CN114957249B - 一种不可逆共价结合cdk抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不可逆共价结合CDK抑制剂及其制备方法和应用，所述抑制剂的结构如下式I所示。本发明通过在帕博西尼哌嗪基团末端分别引入丙烯酰胺、肉桂酰胺等Michael加成电子受体基团，并在受体基团不饱和双键两侧引入具有不同电性效应的取代基团，以此调节其Michael加成反应活性及生物活性。研究发现，该类化合物可经过不可逆共价结合方式靶标蛋白，其激酶抑制活性及抗增殖活性显著优于帕博西尼，并且对CDK4/6具有很好的选择性，而且还可以有效克服帕博西尼耐药性，在治疗恶性肿瘤方面有较好的应用前景。

Description

一种不可逆共价结合CDK抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种不可逆共价结合CDK抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康。例如乳腺癌，其是女性最常见的癌症，也是全球女性癌症死亡的主要原因。

细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，调节细胞周期，促进细胞生长、增殖和凋亡。迄今为止，CDK家族由20个成员组成(CDK1-20)，它们与相关的细胞周期蛋白(cyclin)形成CDK/cyclin复合物来发挥其功能。CDK4/6与cyclinD相互作用形成复合物，导致Rb(抑癌基因)过度磷酸化，介导细胞通过G/S检查点并顺利进人S期，从而促进了细胞的增殖。在15％～20％的乳腺癌组织中，cyclinD的表达水平显著升高，G/S检查点机制被破坏，从而促进了乳腺癌细胞的增殖。90％的癌症中出现CDK4/6-Rb-E2F通路被破坏的情况。因此CDK4/6是一种开发用于治疗干预癌症的有效靶点。

帕博西尼是全球首个细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6抑制剂，它由Pfizer公司研制并开发，商品名为Ibrance。帕博西尼通过阻断细胞周期中细胞从G1期到S期的进程降低***受体(ER)阳性乳腺癌细胞系的细胞增生。2015年2月，美国食品药品管理局(FDA)加速审批了帕博西尼和来曲唑联合用于绝经后妇女对ER阳性，对HER2阴性的晚期乳腺癌，作为转移性疾病的初始内分泌为基础的治疗。因其在乳腺癌治疗方面具有靶向性强的优势，帕博西尼一经上市便作为一线治疗药物，在临床上得到了广泛的应用，但在实际治疗过程中，仍有部分患者对药物没有响应，无法获得理想的疗效；或是在治疗一段时间后对药物产生了耐药性。

共价抑制剂是一类能够与特定的靶蛋白共价结合,从而抑制其生物功能的小分子化合物。这些抑制剂往往都含有丙烯酰胺、β-内酰胺、磺酰氟基、环氧乙烷等官能团，能与靶蛋白中特定的氨基酸残基，如半胱氨酸残基、丝氨酸残基、赖氨酸残基、谷氨酸残基发生化学反应，形成共价键，从而抑制相应蛋白的生物学功能。与非共价抑制剂相比较，共价抑制剂最重要的一个优点就是与靶蛋白的结合具有高亲和性并具有相对较长的作用时效，因为共价化合物与靶点结合会比同类非共价药物的结合牢固得多，因此可以有效提升药物分子的抗肿瘤活性，解决已有药物产生耐药性的问题。

基于此，设计不可逆共价结合抑制剂或许是改进现有帕博西尼疗效的有效手段。2021年，Rui Li等报道了帕博西尼丙烯酸衍生物(European Journal of MedicinalChemistry,2021,219,113432)，如代表性化合物A1等，其生物活性研究发现该类衍生物活性普遍较弱，仅对H1299和MDA-MB-453肿瘤细胞显示出中等抑制活性，对MDA-MB-231和MCF-7几乎无活性。分析其原因，很可能是靶点(即CDK4/6)中对应的氨基酸残基与化合物中的Michael加成电子受体反应活性太弱，无法形成不可逆共价键，因此无法发挥预期的效果。

本发明中化合物A1结构

发明内容

发明目的：为了提升帕博西尼的疗效，克服其在临床使用中产生耐药性的问题，本发明提供了一类不可逆共价结合CDK抑制剂，本发明通过在帕博西尼分子结构的哌嗪环上引入丙烯酸/苯丙烯酸结构的取代基团，并通过在其碳碳双键上引入具有不同电性效应的及位阻效应的取代基团，以此调节其Michael加成反应活性，加强其不可逆激酶抑制活性，尤其是以此增强其对CDK不可逆共价抑制活性；同时苯丙烯酸结构片段自身具有抗肿瘤活性，通过其发挥协同作用，从而提高化合物的抗肿瘤活性，并克服耐药性。

本发明同时提供了其制备方法及其在治疗恶性肿瘤方面的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种不可逆共价结合CDK抑制剂，所述抑制剂的结构如下式I所示：

其中，R为

中的任一基团。

作为优选，所述不可逆共价结合CDK抑制剂，其结构选自如下任意一种：

化合物1-1：

化合物1-2：

化合物1-3：

化合物1-4：

化合物1-5：

化合物2-1：

化合物2-2：

化合物2-3：

化合物2-4：

本发明所述的不可逆共价结合CDK抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

帕博西尼与对应的羧酸，在缩合剂和碱性试剂存在下，经缩合反应制备得到；

其合成路线如方程式1所示：

方程式1

其中，R为

中的任一基团。

其中，所述缩合剂为DCC、HATU或CDI中任意一种。

其中，所述碱性试剂为DMAP、DIPEA或三乙胺中任意一种。

作为优选，所述帕博西尼、羧酸、缩合剂、碱性试剂的摩尔比为1:1～1.3:1～1.5:1～1.5。

本发明所述的不可逆共价结合CDK抑制剂在制备在治疗恶性肿瘤药物中的应用。

其中，所述恶性肿瘤包括乳腺癌、肺癌，进一步地为帕博西尼耐药的乳腺癌。

本发明所述的治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述药物组合物其包含权利要求1所述的不可逆共价结合CDK抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体。

其中，所述不可逆共价结合CDK抑制剂与载体的组合物剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

本发明设计的不可逆共价结合CDK抑制剂其结构中含有Michael加成电子受体，通过与靶点结构中的电Michael加成电子供体进行共价结合，增强药物分子活性，在治疗恶性肿瘤方面有较好的应用前景。

本发明针对帕博西尼临床应用时会产生耐药性且抗肿瘤谱窄等问题，本发明通过在帕博西尼分子结构的哌嗪环上引入丙烯酸/苯丙烯酸结构的取代基团，并通过在其碳碳双键上引入具有不同电性效应的及位阻效应的取代基团，以此调节其Michael加成反应活性，加强其不可逆激酶抑制活性，尤其是以此增强其对CDK不可逆共价抑制活性；同时苯丙烯酸结构片段自身具有抗肿瘤活性，通过其发挥协同作用，从而提高化合物的抗肿瘤活性，并克服耐药性。

现有的帕博西尼其与靶标CDK4/6相应的氨基酸残基通过分子间作用力发挥作用，其作用力相对较弱，且容易产生耐药性。化合物A1在帕博西尼侧链上引入了丙烯酸结构片段，具有形成共价键结合的潜力。然而，前期研究发现，该化合物生物活性普遍较弱，仅对H1299和MDA-MB-453肿瘤细胞显示出中等抑制活性，对MDA-MB-231和MCF-7几乎无活性。本发明实验发现，化合物A1与Michael加成供体反应活性太弱，难以形成不可逆共价键，因此激酶抑制活性较弱，且无法克服帕博西尼的耐药性。本发明化合物在碳碳双键两侧有取代基，可以调节双键加成活性，继而调节抗肿瘤活性。而A1没有上述功能。本发明通过在帕博西尼侧链末端分别引入丙烯酰胺、肉桂酰胺等Michael加成电子受体基团，并在受体基团不饱和双键两侧引入具有不同电性效应的取代基团，以此调节其Michael加成反应活性及生物活性。研究发现，该类化合物可经过不可逆共价结合方式靶标蛋白，其激酶抑制活性及抗增殖活性显著优于帕博西尼，并且对CDK4/6具有很好的选择性，而且还可以有效克服帕博西尼耐药性，在治疗恶性肿瘤方面有较好的应用前景。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过在帕博西尼侧链末端分别引入丙烯酰胺、肉桂酰胺等Michael加成电子受体基团，并在受体基团不饱和双键两侧引入具有不同电性效应的取代基团，以此调节其Michael加成反应活性及生物活性。研究发现，该类化合物可经过不可逆共价结合方式靶标蛋白，其Michael加成反应活性强，激酶抑制活性及抗增殖活性显著优于帕博西尼，其中化合物1-2对CDK6的抑制活性比帕博西尼提升了3倍，对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的抗增殖活性提升了20倍，同时对人非小细胞肺癌A549活性也显著提升，提示该化合物抗瘤谱更广。体外实验还表明，该类化合物可以有效抑制帕博西尼耐药肿瘤细胞株增值，提示其可以克服帕博西尼耐药性，在治疗耐药性恶性肿瘤方面有较好的应用前景，本发明该类化合物可由帕博西尼与相应的羧酸经一步反应制得，制备工艺简便，可以大规模生产使用。

附图说明

图1为化合物1-2与巯基乙醇共孵育12h后液相图；

图2为化合物1-2与巯基乙醇加成产物质谱图；

图3为化合物2-4与巯基乙醇共孵育12h后液相图；

图4为化合物2-4与巯基乙醇加成产物质谱图；

图5为化合物A1与巯基乙醇共孵育24h后液相图；

图6为化合物1-2与靶点蛋白CDK6(PDB code:2euf)关键氨基酸残基作用示意图；

图7为化合物1-2(即图中的绿色配体)、帕博西尼(即图中的红色配体)与靶点蛋白CDK6(PDB code:2euf)关键氨基酸残基作用的3D叠加图；

图8为化合物2-4与靶点蛋白CDK6(PDB code:2euf)关键氨基酸残基作用示意图；

图9为化合物2-4(即图中的绿色配体)、帕博西尼(即图中的红色配体)与靶点蛋白CDK6(PDB code:2euf)关键氨基酸残基作用的3D叠加图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；

DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；

CDI：羰基咪唑；

DMAP：4-二甲氨基吡啶；

DCC：二环己基碳二亚胺。

实施例1

(E)-6-乙酰基-2-((5-(4-(但-2-烯酰基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-8-环戊基-5-甲基吡啶酮[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮的制备(化合物1-1)的制备

将2-丁烯酸溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，在搅拌的条件下向其中加入HATU，继续搅拌5分钟，在向反应体系中加入DIPEA，搅拌3分钟，然后向溶液中加入帕博西尼(2-丁烯酸：HATU：DIPEA：帕博西尼的摩尔比为1.3：1.5：1.5：1)，55℃加热反应6小时。TCL监测反应进行情况，待反应物的点完全消失，停止反应。用旋转蒸发仪除去溶剂，再加入二氯甲烷和水进行分液、萃取，取有机相。用无水硫酸钠干燥有机相后，除去溶剂。再向其中加入少量的二氯甲烷，至刚好可以将产品溶解。然后向其中加入石油醚，可以观察黄色固体析出，过滤后得粗产品。最后粗产品制砂提纯，通过柱层析法纯化后得产物(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇＝100:1)，收率82.3％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝502.2561；

¹H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.81(s,1H),8.21(d,J＝8.9Hz,1H),8.04(d,J＝2.6Hz,1H),7.33-7.37(m,1H),6.93(dq,J＝13.7,6.8Hz,1H),6.28-6.33(m,1H),5.86(dd,J＝17.9,8.9Hz,1H),3.81(d,J＝65.6Hz,4H),3.20–3.15(m,4H),2.55(s,3H),2.37(s,3H),2.07(s,3H),1.89-1.93(m,4H),1.26(d,J＝8.2Hz,4H),0.88(t,J＝6.9Hz,1H).

实施例2

(E)-6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-((5-(4-(4,4,4-三氟-2-烯酰基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物1-2)的制备

以4,4,4-三氟丁烯酸代替2-丁烯酸，使用CDI为缩合剂，DMAP为碱试剂，4,4,4-三氟丁烯酸：CDI：DMAP：帕博西尼的摩尔比为1.0：1.0：1.0：1.0，其他方法同实施例1，收率80％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝570.2435；

¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.00(s,1H),8.01(s,1H),7.89(s,1H),7.77(d,J＝9.2Hz,1H),7.45(dd,J＝15.4,2.1Hz,1H),6.81(dd,J＝15.4,7.1Hz,1H),5.89–5.82(m,1H),3.79–3.72(m,5H),3.25(s,4H),2.44(s,3H),2.34(s,3H),2.26-2.19(m,2H),1.93(s,2H),1.84–1.76(m,2H),1.28–1.21(m,2H).

实施例3

(E)-6-乙酰基-8-环戊基-2-((5-(4-(3-环丙基丙烯基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物1-3)的制备

以3-环丙基丙烯酸代替2-丁烯酸，使用DCC为缩合剂，DMAP为碱试剂，其他方法同实施例1，产率为77.3％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝542.2874；

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.81(s,1H),8.24(d,J＝8.6Hz,1H),8.02(s,1H),7.38(d,J＝7.8Hz,1H),6.42–6.38(m,1H),5.90–5.82(m,1H),3.82(d,J＝48.5Hz,4H),3.23–3.11(m,4H),2.55(s,3H),2.37(s,3H),2.09–2.06(m,1H),1.92–1.84(m,2H),1.60(s,4H),1.25(s,4H),0.93(td,J＝6.7,4.5Hz,2H),0.65(dd,J＝4.5,2.0Hz,1H).

实施例4

6-乙酰基-8-环戊基-2-((5-(4-(2-氟丙烯基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物1-4)的制备

以2-氟丙烯酸代替3-环丙基丙烯酸，其他同实施例3，产率为75％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝530.2142；

¹H NMR(600MHz,DMSO)δ8.88(s,1H),8.03(s,1H),7.80(s,1H),7.75(d,J＝9.2Hz,1H),7.45(dd,J＝15.4,2.1Hz,1H),6.81(dd,J＝15.4,7.1Hz,1H),5.89–5.82(m,1H),3.79–3.72(m,5H),3.25(s,4H),2.44(s,3H),2.34(s,3H),2.26-2.19(m,2H),1.93(s,2H),1.84–1.75(m,2H),1.28–1.20(m,2H).

实施例5

6-乙酰基-8-环戊基-2-((5-(4-(2-氰基丙烯基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物1-5)的制备

以2-氰基丙烯酸代替3-环丙基丙烯酸，其他同实施例3，产率为75％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝538.2007；

¹H NMR(600MHz,DMSO)δ9.05(s,1H),8.22(s,1H),7.89(s,1H),7.77(d,J＝9.2Hz,1H),7.45(dd,J＝15.4,2.1Hz,1H),6.81(dd,J＝15.4,7.1Hz,1H),5.89–5.82(m,1H),3.77–3.70(m,5H),3.29(s,4H),2.44(s,3H),2.34(s,3H),2.26-2.19(m,2H),1.93(s,2H),1.84–1.76(m,2H),1.28–1.21(m,2H).

实施例6

6-乙酰基-2-((5-(4-肉桂酰哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-8-环戊基-5-甲基吡啶酮[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物2-1)的制备

以苯丙烯酸为原料，三乙胺代替DMAP，其他方法同实施例2，产率为76.5％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝578.2874；

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.83(s,1H),8.43(s,1H),8.25(d,J＝9.1Hz,1H),8.05(s,1H),7.72(d,J＝15.4Hz,1H),7.55(s,1H),7.54(s,1H),7.39(s,1H),7.38(s,1H),6.92(d,J＝15.4Hz,1H),5.83-5.92(m,1H),3.90(d,J＝38.1Hz,4H),3.26–3.21(m,4H),2.55(s,3H),2.38(s,3H),2.36–2.31(m,2H),2.08(dd,J＝8.0,5.6Hz,2H),1.92–1.85(m,2H),1.70(dd,J＝10.5,5.4Hz,2H).

实施例7

(E)-6-乙酰基-8-环戊基-2-((5-(4-(3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基吡啶基[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物2-2)的制备

以3,4-二甲氧基苯丙烯酸为原料，其他方法同实施例2制备化合物2-2，产率为81.3％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝638.3085；

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.83(s,1H),8.43(s,1H),8.25(d,J＝9.1Hz,1H),8.05(s,1H),7.72(d,J＝15.4Hz,1H),7.55(s,1H),7.54(s,1H),7.39(s,1H),7.38(s,1H),6.92(d,J＝15.4Hz,1H),5.83-5.92(m,1H),3.90(d,J＝38.1Hz,4H),3.26–3.21(m,4H),2.55(s,3H),2.38(s,3H),2.36–2.31(m,2H),2.03-2.10(m,2H),1.92–1.85(m,2H),1.60-1.72(m,2H).

实施例8

(E)-6-乙酰基-8-环戊基-2-((5-(4-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-5-甲基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(化合物2-3)的制备

以3-甲氧基-4-羟基苯丙烯酸为原料，其他方法同实施例2制备化合物2-3，产率为79.5％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝624.2929；

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.82(s,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),8.06(d,J＝2.8Hz,1H),7.66(d,J＝15.3Hz,1H),7.36(dd,J＝9.1,2.9Hz,1H),7.12(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),7.01(d,J＝1.8Hz,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.75(d,J＝15.3Hz,1H),5.84-8.91(m,1H),3.94(s,3H),3.87-3.91(m,4H),3.49(s,1H),3.25–3.20(m,4H),2.55(s,3H),2.37(s,3H),2.35(dd,J＝14.0,5.7Hz,2H),2.11–2.03(m,2H),1.92–1.85(m,2H).

实施例9

(E)-2-(4-(6-((6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧基-7,8-二氢吡啶[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羰基)-3-苯丙烯腈的制备

以2-氰基-3-苯基丙烯酸为原料，其他方法同实施例1制备化合物2-4，产率为56％。

ESI-MS:[M+H]⁺＝603.2827；

1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),8.23(d,J＝9.0Hz,1H),8.14(d,J＝2.6Hz,1H),7.91(s,1H),7.90(d,J＝1.4Hz,1H),7.81(s,1H),7.54–7.51(m,1H),7.50(s,1H),7.49–7.47(m,1H),7.37(dd,J＝9.1,2.9Hz,1H),5.91–5.84(m,1H),3.90–3.88(m,4H),3.30–3.25(m,4H),2.54(s,3H),2.38(s,3H),2.36–2.33(m,2H),2.09-2.05(m,2H),1.90–1.86(m,2H),1.71–1.67(m,2H).

实施例10

本发明的化合物的CDK激酶及肿瘤细胞抑制活性测试

应用激酶试剂盒以及MTT法分别测定了本发明公开的化合物及帕博西尼、化合物A1对CDK激酶(CDK4/6/9/12)以及肿瘤细胞的抑制活性。

激酶活性测定：将待测化合物以及化合物A1分别溶解在100％DMSO中，配制成250.0μmol/L的储存液。用1x kinase base buffer稀释配制1、10、50、250、1250nM(测试终浓度)溶液。选用空白DMSO及帕博西尼分别为阴性和阳性对照。用分液器Echo 550向目的板转移受试化合物溶液，在96孔板的每个孔中加入待测化合物溶液，然后向每孔中加入0.1μg/mL酶溶液10.0μL，在室温下孵育10min。接下来，每孔加入10.0μL底物和ATP的混合液，在37℃培养箱中孵育60min。再向每孔加入25.0μL的反应终止缓冲液。用Caliper仪读取数据，计算抑制率，并绘制回归曲线测得IC₅₀值。

MTT细胞实验：将处于对数生长期的MDA-MB-231和A549细胞以1×10⁵cells/mL的密度接种于96孔板中，并让其粘附过夜。细胞贴壁以后，给药进行测试。首先将受试目标化合物以及化合物A1分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配成2mmol/L的溶液。然后再分别用培养基稀释为1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L。另外，未经药物处理的细胞作为阴性对照组，帕博西尼为阳性对照。将不同浓度的药物添加到测试孔中，将细胞在37℃培养箱中孵育72h。随后加入10μL5 mg/mL的MTT溶液再孵育4h。4h后移除上清液，向其中加入150μL DMSO取代培养基，使甲臜沉淀充分溶解，用全波长酶标仪在490nm波长下测定每孔OD值吸光度值，计算细胞生长抑制率，通过SPSS18软件或公式计算出所需要的IC₅₀值。

抑制率的计算公式如下：

抑制率％＝(空白组OD值-给药组OD值)/空白组OD值×100％

结果如下表1所示：

表1、本发明公开的化合物及帕博西尼、化合物A1对CDK激酶(CDK4/6/9/12)以及肿瘤细胞的抑制活性。

由上述表1结果可见，阳性对照帕博西尼对CDK4、6显示出强效的抑制活性，IC₅₀值分别为26、38nM，而对CDK9、12几乎无活性，提示其为CDK4、6选择性抑制剂。相似的，本发明所公开的化合物也显示了良好的CDK4、6选择性抑制活性，特别是化合物1-2和化合物2-4，其活性较之帕博西尼明显提升。在测试中，化合物A1活性最弱，其IC₅₀值分别为59、112nM，提示其对靶点活性降低。

在细胞实验中，阳性对照帕博西尼对CDK4、6对两株肿瘤细胞均显示出强效的抑制活性，IC₅₀值分别为4.72、3.07μM，而本发明所公开的化合物细胞抑制活性明显提升，所有化合物的活性均优于阳性对照，特别是化合物1-2和化合物2-4，其对MDA-MB-231细胞的抑制活性较之帕博西尼分别提升了20倍和5倍，对A549的抑制活性均提升了5倍，表明本发明通过引入高反应性的Michael加成受体的设计思想是成功的。在测试中，化合物A1活性最弱，其对MDA-MB-231几乎无活性，对A549细胞的IC₅₀值也仅为13.2μM，显著高于阳性对照及本发明的化合物。

实施例11

体外对帕博西尼耐药细胞株的抑制活性

选用化合物1-2和2-4为代表性化合物，连同帕博西尼及化合物A1一起开展MTT实验(方法同实施例10的MTT)，测定其对帕博西尼耐药的MDA-MB-231细胞抑制活性，以判断受试化合物克服肿瘤耐药的潜力，测试结果如表2下：

表2、化合物1-2、2-4、A1及帕博西尼对帕博西尼耐药的MDA-MB-231细胞株的抑制活性。

^a耐药指数＝对帕博西尼耐药的MDA-MB-231细胞IC₅₀值/对非耐药的MDA-MB-231细胞IC₅₀值

从上述表2结果可见，帕博西尼对耐药株的活性急剧下降，其耐药指数达到10以上；A1对耐药株同样未显示出明显活性。而本发明的化合物1-2、2-4仍然对耐药株显示了非常好的抑制活性，其IC₅₀值分别达到了0.218、0.720μM，未见任何耐药现象，提示受试化合物可以很好地避免与帕博西尼的交叉耐药性。这很可能与该类化合物的不可逆共价结合作用模式有关。

实施例12

本发明化合物的Michael加成活性测试

利用HPLC法(色谱柱：Agilent zorbax sb-Aq C18(规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温为25℃；进样量为5μL；流动相：甲醇：水＝10:90，v/v；流速为0.8ml/min；检测波长为215nm)，选择体外活性较好的化合物1-2(1μM)和2-4(1μM)，与过量的巯基乙醇在pH7.0缓冲液中于37℃进行体外共孵育12h，检测其共价加成产物生成情况，以此模拟其与靶点蛋白的作用情况，判断其Michael加成的反应活性。测试结果如图1～图5所示。

由图1～图4可见，化合物1-2、2-4与Michael加成供体巯基乙醇共培养12h后均可生成Michael加成产物，其结构已由质谱进行确证，提示这两个化合物具有较好的Michael加成反应活性。而从图5可见，化合物A1虽然也含有丙烯酰胺结构，但与巯基乙醇即使共培养24h，也未见明显的加成产物生成，表明其共价结合活性很弱，这很可能是因为A1中碳碳双键两侧缺乏电性诱导基团(如强吸电子基团)，致使其亲电加成能力不足。该检测结果与体外的激酶抑制活性以及细胞抑制活性相符，也间接证明了受试化合物的不可逆共价结合活性与其生物活性密切相关。

实施例13

化合物1-2、2-4与CDK6模拟对接研究

在体外证实了化合物1-2、2-4具有较强的Michael加成反应活性后，为进一步验证化合物1-2、2-4与靶点蛋白氨基酸残基是否具有共价结合的潜力，又利用MOE(MolecularOperating Environment)软件模拟了化合物1-2、2-4与靶点蛋白CDK6(PDB code:2euf)的结合及作用模式，其对接结果如图6～图9所示。

由上述结果可见，化合物1-2、2-4均能有效的进入CDK6的活性口袋，其最优结合构象与帕博西尼的最优构象具有较高的重合性，表明化合物1-2、2-4作为帕博西尼的衍生物，其和靶点蛋白的作用模式与帕博西尼相似。具体而言，化合物1-2的嘧啶并吡啶酮结构中，其嘧啶酮羰基及乙酰酮羰基可分别与Lys43、Glu21形成强力的氢键作用，同时其哌嗪及丙烯酰胺结构片段位于蛋白的溶剂区域，并通过疏水作用稳定配体-受体复合体(详见图6、图7)。相似地，化合物2-4主要利用芳胺基以及氰基与Lys43、Ala23、Val101等残基作用，同时，其丙烯酰胺结构片段同样伸向口袋外部(详见图8、图9)。需要注意的是，无论是化合物1-2还是2-4，其丙烯酰胺结构片段都十分接近CDK的Thr106、Thr107残基，通过MOE的“measure”功能模块测量Thr106、Thr107残基的羟基与化合物1-2、2-4碳碳双键的距离，发现其数值在

之间，完全处于成键范围内，表明化合物1-2、2-4碳碳双键很可能与Thr106、Thr107进行共价加成。结合前述的酶活性、细胞活性及体外的加成实验的结果，可以进一步推断本发明所公开的化合物为不可逆共价结合CDK4/6选择性抑制剂，并且不可逆结合作用力更强，因而生物活性也会变强，并且有利于克服耐药性。

Claims (10)

1.一种不可逆共价结合CDK抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的结构如下式I所示：

其中，R为

中的任一基团。

2.一种权利要求1所述的不可逆共价结合CDK抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

帕博西尼与对应的羧酸，在缩合剂和碱性试剂存在下，经缩合反应制备得到；

其合成路线如方程式1所示：

其中，R为

中的任一基团。

3.根据权利要求2所述的不可逆共价结合CDK抑制剂的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为DCC、HATU或CDI中任意一种。

4.根据权利要求2所述的不可逆共价结合CDK抑制剂的制备方法，其特征在于，所述碱性试剂为DMAP、DIPEA或三乙胺中任意一种。

5.根据权利要求2所述的不可逆共价结合CDK抑制剂的制备方法，其特征在于，所述帕博西尼、羧酸、缩合剂、碱性试剂的摩尔比为1:1～1.3:1～1.5:1～1.5。

6.一种权利要求1所述的不可逆共价结合CDK抑制剂在制备***药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为帕博西尼耐药的乳腺癌。

9.一种***的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物其包含权利要求1所述的不可逆共价结合CDK抑制剂或其药学上可接受的盐作为活性成分和药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述不可逆共价结合CDK抑制剂与载体的组合物剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

Images