CN114903055B - 一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用 - Google Patents
一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用，涉及微生物菌剂领域，解决了现有技术中采用化学农药防治大白菜黑斑病，存在农药残留及环境污染的问题。本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂包括如下重量份的组分：巨大芽孢杆菌CRP‑4菌粉25份～65份、分散剂15份～25份、表面活性剂5份～15份、保护剂1份～6份和载体10份～80份。该防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂，在白菜黑斑病发病前或发病初期使用，能够保护未发病作物不再受黑斑病菌的侵染；对于已经发病的作物，能够起很好地治疗作用，能够明显防治病菌的扩展；将防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释1000倍～2000倍后喷雾于叶面，菌液能够被叶片完全吸收，不留下任何表面残留、不会造成环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用。
背景技术
大白菜黑斑病是由芸薹链格孢等引起的、发生在大白菜的病害。大白菜黑斑病主要发生在大白菜的外叶或外层叶球上，子叶、叶柄、花梗和种荚也可能被害。叶片发病表现为：叶片上产生小黑点，病斑逐渐扩大，形成黑褐色同心轮纹，病斑周围有时有黄色黄晕，病斑直径2-6毫米；或从叶边缘发病，形成褐色至黑褐色同心轮纹，后期多个病斑汇合，有时中间穿孔或破裂。植株下部叶片常发病严重，后逐渐发展到上部叶片，直至整株枯死。
白菜是十字花科，白菜类蔬菜黑斑病在国内发生普遍。近几年，白菜类黑斑病发病率在甘肃呈现上升趋势，原本抗病的品种也出现发病情况。该病仅危害十字花科蔬菜，以白菜、甘蓝及花椰菜发生较多，除病害严重时造成减产外，叶球、花球外观受污损后品质降低，种株染病不仅影响种子产量，并可使种子带菌；而白菜受害则叶片变苦，影响食用。
目前在黑斑病防治方面，均是通过使用大量化学农药，如70％代森锰锌可湿性粉剂、75％百菌清可湿性粉剂等进行防治。化学农药在白菜黑斑病防治上具有一定的防治效果，但随着化学农药的长期使用，农药残留及环境污染问题愈发严重。因此，研究开发新的防治白菜黑斑病的生防菌剂受到广泛关注。但目前通过生防菌剂防治白菜黑斑病的研究还很少，因此，开发生防菌剂剂型防治白菜黑斑病的研究有着重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提出一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用，解决了现有技术中采用化学农药防治大白菜黑斑病，存在农药残留及环境污染的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂，包括如下重量份的组分：巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉25份～65份、分散剂15份～25份、表面活性剂5份～15份、保护剂1份～6份和载体10份～80份。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其编号为CRP-4，保藏登记号为CGMCC No.18458，保藏日期2019年09月02日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的巨大芽孢杆菌编号为CRP-4，是从云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚内分离出的菌株。该菌株在室内对黑斑孢子的萌发具有明显的抑制作用。从16SrDNA序列相似性比对分析结果和***发育树可知，CRP-4与巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)亲缘关系最近，同源性最高，相似度均达99％，根据***发育树相似性和同源性分析，菌株CRP-4和Bacillus megaterium位于同一分支，两者进化关系和距离最近，相似度达100％，结合形态特征、培养特征和生理生化特征，鉴定此菌株为巨大芽胞杆菌。
根据一个优选实施方式，所述巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉是以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，经过活化、培养、发酵、离心和干燥后制得的。
根据一个优选实施方式，所述巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉中的有效活菌数不低于1000亿/克。
根据一个优选实施方式，所述分散剂包括十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸盐和木质素磺酸钠中的一种或多种；所述表面活性剂包括木质素磺酸钠；所述保护剂包括***胶和羧甲基纤维素钠中的一种或两种，所述载体包括轻质碳酸钙、硅藻土和高岭土中的一种或多种。
根据一个优选实施方式，所述分散剂包括以下重量份组分中的一种或多种：十二烷基硫酸钠1份～10份、烷基萘磺酸盐10份～25份、木质素磺酸钠1份～6份。
根据一个优选实施方式，所述保护剂包括以下重量份组分中的一种或两种：***胶1份～6份、羧甲基纤维素钠1份～5份。
根据一个优选实施方式，所述载体包括以下重量份组分中的一种或多种：轻质碳酸钙20份～35份、硅藻土10份～25份、高岭土10份～20份。
本发明中任一项技术方案所述的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的制备方法，包括如下步骤：
制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉；
将巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉25份～65份、分散剂15份～25份、表面活性剂5份～15份、保护剂1份～6份和载体10份～80份复配后制得防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂。
根据一个优选实施方式，制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：
菌种活化：将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4；
种子液制备：用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液；
发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养36h～48h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液，并且巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液的有效活菌数不低于40×108cfu/g；
离心并干燥：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体，
在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加可溶性淀粉及硅藻土，再将添加可溶性淀粉及硅藻土的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉。
本发明中任一项技术方案所述的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂在防治大白菜黑斑病上的应用，在大白菜黑斑病发病前或发病初期，将防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释1000倍～2000倍后，喷雾于叶面。
本发明提供的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用至少具有如下有益技术效果：
本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂，通过制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，再将巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉、分散剂、表面活性剂、保护剂和载体按比例复配后制得，在十字花科植物种植过程中，在白菜黑斑病发病前或发病初期使用，能够保护未发病作物不再受黑斑病菌的侵染；对于已经发病的作物，本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂能够起很好地治疗作用，能够铲除已经侵入植物体内的病菌，能够明显防治病菌的扩展；另一方面，将防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释1000倍～2000倍后，喷雾于叶面，菌液能够被叶片完全吸收，不留下任何表面残留、不会造成环境污染，对田间动物以及田间动物的天敌等生物活动不会产生任何不良影响，并且不容易使植物产生抗药性。
即本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂、制备方法和应用，解决了现有技术中采用化学农药防治大白菜黑斑病，存在农药残留及环境污染的技术问题。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合实施例1～5对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例对本发明巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉的制备过程进行详细说明。
本实施例制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：
S1：菌种活化。将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4。优选的，巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化时间例如是12h、14h或16h。
S2：种子液制备。用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50mlLB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液。
S3：发酵液制备。按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养36h～48h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液，并且巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液的有效活菌数不低于40×108cfu/g。优选的，发酵温度例如是36.5℃、37℃或37.5℃。优选的，发酵时间例如是36h、42h或48h。
S4：离心并干燥。将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体；在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加可溶性淀粉及硅藻土，再将添加可溶性淀粉及硅藻土的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉，并且巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉中的有效活菌数不低于1000亿/克。
根据一个优选实施方式，步骤S1中，LB固体培养基包括如下重量的组分：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L和水1L。
根据一个优选实施方式，步骤S2中，LB液体培养基包括如下重量的组分：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L和水1L。
根据一个优选实施方式，步骤S3中，发酵料培养基包括如下重量的组分：黄豆粉1.0％～1.6％、蔗糖0.1％～0.5％、蛋白胨0.2％～0.6％、玉米粉0.2％～0.6％、碳酸钙0.3％～0.9％、鱼粉0.1％～0.3％、硫酸铵0.01％～0.08％、硫酸镁0.02％～0.05％、磷酸二氢钾0.01％～0.04％、磷酸氢二钾0.02％～0.05％、硫酸锰0.01％～0.04％、氢氧化钠0.01％～0.04％、氯化钠0.02％～0.03％、消泡剂0.5％～1.5％，余量为水，用盐酸或氢氧化钠调节pH至6.8-7.5。
实施例2
本实施例对本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂中分散剂的筛选进行详细说明。
将实施例1获得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉与载体(例如为硅藻土)混合，再将其与分散剂混合干燥，分别取分散剂各2g与菌粉1g混合均匀，向其内依次加入47mL蒸馏水，充分混匀，制得不同的制剂，观察混合物在水中分散情况。分散剂为三聚磷酸钠、木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸盐和拉开粉，测定加入分散剂后的菌粉的可湿特性。
表1可湿性粉剂中分散剂的筛选结果表
| 名称 | 分散性 | 润湿时间/s |
| 烷基萘磺酸盐 | +++ | 12.15 |
| 十二烷基硫酸钠 | +++ | 10.79 |
| 木质素磺酸钠 | +++ | 10.30 |
| 三聚磷酸钠 | + | 16.31 |
| 拉开粉 | － | 20.12 |
注：+++表示分散性最好(沉降率＜10％)，++表示分散性次之(沉降率＜20％)，+表示分散性一般(沉降率＜30％)，－表示不能均匀分散。
由表1可知，三聚磷酸钠和拉开粉润湿时间长，且分散性较差；而木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸钠的润湿时间较短，且分散性较好，可用于可湿性粉剂的分散剂。因此，选择烷基萘磺酸钠、十二烷基硫酸钠和木质素磺酸钠作为可湿粉剂的分散剂。
实施例3
本实施例对本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂中保护剂的筛选进行详细说明。
通过保护剂对菌含量的影响来判断保护剂的效果。具体的，将保护剂羧甲基纤维素钠、***胶、腐殖酸及脱脂奶粉按5％的量配入到LB固体培养基中制成LB平板，同时设置不添加保护剂的平板作为对照，将巨大芽孢杆菌菌悬液稀释至10-7涂布于含有保护剂及空白对照ck1的LB平板上，每个处理涂布2个平板，涂布后打开紫外灯照射5min，培养于35℃恒温培养箱中，于24h后计数其平板上菌落数，同时设置不开紫外照射的空白对照ck2平板，同样培养于35℃恒温培养箱中，于24h后计数其平板上菌落数。
可湿性粉剂中保护剂的筛选结果如表2所示。由表2可知：通过紫外照射的处理，添加保护剂的菌落数均好于不添加保护剂(ck1)的菌落数；相比于腐殖酸作为保护剂而言，羧甲基纤维素钠、***胶、脱脂奶粉均是较优的选择，而考虑到成本问题，脱脂奶粉不适宜大规模生产运用，因此更优选为羧甲基纤维素钠和***胶作为可湿性粉剂的保护剂添加。
表2可湿性粉剂中保护剂的筛选结果表
| 处理 | 菌落数(个/板) |
| 羧甲基纤维素钠 | 37 |
| ***胶 | 37.5 |
| 腐殖酸 | 31 |
| 脱脂奶粉 | 39 |
| ck1 | 20 |
| ck2 | 52 |
注：上述表中菌落数为2个平板统计平均数。
实施例4
本实施例对本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的制备过程进行详细说明。
将分散剂十二烷基硫酸钠1份～10份、烷基萘磺酸盐10份～25份，表面活性剂木质素磺酸钠1份～6份，保护剂***胶1份～6份、羧甲基纤维素钠1份～5份中的一种或两种组合，及载体硅藻土10份～25份混匀后备用。将混匀的助剂及载体通过气流粉碎机粉碎，再加入其主要成分巨大芽孢杆菌菌粉28份～48份再次混匀。粉碎混匀后制备的巨大芽孢可湿性粉剂能通过325目的网筛，且润湿时间小于2min，分散性极好，悬浮率大于85％。通过稀释1000倍后喷施在白菜叶片上的展着性较好。因此，可以根据上述配比确定防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的制备方法及其配方，其配方如下表3所示。
表3防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的配方
实施例5
本实施例对本发明防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的药效实验进行详细说明。
试验设在昆明市安宁市云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚中进行。共设置4个处理，分别为：
A、防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释1000倍处理；
B、防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释2000倍处理；
C、70％甲基硫菌灵可湿性粉剂稀释800倍处理；
D、清水处理。
在白菜植株发病后开始处理，第1次喷施后隔3天进行第2次处理，处理之前调查黑斑病的发病情况，处理后1、4、7天进行病害调查，调查植株所有受害叶片上的病斑面积，根据发病面积进行分级，分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占叶片面积的5％以下；
3级：病斑面积占叶片面积的6％～10％；
5级：病斑面积占叶片面积的11％～20％；
7级：病斑面积占叶片面积的21％～40％；
9级：病斑面积占叶片面积的41％以上；
按照上述调查处理前后的病害严重程度，计算其病情指数及防治效果。公式如下：
由表4可知：A、B、C三种处理对白菜黑斑病均有明显的防治效果，总体来看三种处理防效逐渐增强，病情指数除对照组处理之外，A、B、C三种处理病情指数都比起始低。其中，处理1d后，处理C的防效达到70.64％，速效性强；处理A的防效次之，达到57.58％；处理B的防效最低，为43.14％。处理3d后，第4天统计结果为：处理C和处理A的防效无明显差别，分别为78.41％和73.06％；而处理B的防效为41.67％，与处理C、处理A有差异。在处理后7d，处理C的效果最好，处理A次之，处理B再次之，其防治效果均达到81％以上，已达到预期的防治效果。因此，可以得出：防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂对白菜黑斑病有明显的防治作用，其稀释倍数优选为1000倍-2000倍，若发病较重地块可选择稀释1000倍处理，发病较轻则选择稀释2000倍处理，均能防治白菜黑斑病的发生与扩散。
表4不同处理对大白菜黑斑病的防治效果统计表
注：表中同列数据后不同小写字母表示0.05水平差异显著。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂，其特征在于，包括如下重量份的组分：巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉25份～65份、分散剂15份～25份、表面活性剂5份～15份、保护剂1份～6份和载体10份～80份，
所述巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉是以巨大芽孢杆菌CRP-4为菌种，经过活化、培养、发酵、离心和干燥后制得的，
所述巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉中的有效活菌数不低于1000亿/克，
所述分散剂为十二烷基硫酸钠和烷基萘磺酸盐中的一种或两种；所述表面活性剂为木质素磺酸钠；所述保护剂为***胶和羧甲基纤维素钠中的一种或两种，所述载体为硅藻土；
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其编号为CRP-4，保藏登记号为CGMCCNo.18458，保藏日期2019年09月02日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉；
将巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉25份～65份、分散剂15份～25份、表面活性剂5份～15份、保护剂1份～6份和载体10份～80份复配后制得防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂。
3.根据权利要求2所述的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，制备巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉包括如下步骤：
菌种活化：将﹣80℃下保存的巨大芽孢杆菌CRP-4在LB固体培养基上活化12h～16h，得活化的巨大芽孢杆菌CRP-4；
种子液制备：用无菌接种环刮取一环活化的巨大芽孢杆菌CRP-4接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得巨大芽孢杆菌CRP-4种子液；
发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1∶120的比例将巨大芽孢杆菌CRP-4种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下培养36h～48h，得巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液，并且巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液的有效活菌数不低于4.0×109cfu/g；
离心并干燥：将巨大芽孢杆菌CRP-4发酵液经设备倒料进入离心机，在离心机转速为4000rpm/min条件下制备巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体，
在巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体中添加可溶性淀粉及硅藻土，再将添加可溶性淀粉及硅藻土的巨大芽孢杆菌CRP-4的离心菌体转入喷雾干燥设备得巨大芽孢杆菌CRP-4菌粉。
4.权利要求1所述的防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂在防治大白菜黑斑病上的应用，其特征在于，在大白菜黑斑病发病前或发病初期，将防治大白菜黑斑病的可湿性粉剂稀释1000倍～2000倍后，喷雾于叶面。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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