CN114940953A - 一种枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备方法与应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备方法与应用，该枯草芽孢杆菌YN‑42(L)为从健康的人参根际土壤中分离、筛选、纯化出的一株高效拮抗人参病原真菌的生防细菌。本发明的有益效果为：本发明提供的枯草芽孢杆菌YN‑42(L)，具有高效的拮抗人参病原真菌和促生长能力，对人参尖孢镰刀菌、锈腐菌、黑斑菌、立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌、链格孢菌、腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌等病原真菌有高效的拮抗作用；此外，以其为原料制备的生防菌剂，能够预防病原真菌，肥效持久，绿色安全，加快生根，缓解重茬。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体来说，涉及一种枯草芽孢杆菌及其 生防菌剂的制备方法与应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)别名黄参、地精、神草等，为五加科人 参属多年生宿根草本植物。传统功效为补气固脱、生津安神，现代药理研究表 明其具有抗炎、抗衰老、抗抑郁、抗老年痴呆、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗 病毒等作用。此外，人参芦头、花蕾、茎、叶等均具有一定的药用价值。
随着人参药理研究的深入，人参应用范围越来越广，因此，人参的需求量 有逐年递增趋势。我国虽是人参的生产大国，但主要是以人工栽培人参(园参) 为主，供应国内外市场。由于栽参土壤要30年后才能再栽参，即人参不能重 茬，否则人参根部则病害加重，导致人参植株正常生长受阻，病害加重，损失 50％～70％，严重者绝收，严重影响着人参的品质与产量，给参农造成严重的 经济损失，也严重影响着临床用药安全。
目前在防治人参病害的问题上主要采取农业防治、化学防治和生物防治三 种方法。但由于危害人参根部组织的病原菌为土传病原菌，采用传统的农业防 治方法和措施不仅工程较大、耗时久而且不能从根本上控制病害，防治效果不 太稳定；此外，长期使用化学农药使得病原菌在产生抗药性的同时又破坏了土 壤的微生物环境，加重了农药对环境的污染，造成人参毒害物质残留过高。因 此，寻找一条更为安全有效的防治方法去控制土传病害的发生和危害势在必 行。生物防治因其环境友好和无药物残留、绿色可持续发展等特点已成为当前 国内外防治植物土传病害的研究热点，具有较为广阔的应用前景。
经过查阅文献梳理发现，现有生防菌剂的制备工艺存在一定的缺陷，具体 如下：
专利号CN102199563A中涉及到的摇瓶发酵制备生防菌剂的方法，该方法 以芽孢杆菌CC09为种子液，在37℃、100r/min的条件下在PDA培养基种发 酵48h，在发酵液中添加3％(w/v)表面活性剂OP-103％(w/v)防腐剂水杨酸 钠和2％(w/v)抗冻剂尿素，得到芽孢杆菌CC09菌株的生防菌剂，但是该方 法存在操作复杂的缺点。
专利号CN114107132A中涉及到一种有氧液态发酵方法，该方法将菌株 HM-1置于发酵培养基中进行有氧液态发酵，发酵好后，接种于LB液体培养 基中，在30℃、150～220r/min下培养20～24h，得到液态菌剂后，将其与300～500 目的硅藻土熟料粉，按照5:1的重量比混合，经搅拌后进行干燥，得HM-1固 态菌剂，但是该方法存在抑菌种类少、成本较大的缺点。
专利号CN102154186A中涉及到另一种生防菌剂的制备方法，该方法将枯 草芽孢杆菌TPb55接种于肉汤培养基中，摇瓶振荡培养至对数期，按10％的 接种量接种于种子罐，培养至对数生长期，再以10％接种量接种于生产罐发酵 培养，发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型，但是 该方法存在菌种易受损、环境易污染的缺点。
专利号CN114134064A中涉及到发酵上清液的制备方法，该方法将枯草芽 孢杆菌接种于发酵培养基中，置于28℃摇床中180r/min培养12h，将菌液 3000r/min离心10min，用滤膜孔径为0.2um的细菌过滤器将菌体过滤去除， 得到发酵上清液，但是该方法存在费时费工、不宜批量生产的缺点。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的 制备方法与应用，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
本发明的构思如下：从重茬种植的人参地中选择生长旺盛人参植株，收集 根际土壤，从中分离筛选并纯化对多种人参致病真菌具有高效拮抗活性的枯草 芽孢杆菌YN-42(L)，经培养制成生防菌剂，用于人参病害的防治以及促进人 参生长。
具体的，本发明采用的具体技术方案如下：
根据本发明的一个方面，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)，该枯草 芽孢杆菌为从健康的人参根际土壤中分离、筛选、纯化出的一株高效拮抗 人参病原真菌的生防细菌，具体的，本发明首先挖取重茬老参地中依旧茁 壮生长的健康人参6株，将其根际土壤抖落后统一收集，然后分离筛选并 纯化共145株，最后通过平行对峙实验筛选有效拮抗人参病原真菌的生防 细菌。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)属于芽孢杆菌属(Bacillus Cohn)，所述生防细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
根据本发明的另一个方面，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮抗 人参病原真菌中的应用，所述病原真菌为人参尖孢镰刀菌、毁灭柱孢菌和 黑斑菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于 92％。
作为可选的，所述病原真菌为人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌 和链格孢菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等 于88％。
作为可选的，所述病原真菌为腐皮镰孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和 灰葡萄孢菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等 于76.4％。
作为可选的，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)在含100mg/L色氨酸的King 培养液中分泌吲哚乙酸的浓度为46.58mg/L。
根据本发明的又一个方面，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的 生防菌剂，所述生防菌剂包括以下重量百分比的原料：
枯草芽孢杆菌YN-42(L)10～15％和枯草芽孢杆菌YN-42(L)培养基 85～90％。
根据本发明的再一个方面，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的 生防菌剂的制备方法，该生防菌剂采用二级好氧分批发酵技术制备得到， 包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于种子培养基中，培养制成一级生 防细菌原液；
S2、将一级生防细菌原液按照预设质量分数的接种量接种于发酵培养 基中，并培养、通气，控制枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在预设范围内， 得到二级生防细菌混悬液；
S3、对二级生防细菌混悬液的pH进行调节，分装得到成品。
进一步的，所述种子培养基包括以下原料：酵母膏5.0g、蛋白胨10.0g、 氯化钠10.0g及水1L；所述发酵培养基包括以下原料：酵母膏80.0g、蛋白 胨5.0g、氯化钠10.0g、磷酸氢二钾3.0g、硫酸镁0.5g、糖蜜50.0g及水1L。
进一步的，所述种子培养基的pH为7.0～7.2，所述发酵培养基的pH 为6.5～7.0。
进一步的，所述接种量采用质量分数为2％的接种量接种。
进一步的，所述培养的温度为36℃～38℃，所述培养的时间为36h～40h。
进一步的，所述通气量为0.2～0.8L/dm2/min。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数的预设范围为4.42× 1011cfu/ml～10.76×1012cfu/ml。
进一步的，所述对二级生防细菌混悬液的pH进行调节，分装得到成品 包括以下步骤：将二级生防细菌混悬液的pH调节至7.0，并分装得到成品。
本发明的有益效果为：
1)本发明提供的枯草芽孢杆菌YN-42(L)，具有高效的拮抗人参病原 真菌和促生长能力，对人参尖孢镰刀菌、锈腐菌、黑斑菌、立枯丝核菌、 灰霉菌、茄子菌核菌、链格孢菌、腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、 人参核盘菌和灰葡萄孢菌等病原真菌有高效的拮抗作用；此外，以其为原 料制备的生防菌剂，能够预防病原真菌，肥效持久，绿色安全，加快生根， 缓解重茬。
2)本发明提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)，对人参多种病原真菌的防 治效果十分明显，其中对人参尖孢镰刀菌，锈腐菌、黑斑菌的抑菌率大于等于 92％，对人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌、链格孢菌抑菌率大于等于88％， 对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌抑菌率大于 等于76.4％。
3)本发明在接种枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液的处理组人参根盘上无菌 丝生长。在盆栽药效试验中，对比老参地对照组，在种植人参后使用由枯草芽 孢杆菌为原料制备的生防菌剂后，可以使人参的鲜重提高大于等于216.08％， 湿重提高大于等于156.09％，折干率增加大于等于0.5％，还使人参的须根数 增多大于等于33.33％，主根增长大于等于22.48％，根茎加粗大于等于27.31％， 具有显著的促生长特点。
4)本发明在种植人参后使用由枯草芽孢杆YN-42(L)为原料制备的生防菌 剂，使得人参锈腐病的发病率仅低至13.3％，对人参锈腐病的防治效果高达 84.16％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是 本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的 前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌 剂的制备方法的流程示意图；
图2是根据本发明实施例的一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌 剂的制备方法的原理示意图；
图3是根据本发明实施例中枯草芽孢杆菌YN-42(L)的形态学情况示意图；
图4是根据本发明实施例中枯草芽孢杆菌YN-42(L)的16S rDNA序列*** 发育树。
图中：
a、枯草芽孢杆菌YN-42(L)的菌落情况；b、枯草芽孢杆菌YN-42(L)的革 兰染色情况；c、枯草芽孢杆菌YN-42(L)的扫描电镜情况。
具体实施方式
为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容 的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例 的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实 施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通 常用来表示类似的组件。
根据本发明的实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌及其生防菌剂的制备方 法与应用。
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，根据本发明的一个实施 例，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)，该枯草芽孢杆菌为从健康的人参 根际土壤中分离、筛选、纯化出的一株高效拮抗人参病原真菌的生防细菌， 所述生防细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
根据本发明的另一个实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮 抗人参病原真菌中的应用，所述病原真菌为人参尖孢镰刀菌、毁灭柱孢菌 和黑斑菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于 92％。
可选的，所述病原真菌为人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌和链 格孢菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于 88％。所述病原真菌为腐皮镰孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌， 且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于76.4％。所 述枯草芽孢杆菌YN-42(L)在含100mg/L色氨酸的King培养液中分泌吲哚 乙酸的浓度为46.58mg/L。
根据本发明的又一个实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备 的生防菌剂，所述生防菌剂包括以下重量百分比的原料：
枯草芽孢杆菌YN-42(L)10～15％和枯草芽孢杆菌YN-42(L)培养基 85～90％。
根据本发明的再一个实施例，如图1-2所示，提供了一种枯草芽孢杆 菌YN-42(L)制备的生防菌剂的制备方法，该生防菌剂采用二级好氧分批发 酵技术制备得到，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于种子培养基中，培养制成一级生 防细菌原液；
其中，所述种子培养基包括以下原料：酵母膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯 化钠10.0g及水1L；所述种子培养基的pH为7.0～7.2，
S2、将一级生防细菌原液按照预设质量分数的接种量接种于发酵培养 基中，并培养、通气，控制枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在预设范围内， 得到二级生防细菌混悬液；
其中，所述发酵培养基包括以下原料：酵母膏80.0g、蛋白胨5.0g、氯 化钠10.0g、磷酸氢二钾3.0g、硫酸镁0.5g、糖蜜50.0g及水1L。所述发酵 培养基的pH为6.5～7.0。所述接种量采用质量分数为2％的接种量接种。所 述培养的温度为36℃～38℃，所述培养的时间为36h～40h。所述通气量为 0.2～0.8L/dm2/min。所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数的预设范围为4.42 ×1011cfu/ml～10.76×1012cfu/ml。
S3、对二级生防细菌混悬液的pH进行调节，分装得到成品。
其中，所述对二级生防细菌混悬液的pH进行调节，分装得到成品包括 以下步骤：将二级生防细菌混悬液的pH调节至7.0，并分装得到成品。
为了方便理解本发明的上述技术方案，以下就本发明在实际过程中的具体 实施例进行详细说明。
实施例1：
人参连作土壤拮抗细菌菌株的分离和筛选
(1)拮抗细菌菌株的分离
土壤样本于2018年6月采集自吉林省左家镇一个3年生的人参种植园。 采集健康人参6株。在离主根约2cm处采集土壤，从根中轻轻剥离根际土壤。 所有土壤样品放入无菌塑料袋中，处理前置于4℃保存。采用连续稀释平板法 分离细菌，称取10.0g土样于250mL三角瓶中，并加入90mL无菌水，在振摇 钱加入适量小玻璃珠。在35℃，转速200r/min的条件下充分振荡40min，制 成土壤悬浮液备用。然后用无菌水依次稀释10倍，稀释浓度至10-4，10-5，10-6， 10-7，4个系列浓度。采用无菌接种环划线涂布于(5.0g酵母粉，10.0g蛋白胨，10.0g氯化钠，15.0g琼脂，1L蒸馏水，pH值7.2)的牛肉膏平板培养基上， 30℃于恒温培养箱中培养12h。选取具有代表性且形态不一致的单个菌落，纯 化并保存备用。
(2)生防细菌菌株的活性筛选
采用平板对峙法进行拮抗活性测定。在无菌操作台内用直径为6mm的打 孔器在培养3d的病原真菌菌落边缘打取菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于距 PDA平板中央2cm处，同时在距PDA平板中央2cm的另一侧用接种环接种 拮抗细菌菌饼。对照组只接种病原真菌。每个处理重复3次。28℃培养5d， 测量处理组平板菌丝的生长直径，按下式计算抑菌率：
抑菌率(％)＝(Dc-Dt)/Dc×100％
其中Dc代表对照组平板菌丝的生长直径，Dt代表处理组平板菌丝的生长 直径。
分别以人参尖孢镰刀菌、锈腐菌、黑斑菌、人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄 子菌核菌、链格孢菌、腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰 葡萄孢菌为供试病原菌，采用平板对峙法对分离出的人参连作土壤生防细菌菌 株进行抗菌活性测定，结果见表1。从145株细菌中共筛选出有拮抗活性的细 菌38株，其中生防细菌YN-42(L)对以上人参的病原真菌均有明显且高效的拮 抗作用，其中，对人参尖孢镰刀菌，毁灭柱孢菌、黑斑菌的抑菌率大于等于 92％，对人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌、链格孢菌的抑菌率大于等于88％，对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌的抑 菌率大于等于76.4％。
表1生防细菌YN-42(L)对12种人参病原真菌的拮抗作用
实施例2:
生防细菌YN-42(L)的鉴定
(1)生防细菌YN-42(L)的菌落形态特征和生理生化特性
将生防细菌YN-42(L)在LB培养基上25℃培养3d。选取分离的纯菌，按 照《实验微生物学》第三版的要求，观察并记录菌株的生长情况、形态和颜色 等特征形态指标，根据《常见细菌***鉴定方法手册》和《伯杰测定细菌学手 册》，对四种菌株进行生理生化检测测定。
结果见表2与图3。革兰氏染色结果显示生防细菌YN-42(L)这株生防细菌 均为革兰氏阳性菌，在平板上观察到生防细菌YN-42(L)在LB培养基上菌落为 白色，形状呈椭圆形，不透明边缘不整齐，菌落中间有明显突起；结合表3 生理生化特性测试结果，初步判断生防细菌YN-42(L)为芽孢杆菌属。
表2 LB琼脂平板上各菌株菌落形态
表3生防细菌YN-42(L)的生理生化特征
+代表反应为阳性，-代表反应为阴性。
(2)分子鉴定
生防细菌YN-42(L)的***发育分析
通过对细菌菌株16S rDNA保守序列(ITS)测序进行分子鉴定。使用天根生 化科技有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取所选菌株的总基因组DNA。采 用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)对16S rRNA基因进行PCR扩增。 在以下条件下进行放大：在96℃初始变性5分钟，然后在96℃变性20秒，在62℃退火0.5分钟，在72℃延伸0.5分钟，在72℃延伸10分钟。3μLPCR产 物进行1％的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。使用PCR产物磁珠法纯化试 剂盒来纯化PCR产物。将纯化后的PCR产物进行上机检测。最后对测序结果 进行NCBI-BLAST比对。采用MEGA 6.0版本进行***发育和分子进化分析 利用1000个重复的bootstrap分析，采用NJ法重建***发育树，明确生防菌 株的***发育地位。
将生防细菌YN-42(L)的16S rDNA分子测序结果经过MEGA6.0软件对相 近序列构建***发育树后发现，发现生防细菌YN-42(L)与枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis菌株Y17B的相似性100％，因此确定YN-42(L)为枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)。
枯草芽孢杆菌YN-42(L)的16S rDNA序列***发育树如图4所示。
实施例3:
枯草芽孢杆菌YN-42(L)拮抗毁灭柱孢菌的根盘实验
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.0的种子培养基中，37℃，转速 为200r/min的条件下培养12h，调整枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液的OD600 在0.1～0.2之间。将毁灭柱孢菌在PDA培养基上培养7d，用蒸馏水冲洗孢子， 将收集到的孢子悬液调整为100孢子/mL。将毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液喷在 根盘上，在超净台上风干15分钟后接种枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液。将经 过细菌和真菌处理的人参根盘置于水浸过的滤纸上，25℃培养至腐烂。所有试 验设3个重复，以只接种毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液的人参根盘为对照组，观 察菌丝生长和腐烂情况。
实施例4:
枯草芽孢杆菌YN-42(L)拮抗毁灭柱孢菌的根盘实验
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.0的种子培养基中，37℃，转速 为200r/min的条件下培养12h，调整枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液的OD600 在0.2～0.4之间。将毁灭柱孢菌在PDA培养基上培养7d，用蒸馏水冲洗孢子， 将收集到的孢子悬液调整为150孢子/mL。将毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液喷在 根盘上，在超净台上风干15分钟后接种枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液。将经 过细菌和真菌处理的人参根盘置于水浸过的滤纸上，25℃培养至腐烂。所有试 验设3个重复，以只接种毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液的人参根盘为对照组，观 察菌丝生长和腐烂情况。
实施例5:
枯草芽孢杆菌YN-42(L)拮抗毁灭柱孢菌的根盘实验
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.0的种子培养基中，37℃，转速 为200r/min的条件下培养12h，调整枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液的OD600 在0.4～0.6之间。将毁灭柱孢菌在PDA培养基上培养7d，用蒸馏水冲洗孢子， 将收集到的孢子悬液调整为200孢子/mL。将毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液喷在 根盘上，在超净台上风干15分钟后接种枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液。将经 过细菌和真菌处理的人参根盘置于水浸过的滤纸上，25℃培养至腐烂。所有试 验设3个重复，以只接种毁灭柱孢菌分生孢子悬浮液的人参根盘为对照组，观 察菌丝生长和腐烂情况。
实施例6:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为6.8的种子培养基中，25℃培养 12h，制成OD600＝0.4的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为4％的接种量接种于pH为6.5的发酵培养基中，25℃培养12h，通气量为 0.2L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在4.42×1011cfu/ml～8.86×1012 cfu/ml，将二级生防细菌混悬液调节pH至6.8，分装得到成品。
实施例7:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.0的种子培养基中，30℃培养 16h，制成OD600＝0.6的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为3％的接种量接种于pH为6.8的发酵培养基中，30℃培养20h，通气量为 0.4L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在5.36×1011cfu/ml～9.18×1012 cfu/ml。将二级生防细菌混悬液调节pH至6.8，分装得到成品。
实施例8:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)这株生防细菌接种于pH为7.1的种子培养基 中，35℃培养18h，制成OD600＝0.8的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原 液用质量分数为2％的接种量接种于pH为7.0的发酵培养基中，35℃培养24h， 通气量为0.6L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在6.46×1011 cfu/ml～10.76×1012cfu/ml。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.0，分装得到成 品。
实施例9:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)这株生防细菌接种于pH为7.2的种子培养基 中，37℃培养20h，制成OD600＝1.0的一级生防细菌原液。将一级生防细菌 原液用质量分数为1％的接种量接种于pH为6.5的发酵培养基中，37℃培养 28h，通气量为0.2L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在4.48×1011 cfu/ml～8.58×1012cfu/ml。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.0，分装得到成品。
实施例10:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为6.8的种子培养基中，40℃培养 24h，制成OD600＝1.0的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为1％的接种量接种于pH为6.8的发酵培养基中，40℃培养30h，通气量为 0.2L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在6.38×1011cfu/ml～9.06×1012 cfu/ml范围内。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.0，分装得到成品。
实施例11:
一种以枯草芽孢杆菌为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.0的种子培养基中，25℃培养 20h，制成OD600＝0.8的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为2％的接种量接种于pH为7.0的发酵培养基中，25℃培养34h，通气量为 0.4L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在5.88×1011 cfu/ml～9.56×1012cfu/ml范围内。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.2，分装 得到成品。
实施例12:
一种以枯草芽孢杆菌YN-42(L)为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.1的种子培养基中，30℃培养 18h，制成OD600＝0.6的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为3％的接种量接种于pH为6.5的发酵培养基中，30℃培养36h，通气量为 0.4L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在5.42×1011cfu/ml～7.18×1012 cfu/ml范围内。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.2，分装得到成品。
实施例13:
一种以枯草芽孢杆菌YN-42(L)为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.2的种子培养基中，35℃培养 16h，制成OD600＝0.5的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为4％的接种量接种于pH为6.8的发酵培养基中，35℃培养38h，通气量为 0.6L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在6.18×1011cfu/ml～9.86×1012 cfu/ml。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.0，分装得到成品。
实施例14:
一种以枯草芽孢杆菌YN-42(L)为原料的生防菌剂的制备方法，步骤如下：
将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于pH为7.2的种子培养基中，40℃培养 14h，制成OD600＝0.4的一级生防细菌原液。将一级生防细菌原液用质量分数 为5％的接种量接种于pH为7.0的发酵培养基中，37℃培养40h，通气量为 0.6L/dm2/min，枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在4.42×1011cfu/ml～10.76×1012 cfu/ml。将二级生防细菌混悬液调节pH至7.0，分装得到成品。
实施例15:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在25℃，160r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.1左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种拮抗细菌和病原菌。在每株人参根部周围均匀灌入 5mL生防菌剂，3d后再以同样方法接种等量的人参毁灭柱孢菌菌悬液。以只 灌入人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重 复6株人参。于采收期取样1次。
实施例16:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在30℃，180r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防菌剂和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入10mL生防菌剂，3d后再以同样方法接种等量的人参毁灭柱孢 菌菌悬液。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入8mL生防菌剂。以只灌入 人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复6 株人参。于采收期取样1次。
实施例17:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在35℃，200r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.1左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入10mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的 生防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入10mL生防菌剂。以只灌 入人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复 6株人参。于采收期取样1次。
实施例18:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在25℃，180r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入5mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的生 防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入10mL生防菌剂。以只灌入 人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复6 株人参。于采收期取样1次。
实施例19:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在30℃，200r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入8mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的生 防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入8mL生防菌剂。以只灌入人 参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复6 株人参。于采收期取样1次。
实施例20:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在35℃，160r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养3d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入8mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的生 防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入8mL生防菌剂。以只灌入人 参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复6 株人参。于采收期取样1次。
实施例21:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在37℃，200r/min条件下培养5天后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入10mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的 生防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入10mL生防菌剂。以只灌 入人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复 6株人参。于采收期取样1次。
实施例22:
采用上述实施例14制备得到的生防菌剂防治人参锈腐病的盆栽药效试验
人参毁灭柱孢菌接种体的制备：在无菌操作台内用Φ＝5mm打孔器从培养 3d后的菌落边缘打取10块菌饼，放入装有PDA液体培养基的500mL三角瓶 中，在40℃，200r/min条件下培养5d后备用，将OD值调节至0.2左右。
将3年生人参种植在
大小的花盆中，培养30d左右进行于盆 栽试验。采用灌根法接种生防细菌和人参毁灭柱孢菌菌悬液。在每株人参根部 周围均匀灌入10mL人参毁灭柱孢菌菌悬液，3d后再以同样方法接种等量的 生防菌剂。5d后再次于每株人参根部周围均匀灌入10mL生防菌剂。以只灌 入人参毁灭柱孢菌而不灌入生防菌剂为对照。每个处理设3次重复，每个重复 6株人参。于采收期取样1次。
人参植株病情分级标准：0级表示根部没有可见病斑，1级表示根部病斑 直径0.9mm，2级表示根部病斑1.0～4.0mm，3级表示根部病斑4.1～7.0mm，4 级表示根部病斑大于7.0mm，5级表示病斑侵染整个根部。计算公式如下：
发病率(％)＝发病植株数/总株数×100
生防菌剂对人参锈腐病防治效果见表4。采收期取样发现，对照组人参锈 腐病发病率高达73％，病情指数为77.35。而实施例15的人参锈腐病发病率为 16.7％，病情指数为14.68；实施例16的人参锈腐病发病率为25％，病情指数 为18.75；实施例17的人参锈腐病发病率仅为13.3％，病情指数为12.25，实 施例18的人参锈腐病发病率仅为12.6％，病情指数为12.18，实施例19的人 参锈腐病发病率仅为11.8％，病情指数为10.65，实施例20的人参锈腐病发病 率仅为15.4％，病情指数为13.48，实施例21的人参锈腐病发病率仅为17.7％， 病情指数为15.60，实施例22的人参锈腐病发病率仅为10.8％，病情指数为10.47。
根据病性指数计算出防治效果，结果表明接种一种以枯草芽孢杆菌 YN-42(L)为原料的生防菌剂对人参锈腐病的防治效果十分明显，各处理对人参 锈腐病的防治效果在75.76％以上，其中以实施例22的防治效果最好，达到 84.46％。
结果证明：对比老参地对照组，在种植人参后使用一种以枯草芽孢杆菌 YN-42(L)为原料的生防菌剂后，可以使人参的鲜重提高大于等于216.08％，湿 重提高大于等于156.09％，折干率增加大于等于0.5％，还使人参的须根数增 多大于等于33.33％，主根增长大于等于22.48％，根茎加粗大于等于27.31％， 具有显著的促生长特点。
表4生防菌剂对人参锈腐病盆栽防效结果
通过上述实例证明，通过本发明制备的生防菌剂能够有效拮抗人参多种病 原真菌，使人参的发病率显著降低，生长状况得到显著改善，可在种植人参前， 大面积进行预防使用。
上述实施例均于吉林省长春市长春中医药大学药用植物资源圃进行，真实 性可查。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，提供了一种枯草芽孢杆菌 YN-42(L)对人参多种病原真菌的防治效果十分明显，其中对人参尖孢镰刀菌， 锈腐菌、黑斑菌的抑菌率大于等于92％，对人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌 核菌、链格孢菌抑菌率大于等于88％，对腐皮镰孢菌、毁灭柱孢菌、恶疫霉菌、 人参核盘菌和灰葡萄孢菌抑菌率大于等于76.4％。而从人参根盘实验的效果可 以看出，接种锈腐病致病真菌毁灭柱抱菌3d后的对照组人参根盘已长满菌丝， 而接种枯草芽孢杆菌YN-42(L)菌悬液的处理组人参根盘上无菌丝生长。在盆 栽药效试验中，对比老参地对照组，在种植人参后使用由枯草芽孢杆菌为原料 制备的生防菌剂后，可以使人参的鲜重提高大于等于216.08％，湿重提高大于 等于156.09％，折干率增加大于等于0.5％，还使人参的须根数增多大于等于33.33％，主根增长大于等于22.48％，根茎加粗大于等于27.31％，具有显著的 促生长特点。除此之外，在种植人参后使用由枯草芽孢杆YN-42(L)为原料制 备的生防菌剂后，人参锈腐病发病率仅低至13.3％，对人参锈腐病的防治效果 高达84.16％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)，其特征在于，该枯草芽孢杆菌为从健康的人参根际土壤中分离、筛选、纯化出的一株高效拮抗人参病原真菌的生防细菌。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)，其特征在于，所述生防细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
3.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮抗人参病原真菌中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)为权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)，所述病原真菌为人参尖孢镰刀菌、毁灭柱孢菌和黑斑菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于92％。
4.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮抗人参病原真菌中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)为权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)，所述病原真菌为人参立枯丝核菌、灰霉菌、茄子菌核菌和链格孢菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于88％。
5.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮抗人参病原真菌中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)为权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)，所述病原真菌为腐皮镰孢菌、恶疫霉菌、人参核盘菌和灰葡萄孢菌，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)对该病原真菌的抑菌率大于等于76.4％。
6.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)在拮抗人参病原真菌中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)为权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)，且所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)在含100mg/L色氨酸的King培养液中分泌吲哚乙酸的浓度为46.58mg/L。
7.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂以权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)为活性成分，且所述生防菌剂包括以下重量百分比的原料：
枯草芽孢杆菌YN-42(L)10～15％和枯草芽孢杆菌YN-42(L)培养基85～90％。
8.一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌剂的制备方法，用于权利要求7所述的枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌剂的制备，其特征在于，该生防菌剂采用二级好氧分批发酵技术制备得到，包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌YN-42(L)接种于种子培养基中，培养制成一级生防细菌原液；
S2、将一级生防细菌原液按照预设质量分数的接种量接种于发酵培养基中，并培养、通气，控制枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数在预设范围内，得到二级生防细菌混悬液；
S3、对二级生防细菌混悬液的pH进行调节，分装得到成品。
9.根据权利要求8所述的一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下原料：酵母膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g及水1L；所述发酵培养基包括以下原料：酵母膏80.0g、蛋白胨5.0g、氯化钠10.0g、磷酸氢二钾3.0g、硫酸镁0.5g、糖蜜50.0g及水1L。
10.根据权利要求8所述的一种枯草芽孢杆菌YN-42(L)制备的生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的pH为7.0～7.2，所述发酵培养基的pH为6.5～7.0，所述二级生防细菌混悬液的pH为7.0；
所述接种量采用质量分数为2％的接种量接种，所述培养的温度为36℃～38℃，所述培养的时间为36h～40h，所述通气量为0.2～0.8L/dm2/min，所述枯草芽孢杆菌YN-42(L)的活菌数的预设范围为4.42×1011cfu/ml～10.76×1012cfu/ml。
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