CN108795827A - 一种巨大芽孢杆菌bm22及其水分散粒剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22及其水分散粒剂和应用，该菌株已经于2017年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的水分散粒剂通过种子液培养，在载体、润湿剂、分散剂、粘结剂和崩解剂的混合物中培养发酵后干燥得到。本发明提供的巨大芽孢杆菌BM22及其水分散粒剂对杜仲黑斑病有特效，适宜于商品化生产，对环境亲和性好，具有可持续、成本低的特点。

Description

一种巨大芽孢杆菌BM22及其水分散粒剂和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌BM22及其水分散粒剂和应用，尤其涉及的是一种巨大芽孢杆菌BM22菌株及其水分散粒剂和在杜仲黑斑病中的应用。

背景技术

杜仲，我国特产树种和著名药材，为杜仲科植物，又名胶木、丝棉树、恩仲、银丝树、扯丝皮等，是我国特有的珍惜濒危二类保护植物，在国外被称为中国神树。杜仲适应性极强，分布广泛，长江、黄河流域均有栽培，以贵州、陕西、湖南、江西、河南、四川等省居多。它全身都是宝，用途广泛，具有极大的药用价值和经济价值。杜仲叶含有丰富的维生素E和胡萝卜素及人体需要的10余种元素，可作为杜仲茶饮用，是中国名贵保健药材，具有降血压、强筋骨、补肝肾的功效，同时对降脂、降糖、减肥、通便排毒、促进睡眠效果；杜仲的叶、皮、果都可提炼硬橡胶，也称杜仲胶，具有高度绝缘性，能耐酸、碱、油及化学药品的腐蚀，为电器绝缘及海底电缆的优良材料；杜仲种子出油率高达27％，是高级工业用油；杜仲树皮为名贵中药材，具有补肝肾、强筋骨、益腰膝、除酸痛、降血压等功效，为我国重点管理的42种名贵中药材之一，也是中国目前大宗出口药材之一。明显目前国内外市场需求量大，皮、叶价格逐渐上涨。

杜仲黑斑病是一种常见叶部病害，叶片上病斑初为黑色小点，后扩大为多角形，边缘不明显，干燥时病斑中央呈土黄色，后期散生黑色小点即为病原菌分生孢子器。严重时病叶脱落，严重影响杜仲生长。关于杜仲黑斑病防治在国内外尚无报道，保护生态平衡、对环境友好、人畜安全、可持续利用的生物防治亦未涉及，有关杜仲黑斑病生物防治及其制剂研究仍为空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治杜仲黑斑病中的缺陷，提供了巨大芽孢杆菌BM22菌株、水分散粒剂及其制作方法和在杜仲黑斑病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22菌株于2017年6月15日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲叶片，该菌对杜仲黑斑病菌抑菌率达到99％以上，已经于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15070。

本发明巨大芽孢杆菌BM22在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

本发明巨大芽孢杆菌BM22的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明巨大芽孢杆菌BM22的水分散粒剂的制备方法，包括以下步骤：

1)巨大芽孢杆菌发酵液：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下将营养肉质培养液盛于三角瓶中，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌发酵液；

2)将载体、润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂按比例在通氧控制下，装入广角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌发酵液，接种量为总量的15％，混合机捏合，经过旋转式挤压造粒机造粒，在50℃温鼓风干燥箱中持续2-3h烘干，直至样品重量无变化，通过5-10目标准筛筛分，得到巨大芽孢杆菌水分散粒剂。

进一步的，所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

进一步的，所述的润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂按重量百分含量具体为：湿润剂5％，分散剂8％，粘结剂4％，崩解剂6％，载体补足100％。

进一步的，所述的载体为硅藻土，所述的湿润剂为拉开粉，所述的分散剂为木质素磺酸钠，所述的粘结剂为硅酸镁铝，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠。

通过上述制备方法得到的水分散粒剂的性能指标为：湿润时间24s，崩解时间60.28s，悬浮率86.15％，ph 6.65，含水率1.8％，外观白色柱状颗粒，1min后持续起泡性小于25mL。

上述制备方法得到的巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂也在本发明的保护范围之内。

所述的巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂中活芽孢的含量不低于1×10⁹cfu/g。

本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22在防治杜仲黑斑病中的应用，当然本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或次级代谢产物在防治杜仲黑斑病中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的水分散粒剂在防治杜仲黑斑病中的应用，在植物生长过程中使用水分分散剂稀释液进行喷雾处理。

本发明的有益效果为：

本发明提供的巨大芽孢杆菌BM22及其水分散粒剂对杜仲黑斑病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物(农药、化肥)所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

附图说明

图1是本发明巨大芽孢杆菌BM22rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是基于16S rDNA序列构建的菌株BM22的***发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1巨大芽孢杆菌BM22的分离与鉴定

1.1巨大芽孢杆菌BM22的分离

在四川大邑仰天窝药场杜仲黑斑病发生区取健康杜仲叶片。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的叶片剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm杜仲黑斑病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度，保留效果优良的菌株(BM22)。

1.2菌株的鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表1)和分子生物学鉴定该内生菌BM22为巨大芽孢杆菌。

经形态学观察，结合生理生化指标(表1)和分子生物学鉴定该内生菌BM22为巨大芽孢杆菌。

表1菌株BM22生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的BM22菌株的单菌落乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建***发育树，确定BM22菌株在微生物***发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为949bp的DNA片段(图1)，将BM22菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建***发育树(图2)。可以看出，BM22菌株与JX286698以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明BM22与Bacillus megaterium的亲缘关系最近。

基于以上特征，所述菌种其分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22，已于2017年12月15日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

实施例2巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂的制作

根据实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM22，经过发酵、干燥制成水分散粒剂，具体包括以下步骤：

1)发酵液：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度28-30℃，初始pH值6.5，120r/min振荡培养36h，制成巨大芽孢杆菌BM22发酵液。其中营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

2)水分散粒剂：将拉开粉5％，木质素磺酸钠8％，硅酸镁铝4％，羧甲基淀粉钠6％，硅藻土补足100％混合均匀，在通氧控制下，装入300mL广角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌发酵液，接种量为总质量的15％，混合机捏合；经过旋转式挤压造粒机造粒，在50℃温鼓风干燥箱中持续2-3h烘干，直至样品重量无变化，通过5-10目标准筛筛分，制成巨大芽孢杆菌水分散粒剂，然后保存。

水分散粒剂指标：1×10⁹cfu/g活芽孢，湿润时间24s，崩解时间60.28s，悬浮率86.15％，ph 6.65，含水率1.8％，外观白色柱状颗粒，1min后持续起泡性小于25mL。

制剂保存：袋装干燥常温保存1年或低温(4度)2年不影响防治效果。

实施例3巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂对杜仲黑斑病的防效实验

1)BM22水分散粒剂稀释液准备：将上述制得的1g水分散粒剂分别用50、100、200、500、800、1000、1500mL稀释，制成稀释液。

2)杜仲黑斑病菌孢子悬液准备：将PDA斜面培养的杜仲黑斑病菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)分生孢子用水制成孢子浓度为1×10⁶cfu/mL孢子悬液。

3)选取一年生盆栽杜仲苗为实验对象，取1)水分散粒剂稀释液采用喷雾法对种苗进行喷雾，设以下处理：原液1g/mL稀释50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1200倍、1600倍，每隔7天喷施1次(共3次)，30mL/次，并以无菌水为对照。15d后采用喷雾法将病原菌孢子悬液接种到杜仲叶片上，每处理接种10株，并对接种部位进行保湿，每处理重复3次。

4)病原菌接种15d后，按照表2中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果，结果如表3所示。

表2杜仲黑斑病病害分级标准

发病率(％)＝(病株数/株数总和)×100；

病情指数＝[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表值]×100；

防治效果(％)＝[(对照病情指数增长率-处理病情指数增长率)/对照病情指数增长率]×100。

表3盆栽试验15d后的防治效果

接种病原菌15d后，BM22水分散粒剂稀释液对杜仲黑斑病表现出良好的保护效果，防治效果随稀释倍数的增加而降低。从表3可以看出，1gBM22水分散粒剂稀释成50倍液的防治效果最高，达到了100％，说明完全控制病菌的定殖、生长、繁殖，病害不发生。稀释到800倍防效仍超过60％。

实施例4林间防治实验

1)供试药剂

本发明实施例2制备得到的巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂。

2)田间病害治疗

将上述制得的1g水分散粒剂制成原液、50、100、200、400、800、1600倍稀释液。试验区按不同发病程度分为轻度发生区(5％以下)、中度发生区(6-30％)、重度发生区(30％以上)，选择区域内1-2年生生长势均一的杜仲，用制剂沿叶面喷施，以均匀覆盖叶面、水滴不下滴为宜，每株约80mL。

3)试验调查

喷施后15d进行调查统计并计算防治效果，结果如表4。

病害调查、发病率、病情指数、防治效果同上计算。

表4采用喷雾法对杜仲黑斑病的林间防治效果

由表4可知，采用喷雾法防治杜仲黑斑病，轻度发生区各浓度防效均较好，原液高达96％，稀释1600倍都超过60％；中度发生区原液防效超过90％，稀释50-800倍效果较好，可达到72％以上；重度发生区原液、稀释50-200倍防效超过50％。由此可看出，本发明中BM22水分散粒剂喷雾处理防治杜仲黑斑病有优异的效果。尽管原液防效最佳，从生产成本考虑，林间防治中，轻度发生以800-1600倍为经济浓度，中度发生以400-800倍为经济浓度，重度发生以100-200倍为经济浓度。

综上所述，本发明中的巨大芽孢杆菌BM22菌株对杜仲黑斑病表现出了良好的拮抗作用，且该菌株具有抗逆性强的芽孢，商品贮藏寿命长，对环境适宜性强的特点，生产成商品生物制剂，对环境亲和性好，符合可持续发展的战略要求，具有广阔的市场前景。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种巨大芽孢杆菌BM22及其水分散粒剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 1

caggctgcgg ggctatacat gcagtcgagc gaactgatta gaagcttgct tctatgacgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacttcgg 120

gaaaccgaag ctaataccgg ataggatctt ctccttcatg ggagatgatt gaaagatggt 180

ttcggctatc acttacagat gggcccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac gagagtaact gctcgtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaaga 949

Claims (10)

1.一种巨大芽孢杆菌BM22，其特征在于，该菌株已于2017年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

2.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌BM22，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌BM22的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)巨大芽孢杆菌发酵液：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下将营养肉质培养液盛于三角瓶中，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22发酵液；

2)水分散粒剂：将载体、润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂按比例在通氧控制下，装入广角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22发酵液，接种量为总量的15％，混合机捏合，经过旋转式挤压造粒机造粒，在50℃温鼓风干燥箱中持续2-3h烘干，直至样品重量无变化，通过5-10目标准筛筛分，得到巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的营养肉质培养液为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的润湿剂、分散剂、粘结剂、崩解剂按重量百分含量具体为：湿润剂5％，分散剂8％，粘结剂4％，崩解剂6％，载体补足100％。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的载体为硅藻土，所述的湿润剂为拉开粉，所述的分散剂为木质素磺酸钠，所述的粘结剂为硅酸镁铝，所述的崩解剂为羧甲基淀粉钠。

7.权利要求3所述的制备方法制备得到的巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂。

8.根据权利要求7所述的水分散粒剂，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌BM22水分散粒剂中活芽孢的含量不低于1×10⁹cfu/g。

9.巨大芽孢杆菌BM22或其菌悬液或次级代谢产物在防治杜仲黑斑病中的应用。

10.权利要求7所述的水分散粒剂在防治杜仲黑斑病中的应用，其特征在于，在植物生长过程中使用水分分散剂稀释液进行喷雾处理。