CN114907981B - 一种菠萝泛菌固态菌剂的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及涉及微生物技术领域，具体涉及一种菠萝泛菌固态菌剂的保存方法。所述保存方法具体为：将菠萝泛菌固态菌剂与固体载体混合，搅拌均匀，室温条件下静置培养24~48h后，真空密封包装，置于20~25℃干燥处保存；其中，所述固体载体由40重量份麸皮、25重量份玉米芯、15重量份椰壳15和20重量份硅藻土组成。本发明的保存方法操作简便，容易实施，并且能够长期有效保存菠萝泛菌固态菌剂的活力，保本发存12个月后有效活菌数达2.8×1012 cfu/g。利用本发明的保存方法制备的菠萝泛菌菌剂，对雷公藤有明显的促生作用，能够明显提高雷公藤叶绿素含量、甲素含量及生物量，值得大力推广。
Description
技术领域
本发明涉及涉及微生物技术领域，具体涉及一种菠萝泛菌固态菌剂的保存方法。
背景技术
由于具有多种药理活性，加之又是天然生物原料，雷公藤已成为目前国内外研究中最热门的中药材之一。但是，药物需求的急剧增加，也造成了对雷公藤天然资源的掠夺性开发，使的雷公藤资源面临枯竭。由于植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合成方法。因此，人工栽培雷公藤已成为当前满足市场需求，保护自然资源的重要手段。然而，大部分雷公藤植物原料的还是来源于散户种植，由于缺乏科学的技术指导，农药化肥的过量滥用现象，使其无论是在产量还是品质上都受到了影响，出现了不同程度的污染物超标、品种退化、抗病虫和草害能力严重下降等问题，导致出产的雷公藤原料经济效益并不高。因而，加强雷公藤种植的规范化程度，开发出具有实际应用价值的高效、安全的绿色微生物制剂，以提高我省雷公藤的产量、改善其品质、将资源优势转化为经济优势，对于实现我省雷公藤产业的快速发展就显得尤为必要。
植物内生菌是指那些在其生活史中的某一段或全部时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的菌。已有的研究表明，内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，其对宿主植物的生长和生理生化均会产生重要的影响。目前，内生菌在促进作物生长、病害防治、虫害防治、线虫防治和抗非生物胁迫等方面的应用研究均取得一定的进展，而通过研究内生菌与作物之间的相互作用，内生菌对作物的生物学功能已经得到证实。而在药用植物方面，一些内生菌除了具有益生功能之外，自身还可以产生或促进宿主药用活性物质的积累，如果将其转接进入植物体内，不但可以提高中药材的产量还可以增加其有效成分含量，提升其“道地”品质。然而，由于内生菌均筛选自植物体内，对外界环境条件相对敏感，如何长期保藏并维持一定的菌体活性是影响其应用的重要因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菠萝泛菌固态菌剂的保存方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一种菠萝泛菌固态菌剂的保存方法，其是将菠萝泛菌固态菌剂与固体载体混合，搅拌均匀，室温条件下静置培养24~48h后，真空密封包装，置于20~25℃干燥处保存；其中，所述固体载体由40重量份麸皮、25重量份玉米芯、15重量份椰壳15和20重量份硅藻土组成。
进一步的，上述的菠萝泛菌固态菌剂与固体载体的重量比为1:20。
进一步的，上述的菠萝泛菌固态菌剂的制备方法包括如下步骤：
1）将低温保存的菠萝泛菌接种到LB固体培养基上，于30℃条件下倒置培养36 h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30℃、180 rpm条件下培养24 h，得到种子液；
2）将种子液以1vol%的接种量接种至LB液体培养基中，在30℃、180 rpm条件下发酵培养36 h，随后将发酵液在4℃、4000g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀，用无菌水将菌体沉淀重悬配制成浓度为1.0×109 cfu/mL的菌悬液；
3）取1L菌悬液，向其中添加320g冻干保护剂，搅拌混匀后进行预冻；预冻结束后真空冷冻干燥，得到菌种冻干粉，即为菠萝泛菌LY-3固态菌剂。
进一步的，上述的菠萝泛菌为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）LY-3，其已于2013年3月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7371。
进一步的，上述的冻干保护剂由100重量份脱脂奶粉、120重量份海藻酸钠和100重量份甘油组成。
进一步的，上述的预冻的具体方法为：设置降温速率为0.3℃/min，冷却至-15~-20℃，恒温预冻12h。
进一步的，上述的真空冷冻干燥的具体方法为：预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到20 pa时，维持此真空度并以1℃/30min的速率升温，样品升温至5℃时，保持24小时，结束冻干过程。
本发明还提供了上述的保存方法在制备提高雷公藤叶绿素含量的微生物菌剂中的应用。
本发明还提供了上述的保存方法在制备提高雷公藤甲素含量的微生物菌剂中的应用。
本发明还提供了上述的保存方法在制备提高雷公藤生物量的微生物菌剂中的应用。
本发明的显著优点在于：
本发明的保存方法操作简便，容易实施，并且能够长期有效保存菠萝泛菌固态菌剂的活力，保存12个月后有效活菌数达2.8×1012 cfu/g。利用本发明的保存方法制备的菠萝泛菌菌剂，对雷公藤有明显的促生作用，能够明显提高雷公藤叶绿素含量、甲素含量及生物量，值得大力推广。
附图说明
图1为与固体载体混合的菠萝泛菌LY-3固态菌剂。
图2为菌剂对雷公藤植株的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
本发明所用菌种材料菠萝泛菌LY-3，其分类命名为菠萝泛菌（Pantoea ananatis），已于于2013年3月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为：CGMCC No.7371，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述菠萝泛菌LY-3是从从雷公藤组织中分离、纯化获得的，其在平面培养基上正面黄色，背面黄褐色，单个圆形；周生鞭毛；菌落常表现为圆形、湿润、光滑、质地均匀。该菌株由宝生物工程（大连）有限公司进行16s rDNA扩增及序列测定，并通过在NCBI中比对，鉴定为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）。
实施例1 菠萝泛菌LY-3固态菌剂的制备
（1）培养基的制备：
1）LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，无菌水1000 mL，pH7.0-7.2。
2）LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，无菌水1000 mL，pH 7.0-7.2。
（2）菌种活化：
将低温保存的菠萝泛菌LY-3接种到LB固体培养基上，于30℃条件下倒置培养36h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30℃、180 rpm条件下培养24 h，用作种子液。
（3）菌悬液的制备：
将种子液以1vol%的接种量接种至LB液体培养基中，在30℃、180 rpm条件下发酵培养36 h，随后将发酵液在4℃、4000 g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀；用无菌水将菌体沉淀重悬配制成浓度为1.0×109 cfu/mL的菌悬液。
（4）菌种冻干：
取1L菌悬液，向其中添加由100 g脱脂奶粉、120 g海藻酸钠和100 g甘油组成的冻干保护剂，搅拌混匀后进行预冻，设置降温速率为0.3℃/min，冷却至-20℃，恒温预冻12 h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到20 pa时，维持此真空度并以1℃/30min的速率升温，样品升温至5℃时，保持24小时，结束冻干过程，得到菌种冻干粉，即为菠萝泛菌LY-3固态菌剂。该菌剂中的活菌数为1.3×1010 cfu/g。
实施例2 一种菠萝泛菌LY-3固态菌剂的保存方法
（1）固体载体的制备：
所述固体载体由40重量份麸皮、25重量份玉米芯、15重量份椰壳、20重量份硅藻土组成，将这些原料混合后粉碎过60-80目筛，再于121℃高压灭菌30分钟，灭菌后放在40℃的干燥箱内鼓风烘干40 h，备用。
（2）菠萝泛菌LY-3固态菌剂的保存
将菠萝泛菌LY-3固态菌剂与固体载体按照1:20的质量比混合，搅拌均匀，室温条件下静置培养48h后，真空包装，置于20~25℃干燥处密封保存。
图1为与固体载体混合的菠萝泛菌LY-3固态菌剂。
分别在保存1、2、3、6、12个月后，抽取样品检测活菌数，结果如下表所示。12个月后，固态菌剂活菌数高达2.8×1012 cfu/g，而不与固体载体混合时，活菌数仅为2.2×107，表明采用本发明的保存方法，能有效保证菠萝泛菌LY-3固态菌剂的菌体低死亡率，有助于菠萝泛菌LY-3固态菌剂的推广应用。
表1：菌体数量随时间的变化
在保存12个月后，抽取样品检测其对雷公藤的促生作用。取20g保存的菌剂，与1000mL无菌水混合，搅拌均匀，按50mL/株施入雷公藤幼苗根际，自然生长三个月后，取样测定雷公藤幼苗全株生物量、叶片叶绿素含量及根部甲素含量。以无菌水作为对照。结果如图2和表2所示，生长三个月后的雷公藤幼苗，可发现施加菌剂的雷公藤幼苗的生长情况明显优于对照组，根系更加发达，生物量、叶片叶绿素含量、根部甲素含量均明显提高；具体的，相较于对照组幼苗，施加菌剂的雷公藤幼苗的生物量增加了22.53%、叶片叶绿素含量增加了33.33%、根部雷公藤甲素含量提高了35.54%。
表2：菌剂对雷公藤的促生作用
Claims (1)
1.一种菠萝泛菌固态菌剂的制备和保存方法，其特征在于：将菠萝泛菌固态菌剂与固体载体混合，搅拌均匀，室温条件下静置培养24~48h后，真空密封包装，置于20~25℃干燥处保存；其中，所述固体载体由40重量份麸皮、25重量份玉米芯、15重量份椰壳和20重量份硅藻土组成；所述的菠萝泛菌固态菌剂与固体载体的重量比为1:20；
所述的菠萝泛菌固态菌剂的制备方法包括如下步骤：
1）将低温保存的菠萝泛菌接种到LB固体培养基上，于30℃条件下倒置培养36h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30℃、180rpm条件下培养24h，得到种子液；
2）将种子液以1vol%的接种量接种至LB液体培养基中，在30℃、180rpm条件下发酵培养36h，随后将发酵液在4℃、4000g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀，用无菌水将菌体沉淀重悬配制成浓度不低于1.0×108cfu/mL的菌悬液；
3）取1L菌悬液，向其中添加320g冻干保护剂，搅拌混匀后进行预冻；预冻结束后真空冷冻干燥，得到菌种冻干粉，即为菠萝泛菌LY-3固态菌剂；
所述的菠萝泛菌为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）LY-3，其已于2013年3月27日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7371；
所述的冻干保护剂由100重量份脱脂奶粉、120重量份海藻酸钠和100重量份甘油组成；
所述的预冻的具体方法为：设置降温速率为0.3℃/min，冷却至-20℃，恒温预冻12h；
所述的真空冷冻干燥的具体方法为：预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到20pa时，维持此真空度并以1℃/30min的速率升温，样品升温至5℃时，保持24小时，结束冻干过程。
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