测定以产生指示相对DCA量的产色、化学发光或荧光应答。在某些实施方案中，产色、化学发光或荧光测定能够检测短DCA(例如，琥珀酸(C4)和戊二酸(C5))并将其与长DCA(例如，庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)和癸二酸(C10))区分开。在某些实施方案中，产色、化学发光或荧光测定能够检测至少一种DCA并将其与所有其它DCA区分开。
DCA的免疫学检测
许多实施方案涉及使用抗体来检测样品中的DCA。因此，可以利用对各种DCA具有特异性的抗体来确定样品中DCA种类的相关物。在某些实施方案中，免疫测定能够检测短DCA(例如，琥珀酸(C4)和戊二酸(C5))并将其与长DCA(例如，庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)和癸二酸(C10))区分开。在某些实施方案中，免疫测定能够检测至少一种DCA并将其与所有其它DCA区分开。
基于特异性识别DCA的抗体的应用的免疫测定可以用于测量DCA水平。这样的测定包括(但不限于)酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、“夹心”免疫测定、荧光免疫测定、酶放大免疫测定技术(EMIT)、毛细管电泳免疫测定(CEIA)、免疫沉淀测定、蛋白质印迹法、免疫组织化学(IHC)、流式细胞计量术和飞行时间细胞计量术(CyTOF)。
使用本领域已知的任何合适的方法，可以制备与DCA特异性结合的抗体。参见，例如，Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(1986年第2版)；以及Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)。DCA抗原可以用于免疫哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以产生多克隆抗体。如果需要的话，可以将DCA抗原缀合至载体蛋白，诸如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin)。根据宿主种类，可以使用各种佐剂来增加免疫学应答。这样的佐剂包括、但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。在人类使用的佐剂中，BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))和小棒杆菌(corynebacterium parvum)是特别有用的。
使用通过连续培养的细胞系产生抗体分子的任何技术，可以制备与DCA抗原特异性结合的单克隆抗体。这些技术包括、但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等人,Nature 256,495-97,1985；Kozbor等人,J.Immunol.Methods 81,3142,1985；Cote等人,Proc.Natl.Acad.Sci.80,2026-30,1983；Cole等人,Mol.CellBiol.62,109-20,1984)。
此外，可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术，将小鼠抗体基因与人抗体基因剪接以获得具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.81,6851-55,1984；Neuberger等人,Nature 312,604-08,1984；Takeda等人,Nature 314,452-54,1985)。也可以将单克隆抗体和其它抗体“人源化”，以防止患者在治疗性地使用它时产生针对该抗体的免疫应答。这样的抗体在序列上可能与直接用于治疗的人抗体足够相似，或者可能需要改变几个关键残基。通过单个残基的定位诱变或通过嫁接整个互补性决定区来替换与人序列中的残基不同的残基，可以使啮齿动物抗体和人序列之间的序列差异最小化。
可替换地，可以使用重组方法产生人源化抗体，如下所述。与特定抗原特异性结合的抗体可以含有部分地或全人源化的抗原结合位点，如在美国专利号5,565,332中所公开的。可以如Simmons等人,PLoS Medicine 4(5),928-36,2007中所述在体外制备人单克隆抗体。
可替换地，可以使用本领域已知的方法调整所述用于生产单链抗体的技术，以生产与特定抗原特异性结合的单链抗体。具有相关特异性但具有不同独特型组成的抗体可以通过从随机组合免疫球蛋白文库的链改组而产生(Burton,Proc.Natl.Acad.Sci.88,11120-23,1991)。
使用杂交瘤cDNA作为模板，使用DNA扩增方法，诸如PCR，也可以构建单链抗体(Thirion等人,Eur.J.Cancer Prev.5,507-11,1996)。单链抗体可以是单特异性的或双特异性的，并且可以是二价的或四价的。例如，在Coloma和Morrison,Nat.Biotechnol.15,159-63,1997中教导了四价双特异性单链抗体的构建。在Mallender和Voss,J.Biol.Chem.269,199-206,1994中教导了二价双特异性单链抗体的构建。
可以使用手动或自动核苷酸合成来构建编码单链抗体的核苷酸序列，使用标准重组DNA方法克隆进表达构建体中，并引入细胞中以表达编码序列，如下所述。可替换地，使用例如丝状噬菌体技术，可以直接生产单链抗体(Verhaar等人,Int.J Cancer 61,497-501,1995；Nicholls等人,J.Immunol.Meth.165,81-91,1993)。
通过在淋巴细胞群中诱导体内产生，或通过筛选免疫球蛋白文库或在文献中公开的高特异性结合试剂组，也可以产生与DCA抗原特异性结合的抗体(Orlandi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.86,3833 3837,1989；Winter等人,Nature 349,293 299,1991)。
可以如WO 93/03151中公开的那样构建嵌合抗体。也可以制备源自免疫球蛋白并且是多价和多特异性的结合蛋白，诸如在WO 94/13804中描述的“双抗体(diabodies)”。
可以通过本领域公知的方法纯化抗体。例如，可以通过穿过相关DCA所结合的柱子对抗体进行亲和纯化。然后可以使用高盐浓度的缓冲液从柱子洗脱结合的抗体。
抗体可以用于诊断测定中以检测生物样品中DCA的存在或定量。这样的诊断测定可以包括至少两个步骤；(i)使生物样品与抗体接触，以及(ii)量化与底物结合的抗体。所述方法可以另外包括在使结合的抗体经受样品之前将抗体共价地、静电地或可逆地附着于固体支持物的预备步骤，如上文和本文其它地方所定义。
各种诊断测定技术是本领域已知的，诸如竞争性结合测定、直接或间接夹心测定以及在异质或同质相中进行的免疫沉淀测定(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,CRC Press,Inc.,(1987),第147-158页)。在诊断测定中使用的抗体可以用可检测部分标记。可检测部分应该能够直接或间接产生可检测信号。例如，可检测部分可以是放射性同位素(诸如2H、14C、32P或125I)、荧光或化学发光化合物(诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素)或酶(诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或辣根过氧化物酶)。可以使用本领域已知的将抗体与可检测部分缀合的任何方法，包括以下文献所描述的那些方法：Hunter等人,Nature,144:945(1962)；David等人,Biochem.13:1014(1974)；Pain等人,J.Immunol.Methods 40:219(1981)；和Nygren,J.Histochem.and Cytochem.30:407(1982)。
免疫测定可以用于确定样品中DCA的存在与否以及样品中DCA的量。首先，可以使用上述免疫测定方法检测样品中DCA的测试量。如果在样品中存在DCA，它将与抗体形成抗体-生物标志物复合物，所述抗体在合适的温育条件下与DCA特异性结合，如上所述。抗体-生物标志物复合物的量可以通过与标准对比来确定。标准可以是例如已知的化合物或已知存在于样品中的另一种蛋白。如上面所指出的，生物标志物的测试量不需要以绝对单位测量，只要测量单位可以与对照进行对比即可。
试剂盒
在几个实施方案中，试剂盒用于监测个体的AD风险，其中试剂盒可以用于检测本文所述的DCA生物标志物。例如，试剂盒可以用于检测本文所述的DCA生物标志物中的任何一种或多种，其可以用于确定AD风险。该试剂盒可以包括用于检测一种或多种生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳从受试者获得的生物样品(例如，尿液)的容器；以及关于用生物样品制备试剂以检测样品中一种或多种生物标志物的存在或量的印刷说明书。所述试剂可以包装在单独的容器中。该试剂盒还可以包含一种或多种对照参考样品和试剂，其用于进行生化测定、酶测定、免疫测定或色谱法。在某些实施方案中，试剂盒可以包括氘代DCA标准品和/或试剂以制备用于GC-MS分析的样品(例如，盐酸、乙酸乙酯、硫酸钠、五氟苄基溴(PFBBr)和二异丙基乙胺(DIPEA))。在某些实施方案中，试剂盒可以包含用于进行色谱法的试剂(例如，树脂、溶剂和/或柱)。
试剂盒可以包括用于被包含在试剂盒中的组合物的一个或多个容器。组合物可以是液体形式或可以是冻干的。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶(vial)、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，包括玻璃或塑料。该试剂盒还可以包括包装插页，其包含关于确定样品中的DCA浓度的方法的书面说明。
与AD风险相关的应用和治疗
各种实施方案涉及与AD风险相关的诊断和治疗。如本文中所述的，个体可能具有通过各种方法指示的他们的AD风险。基于个体的AD风险指示，个体可以接受进一步诊断和/或用各种药物、饮食补充物和认知锻炼方案进行治疗。
临床诊断
许多实施方案涉及使用其生物样品中的DCA组分的相对量来诊断个体。在某些实施方案中，相关方法或经训练的计算模型会产生指示发生AD的可能性的AD风险评分。
在许多实施方案中，可以如下进行诊断：
a)获取待诊断个体的DCA测量数据
b)确定AD风险评分
c)根据AD风险评分诊断个体。
根据各种实施方案，可以如本文中描绘和描述的(诸如图1中描绘的)进行诊断。
诊断、药物和补充物
几个实施方案涉及使用药物和/或饮食补充物来治疗基于具有高AD风险的个体。在某些实施方案中，作为治疗过程的一部分，以治疗有效量施用药物和/或饮食补充物。如在该背景下使用的，“治疗”是指改善待治疗障碍的至少一种症状或提供有益的生理效应。治疗有效量可以是足以预防、减轻、改善或消除AD症状和/或降低AD风险的量。例如，治疗有效量可以是改善认知和/或预防认知减退的量。可替换地，治疗有效量可以是减少脑物质损失的量。
化合物的剂量、毒性和治疗效果可以例如通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，且它可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用具有毒性副作用的化合物，但应当小心地设计将这样的化合物靶向受影响的组织部位的递送***，以便使得对其它组织和器官的潜在损害最小化，并从而减少副作用。
从细胞培养测定或动物研究获得的数据可以用于制定一系列用于人类的剂量。如果全身提供药物，这样的化合物的剂量优选地在包括ED50又几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。根据所用剂型和所用施用途径，剂量可以在此范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，可以从细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定剂量以实现循环血浆浓度或在待治疗的局部环境内在一定范围内，该范围包括通过适当方式(例如，淀粉样蛋白和/或tau积累)确定的IC50(即，实现AD进展的半数最大抑制的试验化合物的浓度)。这样的信息可以用来更准确地确定在人类中有用的剂量。例如，通过与质谱法偶联的液相色谱法，可以测量血浆中的水平。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。例如，治疗量是达到期望的治疗效果的量。该量可以与预防有效量相同或不同，预防有效量是预防疾病或疾病症状的发作所必需的量。有效量可以以一次或多次施用、应用或剂量施用。组合物的治疗有效量取决于所选择的组合物。可以每天一次或多次至每周一次或多次施用组合物；包括每隔一天一次。熟练的技术人员会明白，某些因素可能影响有效地治疗受试者所需的剂量和时机，包括、但不限于疾病或障碍的严重程度、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所述组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。例如，可以每天施用若干分份剂量、一个剂量或循环施用化合物以达到期望的治疗结果。
许多诊断试验可用于进一步评估AD。诊断试验包括(但不限于)认知试验、神经心理学试验和医学成像。可以应用认知试验来测试个体的记忆和认知能力。可以进行神经心理学试验以确定个人是否患有痴呆症和/或是否能够执行日常任务，例如驾驶和/或管理财务。认知和神经心理学试验包括(但不限于)小型精神状态检查(MMSE)和蒙特利尔认知评估(MoCA)(www.mocatest.org)。可以执行许多医学成像技术，包括磁共振成像(MRI)、计算机化断层摄影(CT)和正电子发射断层摄影术。MRI和CT可以用于检测脑物质损失，尤其是在海马中。PET扫描可以用于检测变性区域、淀粉样蛋白斑块和/或tau神经原纤维缠结。
许多药物可用于治疗AD。药物包括(但不限于)胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、加兰他敏、利凡斯的明和他克林)和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体激动剂(例如，美金刚)。因此，根据各种实施方案，可以通过本文所述的单一药物或药物组合来治疗个体。此外，治疗的几个实施方案进一步包含饮食补充物(例如，抗氧化剂、白藜芦醇、维生素D和银杏(ginkgo biloba))。
还可以进行许多认知锻炼来帮助治疗具有发生AD风险的个体。一般而言，认知锻炼是利用记忆、推理或信息处理中的至少一种的活动。在某些实施方案中，具有发生AD风险的个体接受新的学习机会，诸如参加教育课程、学习第二语言或学习乐器。在某些实施方案中，具有发生AD风险的个体玩棋盘游戏和拼图(例如，麻将、数独和纵横字谜)。在某些实施方案中，具有发生AD风险的个体书写和/或口头回忆传记以帮助保持记忆新鲜。
示例性实施方案
生物学数据支持评估AD风险的方法和***及其应用。在随后的部分中，提供了与分析物组(panel)、相关性和AD风险相关的示例性方法和示例性应用。
如这些实施例中所述，这些研究的目标是开发非侵入性生物标志物，以实现对阿尔茨海默氏病(AD)的广泛筛查和早期诊断。假设AD中脑组织的损失会导致尿液中的脑脂质组分的检测，并且这些会随着AD的CSF和脑生物标志物而变化。具体地，在尿液中检查到二羧酸(DCA)，这可能反映氧化性损伤和能量产生/平衡的产物，其可能解释AD中脑功能的变化。
DCA***假设是基于以下内容。DCA是由不饱和脂肪酸的氧化分解形成，并且预计与AD相关的氧化性应激的增加会改变长链单不饱和和多不饱和脂肪酸的DCA形成。几种DCA诸如琥珀酸和戊二酸会促进能量代谢，且其水平的变化可能影响线粒体功能。线粒体功能和能量失衡被认为会促进AD病理学。已知DCA抑制线粒体ATP产生并改变呼吸。此外，建议通过琥珀酰化修饰几种线粒体蛋白以产生功能失调的后果。因此，氧化性应激将表现在DCA的尿***中。综上所述，在AD中报道的功能失调脑线粒体可能是一些DCA减少的原因，这又导致脑脂质的氧化性损伤并导致脑组织损失和氧化的DCA产物的尿***。
在这些实施例中，检查了因其年龄而被选为AD风险较高的个体的尿液，并在经过广泛的神经心理测量组和国家阿尔茨海默氏病协调中心(National Alzheimer’sCoordinating Centers，NACC)的统一数据集-2(Uniform Data Set-2)标准后将其归类为认知健康(CH)。根据以前的证实从CSF淀粉样蛋白和Tau水平的逻辑回归正确分类了临床上可能患有AD的个体的报告，这些回归分析用于区分具有正常淀粉样蛋白/tau(CH-NAT)或病理性淀粉样蛋白/tau(CH-PAT)的年龄匹配的CH个体(参见M.G.Harrington,等人,PloS one8,e79378(2013)，其公开内容通过引用并入本文)。在四年的随访中，没有CH-NAT在认知上下降，但40％的CH-PAT在认知上下降。
本文提供的数据显示，与CH个体相比，在来自AD的尿液中，C4-C5 DCA减少且C7-C10 DCA增加。在随后的部分中详细说明的结果显示，短链DCA与CSF Aβ42呈正相关，而C7-C10 DCA与CSF Aβ42呈负相关且与CSF Tau呈正相关。通过发现C7-C10 DCA与海马体积的负相关，进一步支持了尿液DCA的变化与脑病理学之间的联系(左：r＝-0.47；p＝0.0056，右：r＝-0.49；p＝0.0040，总计：r＝-0.48；p＝0.0041)，这在其它脑区域中没有发现。这些数据表明，尿液中增加的脂肪氧化和功能失调的能量平衡的测量是早期AD病理学的标志。尿液DCA的常规测量可以通过指示疾病进展来促进个性化健康护理，并可以用于探索人群健康或监测临床试验中的治疗效力。
研究结果
根据NACC UDS-2标准和共识会议，超过100名>70岁的研究参与者被分类为认知健康(CH,n＝76)或可能的AD(n＝24)。排除具有轻度认知损害的那些以减少在分析中的异质性。将CH个体通过CSF Aβ42和Tau再分类为CH-NAT(n＝45)或CH-PAT(n＝31)。各组具有相似的年龄，且女性占各组的58.3-66.7％(表1)。对这些个体进行基因分型(在可能时)以确定他们的ApoE状态，并对比他们的BMI，并将教育年数平均化。在后一种情况下，AD个体的正规教育低于CH(p＝0.036)，这是AD的典型特征。
为了说明肾功能和水合水平，分析了总蛋白、肌酸酐和白蛋白的尿浓度以及尿白蛋白与肌酸酐之比(UACR)。与对照相比，患有AD的个体通过更高的总蛋白、白蛋白和UACR浓度显示出肾功能受损的证据(表1)，这与认知减退所识别的更高白蛋白尿水平一致。
尿液中的二羧酸的检测：从认知健康和AD个体中量化尿液中的八(8)种DCA：丙二酸(C3)、琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、己二酸(C6)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)和癸二酸(C10)。C4占尿液中检测到的DCA的大部分(42％，范围34.7％-44.1％)，而C6、C8、C7和C9各占总尿DCA的10％以上(图2)。C5、C3和C10分别占总尿DCA的6％、3％和2％。
与AD相比在CH中的尿液二羧酸种类不同：对于CH和AD临床组，DCA种类的总量(平均值+标准差)分别为6.68±3.92μg/mL和7.86±4.54μg/mL。虽然DCA种类的总量之间没有显著差异，但对于某些个体酸，AD组中的平均水平显著高于CH组(图3)：庚二酸，p＝0.0033；辛二酸，p＝0.0175；壬二酸，p＝0.0010；和癸二酸，p＝0.0051。
为了在尿液样品之间标准化，将单个DCA种类的水平表示为总DCA种类的百分比。与CH相比，AD中的琥珀酸(p＝0.0113)和戊二酸(p＝0.0087)的平均比例显著降低。另一方面，与CH相比，AD中的庚二酸(p＝0.0035)、辛二酸(p＝0.0161)和壬二酸(p＝0.0022)的平均比例显著更高(图4A)。当我们将代谢过程DCA的总和与长链脂肪酸的氧化产物的总和组合时，临床组分类的准确性得到提高，如较低的p值所示(C4和C5的总和：p＝0.0059；C7至C9的总和：p＝0.0004)，图4B。
当根据CSF淀粉样蛋白和总tau进一步对CH组进行细分以区分处于发生AD的较高风险中的那些CH个体时，CH-NAT、CH-PAT和AD之间DCA种类的差异是可识别的。检查表明，AD较高的DCA组主要来自不饱和脂肪酸的分解，而AD较低的DCA组由TCA循环的组分组成(图5)。
这三个临床组之间区分C7到C9的灵敏性和特异性如图6中的受试者(receiver)操作特征(ROC)曲线所示。
C4/C5的尿DCA变化的多变量分析以及多重性调整：在候选混杂因素(confounder)年龄、性别、吸烟状况和Stroop Interference评分中，只有吸烟状况接近为C4/C5的显著独立预测因子(p＝0.07)。将吸烟状况包括为协变量并使用Tukey-Kramer对多重性进行调整后，在CH-NAT和CH-PAT之间存在显著差异(p＝0.04)，在CH-NAT和AD之间存在显著差异(p＝0.0004)，但是在CH-PAT和AD之间不存在(p＝0.26)。
C7-C9的尿DCA变化的多变量分析以及多重性调整：对于C7-C9，只有年龄接近为显著的独立预测因子(p＝.10)。将年龄包括为协变量并使用Tukey-Kramer调整多重性，在CH-NAT和AD之间的对比是高显著的(p＝0.0002)，而在CH-PAT和CH-NAT之间以及CH-PAT和AD之间的对比是不显著的(分别p＝0.09和0.12)。
DCA对临床和脑脊液分类的预测能力：开发并测试了多项逻辑模型，以基于C7-C9DCA预测CH-NAT、CH-PAT和AD组的成员身份(membership)。该模型根据其C7_C9值正确预测了组101个个体中的46个(45.5％)：44个CH-NAT中的36个(82％)但32个CH-PAT中的仅2个(6％)和25个AD中的8个(32％)。CH-NAT、CH-PAT和AD的特异性分别为42％(24/57)、86％(59/69)和84％(64/76)。
尿液DCA与AD的CSF和MRI生物标志物相关：为了确定尿液DCA种类是否与脑变性有关，检查了它们与CSF Aβ42和Tau蛋白水平的相关性。散布图(图7)表明，戊二酸与Aβ42呈正相关(r＝0.23；p＝0.0186)，而壬二酸与Aβ42呈负相关(r＝-0.26；p＝0.0101)。发现壬二酸(r＝0.22,p＝0.0276)(图7)和癸二酸(r＝0.20；p＝0.0476)分别与CSF Tau的正相关，以及C7-C10的总和与CSF Tau的正相关(r＝0.20；p＝0.0499)。
通过磁共振成像(MRI)测试了分解种类C7到C10是否可以与海马体积相关联。图8、9和10显示分解种类的百分比与海马体积之间的负相关(左：r＝-0.47；p＝0.0056，右：r＝-0.49；p＝0.0040，总计：r＝-0.48；p＝0.0041)。相反，未发现组合的C7-9 DCA与侧枕叶(lateral occipital lobe)体积之间的相关性，所述侧枕叶体积被选为在阿尔茨海默氏病中受到轻微影响的对照区域(图10)。重要的是，C7-C10种类的测量与症状发生前的CH-PAT同期组群(cohort)中的脑源性CSF脂肪酸前体的变化相关(图11)。
DCA变化的相互作用的生化和临床意义：这些实施例中的研究显示尿液中两组DCA的变化截然相反(图12)。虽然在认知健康研究参与者中，能量相关的C4/C5较高且氧化衍生的C7/C8/C9较低，但来自AD参与者的尿液中存在相反的水平。在功能上，这两组DCA也具有相反的效果。例如，琥珀酸盐/酯(succinate)是通过TCA循环进行能量代谢的辅助因子，而已知壬二酸抑制多种TCA酶和线粒体电子传递蛋白。如果通过自噬对淀粉样蛋白的清除、有丝***后神经元的修复以及其它维持健康脑所需的过程需要能量，那么较高的C4/C5和较低的C7/C8/C9是合乎需要的。另一方面，较低的C4/C5和较高的C7/C8/C9将有利于淀粉样蛋白的积累，从而导致表征AD病理学的脑功能障碍。这项研究的意义在于，增加C4/C5和减少C7/C8/C9的策略可以增强认知功能或减少AD进展。
分析方法
研究参与者的诊断
加利福尼亚州帕萨迪纳市的亨廷顿纪念医院机构审查委员会(The HuntingtonMemorial Hospital Institution Review Board,Pasadena,California)批准了本研究的方案和同意书。所有研究参与者都签署了书面知情同意书。从大洛杉矶地区招募了在70至100岁之间的参与者，且以前已经描述了本研究的医学和神经心理学诊断过程(参见M.G.Harrington,等人,(2013)，上文引用)。最初，研究参与者根据神经心理学研究分为两组，认知正常(CH,n＝76)和推测的AD(AD,n＝24)。根据脑脊液(CSF)中的β淀粉样蛋白42/tau比率，将CH组进一步分为无症状低风险个体(CH-NAT,n＝45)和无症状高风险个体(CH-PAT,n＝31)(参见M.G.Harrington,等人,(2013)，上文引用)。
通过MRI测量脑体积
在HMRI使用带有标准八通道阵列头部线圈的GE 3或1.5T MR扫描仪获得MRI数据集。首先通过海马获得解剖冠状自旋回波T2加权扫描(TR/TE 1550/97.15ms,NEX＝1,切片厚度5mm，无间隙，FOV＝188x180mm,矩阵大小＝384x384)。然后使用T1加权3D快速破坏梯度回波(FSPGR)脉冲序列和使用2°、5°和10°的翻转角的可变翻转角方法获取基线冠状T1加权图。使用Freesurfer 6.0(Freesurfer,Harvard)分析数据以获得海马和枕叶体积。
尿液收集、总蛋白、白蛋白和肌酸酐
在禁食过夜后，在上午8:00至上午10:00从研究参与者收集单点中流尿液样本。离心以除去任何碎片后，将尿液分级分离并在-80℃储存在聚碳酸酯试管中直到需要用于分析。将尿液稀释(10-20倍)并使用改进的Jaffe方法使用苦味酸盐使用肌酸酐(0-15mg/dL)作为标准(肌酸酐试剂盒，#500701,Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI)测定肌酸酐水平。使用尺寸排阻色谱法(HP1050)在Zorbax GF-250柱(4.6x250mm)上使用0.1PBS(pH7.0)以0.5mL/min的流速对尿白蛋白进行定量。将柱用甲状腺球蛋白(670kDa)、丙种球蛋白(158kDa)、卵白蛋白(44kDa)、肌球蛋白(17kDa)和维生素B-12(1.35kDa)校准，并计算白蛋白水平(mg/mL)。
二羧酸提取和衍生化
提取方案改编自Costa等人(Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis 21,1215-1224(2000)，其公开内容通过引用并入本文)。简而言之，将500μL尿液和100μL在乙醇中的20ng/μL的氘代内标混合物用盐水溶液稀释至1mL，并用3滴1M HCl酸化至pH 2。然后，用3mL乙酸乙酯提取尿液3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，然后倾析并在氮气流下在45℃干燥。一旦干燥，通过向残余物中加入25μL 5％v/v PFBBr和25μL 10％v/v的DIPEA在无水乙腈中的溶液，将提取的DCA转化为双五氟苄基酯。使反应在60℃进行30分钟。然后在氮气流下干燥反应溶液，然后向反应试管中加入1mL己烷类，涡旋10分钟，然后转移到GC/MS小瓶。在氮气流下蒸发后，将衍生化的残留物溶解在100μL十二烷中用于GC/MS分析。
衍生化的二羧酸的GC-MS分析
DCA具有两个反应性羧酸基团，产生母体质量M+2PFB。通过将1μL衍生化的提取物注射到与7000MS Triple Quad(Agilent Technologies)偶联的7890A GC***上，检测[M+1PFB]-羧酸根离子(m/z)。使用Phenomenex Zebron ZB-1MS毛细管GC柱(2x15 m长度,0.25mm I.D.,0.50μm膜厚度)历时21.2分钟进行气相色谱法，将所述柱加热至150℃保持1.2分钟，以20℃/分钟升高至270℃并保持2分钟，然后以10℃/分钟升高至340℃并保持5分钟。离子源的温度为200℃且四极的温度为150℃。使用甲烷气体进行负离子化学电离后，使用单离子监测(SIM)测量[M+1PFB]-羧酸根离子。尿样品中DCA检测的变异系数见表S1。当对同一原始样品重复整个制备和GCMS时的重现性测量(SD)<20％；当通过GCMS连续几天运行相同样品时的SD<6％。非氘代和氘代二羧酸标准品的羧酸根离子(m/z)、保留时间、线性范围和检测限的列表如表2所示。从GC/MS获得的总离子色谱图如图13所示。
数据和统计分析
使用Agilent MassHunter工作站软件分析GC/MS数据。在样品分析之前获取校正曲线，并在每10个样品之后分析质量控制标准。一式三份分析所有样品。大多数脂肪酸的峰积分是自动的，当自动积分失败时，在选定的情况下使用手动积分。检查DCA的质量并标准化至体积，然后确定DCA的分布百分比和比例。利用百分比降低了变异系数，并且也考虑了水合，因为百分比代表了每个种类彼此之间的关系。进行Mann Whitney U检验以确定CH-NAT、CH-PAT、组合的CH和AD研究参与者之间DCA水平的显著差异。使用GraphPad Prism软件进行所有数据分析，并且当P<0.05时考虑数据是统计上显著的。此外，检查了DCA种类与Ab和tau蛋白的CSF水平之间的Spearman氏秩相关系数。通过MRI确定选定的脑体积。
比率分析
该实施例所依据的假设是，与没有认知能力下降的参与者相比，在4年内认知能力下降的参与者在基线时尿膜中的DCA脂质比率将更小。将DCA脂质表示为尿C4-C5与C7-C9的比率。根据初步数据，估计下降者(decliner)的平均(SD)比率为1.54(1.22)，非下降者为1.99(1.27)。
等同方案的声明
虽然以上描述含有本发明的许多具体实施方案，但这些不应解释为对本发明范围的限制，而应被视为其一个实施方案的示例。因此，本发明的范围不应由所示的实施方案决定，而应由所附权利要求和它们的等同方案决定。
表1.人口统计学、临床和CSF/尿液生物标志物
Figure BDA0003486662340000271
Figure BDA0003486662340000281
表2.用于检测和量化DCA的分析参数
Figure BDA0003486662340000282
碳数(C3-C10)、负离子(m/z)、保留时间(RT)、氘代内标、检测线性范围和相关性(R2)。
表3.在临床组之间针对尿体积(ng/mL)标准化的DCA种类的分布、比例和组间对比.
Figure BDA0003486662340000283
Figure BDA0003486662340000291
<0.05的P值以粗斜体字显示。
表4.在临床和生化组之间的DCA种类的分布百分比、比例和组间对比.
Figure BDA0003486662340000292
Figure BDA0003486662340000301

Claims (30)

1.一种确定个体患阿尔茨海默氏病的风险的方法，其包括：
获得或已经获得个体的生物样品，其中所述生物样品含有二羧酸；
向所述生物样品中加入二羧酸分子的内标；
对所述生物样品进行测定以确定所述样品中至少一个长二羧酸种类的量，其中所述至少一个长二羧酸种类的确定量指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是尿液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述测定是与质谱法组合的气相色谱法。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括：在进行与质谱法组合的气相色谱法之前，将生物内的二羧酸转化为双五氟苄基酯。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中二羧酸分子的内标包括以下至少一种：琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)和癸二酸(C10)。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述二羧酸分子的内标是一组已知浓度的氘代二羧酸分子。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述至少一个长二羧酸种类的量是与所测量的一组一个或多个二羧酸种类的相对量。
8.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述至少一个长二羧酸种类的量是浓度。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述个体的至少一个长二羧酸种类的确定量大于阈值，并且其中基于至少一个长二羧酸种类的量大于阈值确定所述个体具有阿尔茨海默氏病的高风险。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中至少一个长二羧酸种类的量。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述至少一个长二羧酸种类是庚二酸(C7)、辛二酸(C8)、壬二酸(C9)、癸二酸(C10)、不饱和的C7、C8、C9或C10二羧酸种类或被取代的C7、C8、C9或C10二羧酸种类。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
对生物样品进行测定以确定样品中至少一个短二羧酸种类的相对量；和
确定至少一个长二羧酸种类的相对量与至少一个短二羧酸种类的相对量的比率，其中所述确定的比率指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所确定的个体的比率大于阈值，并且其中基于该比率大于阈值确定所述个体具有阿尔茨海默氏病的高风险。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率。
15.根据权利要求12、13或14所述的方法，其中所述至少一个短二羧酸种类是琥珀酸(C4)、戊二酸(C5)、不饱和的C4或C5二羧酸种类或被取代的C4或C5二羧酸种类。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
获得或已经获得个体的至少第二生物样品，其中获得的生物样品中的每一个都含有二羧酸，并且至少两个生物样品在两个不同时间点获得；
向每个生物样品中加入二羧酸分子的内标；和
对每个生物样品中的每一个进行测定以确定至少一个长二羧酸种类的浓度，其中至少一个长二羧酸种类的浓度的时间变化指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
17.根据权利要求16所述的方法，其中长二羧酸种类的浓度随时间的增加指示阿尔茨海默氏病的高风险。
18.根据权利要求17所述的方法，其中长二羧酸种类的浓度随时间的增加大于阈值，指示阿尔茨海默氏病的高风险。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中长二羧酸种类的浓度随时间的增加。
20.根据权利要求16-19中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
对生物样品进行测定以确定每个样品中至少一个短二羧酸种类的浓度；和
确定在每个时间点至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率，其中所确定的比率的时间变化指示个体患阿尔茨海默氏病的风险。
21.根据权利要求20所述的方法，其中至少一个长二羧酸种类的浓度随时间增加至至少一个短二羧酸种类的浓度指示阿尔茨海默氏病的高风险。
22.根据权利要求21所述的方法，其中至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率随时间的增加大于阈值，指示阿尔茨海默氏病的高风险。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述阈值是基于在认知健康群体中或在患有阿尔茨海默氏病的个体群体中至少一个长二羧酸种类的浓度与至少一个短二羧酸种类的浓度的比率随时间的增加。
24.根据权利要求1-23中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
确定所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中；和
施用诊断试验以进一步评估个体的阿尔茨海默氏病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述诊断试验是认知试验、神经心理学试验或医学成像。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述诊断试验是小型精神状态检查或蒙特利尔认知评估。
27.根据权利要求1-26中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
确定所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中；和
对个体的阿尔茨海默氏病施用认知锻炼。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述认知锻炼是利用记忆、推理或信息处理中的至少一种的活动。
29.根据权利要求1-28中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：
确定所述个体处于阿尔茨海默氏病的高风险中；和
对个体的阿尔茨海默氏病施用药物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述药物是胆碱酯酶抑制剂或N-甲基D-天冬氨酸受体激动剂。
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