CN114901839A - 以通过细胞凋亡的经细分化的核小体作为目标的自体荧光的液体活检法 - Google Patents

以通过细胞凋亡的经细分化的核小体作为目标的自体荧光的液体活检法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的提供一种通过液体活检法迅速且容易地进行疾病检测的方法，该方法将通过细胞凋亡而释放到血液中的片段化DNA(细分化核小体)作为疾病关连物质，并利用从血液等体液采集的甲基化片段化DNA(细分化核小体)的自体荧光。本发明是一种利用片段化DNA(细分化核小体)的自体荧光进行的液体活检法，该方法包括下列步骤：a)使具有试料中等离子体子(plasmon)金属介晶区域的测定基板与检体接触，将检体中的片段化DNA(细分化核小体)作为疾病关连物质并于等离子体子金属介晶捕捉电荷的步骤，其中，前述检体是将含有体液或细胞的培养液原状或稀释作成；b)对该等离子体子金属介晶上捕捉到的片段化DNA(细分化核小体)照射激发光，通过表面等离子体子增强效果而增强其自体荧光，决定片段化DNA(细分化核小体)的荧光菌落的荧光影像的固定测定区域(ROI)，通过比激发光滤器长波长域的滤器取得荧光菌落影像的步骤；c)采用该荧光菌落影像中显示规定阈值以上亮度的像素的步骤；d)演算于采用的测定区域的既定波长域中既定阈值以上的像素的总面积值、或采用的测定区域不同的二波长区域既定阈值以上的像素的总面积值的比(ratio)的步骤。

Description

以通过细胞凋亡的经细分化的核小体作为目标的自体荧光的 液体活检法
技术领域
本发明有关一种液体活检法，其将通过细胞凋亡而释放于血中的经细分化的核小体作为目标，通过表面等离子体增强激发检测其自身荧光，并将表观遗传(epigenetics)信息作为以癌症为中心的疾病信息基础。
背景技术
在凋亡细胞中，CAD(凋亡蛋白酶活化DNase)的抑制因子被分解，活化的CAD以核小体为单位切断DNA，因此可以说片段化为约200bp的倍数的DNA(非专利文献5)。该片段化DNA(细分化核小体)包含基因组DNA担负的遗传信息和表观遗传学的信息这两者。也就是，基因组DNA担负的遗传信息在碱基序列中，但即使碱基序列相同，有时也显示不同的信息。也就是，我们的细胞内的DNA以卷绕在组蛋白上的形式存在，如果组蛋白受到乙酰化等化学修饰，则DNA可能发生变化。另外，DNA自身也受到甲基化等修饰，由此作用发生变化。将显示这样的变化的遗传信息称为表观遗传，尽管构成一个个体的各种细胞具有从受精卵接受的相同的基因组DNA，但发挥不同的功能是因为细胞的表观遗传不同。表观遗传的信息为通过分子的附加或消去改变DNA的结构，担任基因体DNA中基因表现开、关的可说是切换的角色。也就是，为了将构成个体的各种细胞正确地作用，各细胞具有的表观遗传为重要(东北大学教授：有马隆博著“从人类了解的表观遗传及进化”)。由此可知，自然发生的癌细胞的大部分存在DNA甲基化和染色质的异常，在癌细胞中，基因组整体的DNA甲基化的降低使染色体不稳定性增大，并且通过启动子区域的高甲基化抑制癌抑制基因的表达。基因组整体的低甲基化和癌抑制基因的高甲基化看起来是相反的现象，但暗示了在转座子等富含重复序列的基因组区域和基因的启动子区域中，DNA的甲基化的控制机制不同。另外，核结构异常(核异型)已知作为癌细胞共通的特征，但推测反映了由基因组整体的低甲基化引起的染色质的变化。这样，可理解于癌化的表观遗传控制异常为癌细胞共同特性之一。着眼于与经高甲基化的基因的不活性化相关的MBD1和zinc finger蛋白质)、在癌细胞中高表达而使基因控制变化的MCAF1、与癌细胞的恶性性状相关的结构性染色质因子HMCA1和HMGA2等，对于癌症的表观遗传异常进行分析(熊本大学发生医学研究所教授：中尾光善著)，重要的是分析各细胞具有的表观遗传。
然而，癌的确定诊断一般通过所谓的活检法(Biopsy)进行，也就是，通过穿刺或内窥镜处理等采集癌组织的一部分，进行该组织片的病理组织检查。许多活检法(Biopsy)是伴随出血和细菌感染的合并等风险的侵入性处理，并且根据主要部位，活检可能是困难的。为了克服该课题，使用血液、尿等能够容易地采集的检体以与病理诊断匹敌的精度进行疾病诊断的尝试被称为液体活检法(Liquid Biopsy)，从其迅速性和简易性出发，作为适于临床应用的尝试非常受到关注。在癌症疾病的情况下，除了血中循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells:CTC)、末梢血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA:ctDNA)以外，还可以举出外泌体、末梢血循环微小RNA(microRNA:miRNA)等多种目标。
在此，血中循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织经上皮间充质转化(EMT)游离到血中并在血流中循环的细胞，从原发肿瘤部位游离后，CTC在血液内循环，侵袭其他脏器而形成转移性肿瘤(转移灶)。由于该CTC存在于癌患者的末梢血中，因此认为通过检测该CTC，能够判断转移的过程，有助于治疗的预后预测而受到期待。然而，与其他血液细胞相比，仅存在极微量的CTC，存在检测非常困难的难点。另一方面，特别期待末梢血循环微小RNA(miRNA)、包含其的外泌体在早期诊断中的有用性。这是因为，微小RNA在细胞内与转译为蛋白质之前的信使RNA(mRNA)互补地结合，作为抑制该mRNA的转译的所谓的基因表达的精细调谐器，在各种生命现象中承担重要的作用，已知在癌细胞中产生微小RNA的表达控制机制的破坏，例如高度表达促进细胞增殖的微小RNA等。另外，几乎所有细胞分泌细胞外囊泡(外泌体)，近年来通过从体液中检测出早期癌细胞所分泌的外泌体也可诊断出早期癌。因此，即使以外泌体为分析对象，也期待特异性地检测出源自疾病细胞的外泌体，因此超离心分离的回收需要时间，高通量性存在困难。又，包含上述通过血中循环肿瘤细胞(CTCs,Circulating Tumor Cells)进行的诊断技术，该种液体活检法需要从癌患者检体(末梢血4mL)使红细胞溶血后，使用CD45抗体珠除去血液细胞，对细胞角蛋白阳性且CD45阴性的细胞级分进行分选，为临床应用提供可于短时间内进行分析的液体活检法是有限的(非专利文献1、2及3)。
因此，本发明人等为了简单地解析各细胞具有的表观遗传信息进行深入研究的结果，发现于凋亡细胞，由于CAD(凋亡蛋白酶活化DNase)的阻碍因子被分解，经活化的CAD将DNA以核小体单位切断，因此片段化成约200bp倍数的DNA。此细胞凋亡后的片段化DNA(细分化核小体)包含基因体DNA所负责的遗传信息及表观遗传信息双方，而且组织蛋白受到乙酰化等化学修饰时，DNA的存在方式产生变化，另一方面，DNA本身也受到甲基化等修饰，经由此作用方式也产生变化。本发明人发现，所述的片段化DNA(细分化核小体)在片段化后也以卷绕于组蛋白的形态(细分化的核小体)存在，被甲基化，具有正电荷，于血中，被选择性吸附捕集于显示负电荷的等离子体子金属介晶的表面，并且，通过表面等离子体子增强效果而增强时，发现可将具有可通过荧光显微镜确认的既定以上亮度的自体荧光发光并可观测(图1)。也就是，含有p53的癌抑制基因通过表观遗传甲基化，尽管检测经甲基化的核小体作为癌疾病信息为不可或缺，但，难以选择性地捕集甲基化核小体。而且从细胞凋亡后的血中捕捉到的片段化DNA，也就是经细分化的核小体于生物芯片(chip)上有些凝集，其发出的自体荧光菌落以如夜空星座般作为多菌落被观测，小的被观测到约25μm的扩展，大的被观测到约150μm的扩展。
以前，细胞观察中自体荧光成为背景光，导致荧光影像的信号杂音比(S/N比)降低。因此，于内视镜检査推荐将目标进行荧光标识的方法，为了从荧光影像取得最优选值，必要的是尽可能加大信号(期待为被荧光标识)与背景(不期待被荧光标识的自体荧光等)的差(非专利文献6)。因此，于使用自体荧光的荧光显微镜的细胞观测中，通常不是通过自体荧光的荧光强度，而是通过将属于荧光另一参数的荧光寿命影像化而进行细胞观察(非专利文献7)。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]WO2015/170711号公报
[专利文献2]日本特开2011-158369号公报
[专利文献3]WO2013/039180号公报。
[非专利文献]
[非专利文献1]末梢血液循环肿瘤细胞Circulating Tumor Cells(CTCs)的检测：Circulating tumor cell isolation and diagnostics:toward routine clinicaluse.Cancer Res 2011；71:5955-60
[非专利文献2]Gorges TM,Pantel K:.Circulating tumor cells as therapy-related biomarkers in cancer patients.Cancer Immunol Immunother 2013；62:931-9.
[非专利文献3]Permuth-Wey J et al.,A Genome-Wide Investigation ofMicroRNA Expression Identifies Biologically-Meaningful MicroRNAs ThatDistinguish between High-Risk and Low-Risk Intraductal Papillary MucinousNeoplasms of the Pancreas.,PLoS One.,2015；10:e0116869.
[非专利文献4]Ellen Heitzer,Peter Ulz and Jochen B.Geigl,CirculatingTumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer.,Clinical Chemistry 2015；61:112-123
[非专利文献5]Cell，2016January14；164:Cell-free DNA comprises an invivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin
[非专利文献6]自体荧光内视镜的现况Vol.58(4)Apr,2016
[非专利文献7]生物物理53(3)，166-169(2013)
发明内容
[发明欲解决的课题]
本发明人等经过深入研究的结果，着眼于将通过疾病的发生，于血液其它体液中通过以细胞凋亡为代表的病理性细胞坏死而释放出的片段化DNA(细分化核小体)作为检査的对象时，与疾病有密切的关连性(例如癌症发生是通过癌基因及癌抑制基因的异常而发生的基因疾病为被广泛接受的事实，然而也逐渐明了癌症也利用以甲基化为代表的对碱基修饰所进行的表观遗传基因异常而发生癌症，不仅癌抑制基因的质的异常，通过高甲基化所致的量的异常于致癌机构也为重要，作为于癌细胞接受高甲基化的癌抑制基因的活性不活化，经高甲基化的RB基因、于p16以外，p14及p53的不活化作为致癌机构受到注目：曾和义弘、酒井敏行著癌症及表观遗传)，因此重要的是选择性地捕捉含有其高甲基化癌抑制基因的片段化DNA(细分化核小体)，检测其量的异常作为癌症检诊。而且，这些于荧光影像中以图1表示的如夜空星座般被观测道多菌落，因此通过等离子体子金属介晶的表面等离子体子增强效果而增强时，将具有可于荧光显微镜确认的既定以上亮度的自体荧光进行发光(图1)，采用显示既定以上亮度的画素、像素进行分析时，发现可获得对疾病具有正确诊断率高的结果，进而完成本发明。也就是，本发明欲解决的课题为提供一种检测方法，其将通过细胞凋亡而释放于血中的片段化DNA(细分化核小体)作为目标，通过使用组织检体的组织蛋白修饰分析、染色质结构分析，将各种疾病，尤其是与癌的发症关连的肿瘤检测或诊断作为疾病关连物质，并通过利用片段化DNA(细分化核小体)的自体荧光所进行的液体活检法而迅速且容易地进行。
[用以解决课题的手段]
本发明是利用自体荧光进行的液体活检法，包含下列步骤：a)使具有试料中等离子体子金属介晶区域的测定基板与检体接触，将检体中的片段化DNA(细分化核小体)作为疾病关连物质，捕捉电荷于等离子体子金属介晶的步骤，其中，该检体含有体液或细胞的培养液以原状或经稀释作成；b)对此等离子体子金属介晶上捕捉到的片段化DNA(细分化核小体)照射激发光，通过表面等离子体子增强效果而增强其自体荧光，决定片段化DNA(细分化核小体)的荧光菌落的荧光影像的固定测定区域(ROI)，通过比激发光滤器长波长域的滤器取得荧光菌落影像的步骤，其中，该激发光是由激光光源所致的单波长的激发光或将源自LED光源等的激发光通过滤器取得的固定波长宽的激发光；c)采用该荧光菌落影像显示既定阈值以上亮度的像素的步骤；及d)演算所采用的测定区域的既定波长域中既定阈值以上的像素的总面积值、或所采用的测定区域不同的二波长区域中既定阈值以上的像素的总面积值的比(ratio)的步骤。
于本发明，激发光是使用通过激光光源所致的单波长的激发光或将源自LED光源等的激发光通过滤器所取得的固定波长宽的激发光。从观测的荧光菌落采用既定亮度的区域时采用ROI。然后，为了提升测定精确度，采用荧光菌落中既定阈值以上亮度的像素。另外，于本发明，演算步骤中，采用经二值化所采用的既定以上亮度的荧光菌落的像素，并演算其总面积。或是，演算不同二波长域的总面积的比率(比(ratio)值)。由于具有既定以上亮度的像素响应表观遗传信息，寻求不同二波长域的比率是由于此片段化DNA(细分化核小体)包含基因体DNA负责的遗传信息及表观遗传信息双方，因而尽可能只采用表观遗传信息。因此，采用发光阈值以上的荧光的荧光菌落的像素，从其总面积值或不同二波长区域的比率(比值)至少分为有癌症风险、无癌症风险2阶段，或分为有癌症风险、需观察、癌症风险低3阶段，使风险判定成为可能。另一方面，采用的RGB的波长域较优选为G或B区域，较优选为演算G/B或B/G的比率。观测荧光菌落的分光光谱时，于B或G区域观测到疾病，尤其是癌症特有的峰。
另外，于本发明，作为检测对象被捕捉的目标，是DNA被经活化的CAD(凋亡蛋白酶活化DNase)以核小体单位切断的约200bp倍数的片段化DNA(细分化核小体)，并且包含基因体DNA所负责的遗传信息及表观遗传信息双方，因此为了容易进行只取出表观遗传的信息，较优选为进行比率判定。此方法为将捕捉到的片段化DNA(细分化核小体)以B或G区域相同或不同的二波长域的激发波长激发而获得荧光菌落，将该荧光菌落通过不同的二波长域的滤器采集，由此采集到的像素的各总面积值比为B区域/G区域或G区域/B区域的液体活检法。
属于检体的体液是从淋巴液或血液分离出的血浆或血清，由于片段化DNA(细分化核小体)与组织蛋白蛋白结合显示正电荷，因此可选择性捕捉。另外，检体为iPS细胞时，将进行iPS细胞癌化的识别作为对象。
[发明的效果]
根据本发明，第1可诊断疾病，尤其是识别癌症患者、良性肿瘤患者、健康人，其通过选择性地捕捉属于疾病关连物质的DNA经活化的CAD(凋亡蛋白酶活性化DNase)以核小体单位切断的约200bp倍数的片段化DNA(细分化核小体)，将通常于荧光诊断中成为杂讯的自体荧光通过表面等离子体子增强效果而显现成既定阈值以上的亮度的荧光菌落并采用，并演算既定阈值以上的荧光菌落的总面积值或RGB及与此相关的二波长比的比值。
通常，生体蛋白质具有自体荧光，但该自体荧光在目标的荧光观察中形成信号(希望被荧光标记的物质)的背景(不希望被荧光标记的自体荧光等)，成为杂讯。但是，该生体蛋白质的自身荧光反映生体蛋白质本身的结构，因此基于自身荧光的结构解析在以下方面特别有效。也就是，近年来，根据迄今为止进行的解析结果，在癌细胞的发生/进展过程中，不仅基因组变化而且也积累多个表基因组变化，表基因组修饰大致分为化学控制和物理控制。化学控制的代表是被称为“组蛋白代码”的各种组蛋白尾的修饰。已经报道了对组蛋白尾数十个氨基酸的修饰，但识别这些修饰单独或组合的染色质结合蛋白(reader)负责转录控制。另一方面，作为物理控制，重要的是由一级(核小体)和高级构成的染色质结构。染色质结构在正常的细胞分化/发生的过程中动态地变化(染色质重塑)，此时，不仅必须进行空间控制，而且控制异常也与发生异常、癌化等疾病相关，因此，在组蛋白修饰中，在正活化基因表达的区域(增强子区域)中观察到的H3赖氨酸27的乙酰化(H3K27ac)和甲基化受到关注。基因表达状态与存在转录起始点的启动子区域的染色质状态良好相关，但在细胞系谱所特有的基因表达调节中，增强子的染色质状态也深入相关。另外，最近以H3K27ac为指标的增强子区域在基因的立体结构形态(基因组拓扑)中也显示重要。因此，使用临床组织样本观察自体荧光，组蛋白修饰分析和染色质结构分析表明癌症的早期诊断和癌症部位的特定可能性。即，结合有细胞游离DNA的蛋白质结合体在DNA卷绕于组蛋白而形成核小体、组蛋白被甲基化时，使核小体内的DNA稳定化。进而，DNA的甲基化异常被认为是癌抑制基因失活而成为癌发病的原因。因此，通过细胞凋亡(包括循环肿瘤DNA(ctDNA))从细胞释放到血液中的细胞游离DNA(cfDNA)的收集和分析是极其预期的液化生物学靶标。但是，包含血液中的ctDNA在内，捕集游离DNA(cfDNA)是极其困难的，由于是微量的，因此PCR成为检测的基础，大致分为突变特异性PCR和数字PCR进行检查(非专利文献5)。在本发明中，鉴于DNA通常显示负电荷，与显示正电荷的组蛋白强力结合，具有被显示负电荷的等离子体激元纳米金属结晶捕捉的性质，尝试将其用芯片捕捉，通过拉曼光谱分光法进行检测。但是，由于与芯片上捕捉的DNA结合的组蛋白结合体被细胞凋亡细微地分断而捕捉，因此极小，用激发光适当地激发该捕捉物质，极难检测被增强而反射的拉曼光，难以简易迅速地通过液体生物学法获知结果。然而，可知通过表面等离子体子增强效果使包含游离DNA(cfDNA)的疾病关连物质、片段化DNA(细分化核小体)的自身荧光显现化，以具有既定以上的阈值的亮度的荧光集落为基准时，通过以总面积值、或RGB及/或与此相关的二波长比运算比值(ratio)，能够进行疾病的诊断，特别是癌症患者、良性肿瘤患者、健康人的识别。
第2，根据本发明，如下述般进行疾病关连物质的选择性捕捉。
应目标的片段化DNA(细分化核小体)包含ctDNA的细胞游离DNA(cfDNA)与组织蛋白(histone protein)结合，作为最小单位的核小体或比此高水平的染色质存在于血中。而且，缠绕于组织蛋白的DNA与组织蛋白结合，通过甲基化而稳定地存在(通过前述癌及表观遗传，从癌细胞高甲基化成各种癌症抑制基因：包含高甲基化的RB基因、p16以外的p14及p53)。因此，通过提供显示正电荷的芯片(chip)，可将这些选择性地吸附或捕捉。捕捉于所述芯片(chip)上的物质通过特定的激发光将自体荧光以表面等离子体子效果显现，并发现将这些以荧光显微镜分析时，通过其荧光波长可识别健康人、癌症患者、其它疾病患者。也就是，细胞游离DNA也经由细胞凋亡从健康人的细胞释放到血中，但肿瘤细胞游离DNA从癌细胞释放，它们通过其自身的甲基化和组蛋白的甲基化而牢固地结合，从其他疾病细胞释放疾病特有的片段化DNA(细分化核小体)。从这些健康人、癌症患者、其它疾病患者的细胞释放出的DNA不仅发生遗传性(genetic)基因异常，也发生通过于碱基的修饰所致的表观遗传性(epigenetic)基因异常，从各细胞释放出的片段化DNA(细分化核小体)观察到化学性或物理性的不同。从此结果发现从健康人、癌症患者、其它疾病患者的细胞释放出的片段化DNA(细分化核小体)，观察到自体荧光的波长存在不同。另外，将从癌症患者采集的癌症关连物质的荧光波长更详细地分类时，表观基因组修饰大致分为其化学性控制及物理性控制，由于受到影响，根据癌原发部位、转移部位，荧光波长光谱或光谱峰变不同(若根据分光光谱，于癌症患者的片段化DNA(细分化核小体)在515nm附近观测到些微峰)。因此，演算所采用的既定阈值以上的荧光菌落的总面积值或于二波长域所采用的既定阈值以上的荧光菌落的总面积值比的比值，对包含癌症的各种疾病的评估非常有效。
第3，通过细胞的细胞凋亡等病理性分解而释放到体液，特别是血浆或血清中的DNA与组蛋白等结合而形成蛋白结合体，根据本发明，通过等离子体子增强使蛋白结合体的自体荧光显现出来，用荧光显微镜进行观察，能够有助于疾病的早期诊断。其原因在于，蛋白质的转译后修饰异常与各种疾病的表现有关，但能够对癌症、生活习惯病、感染症等各种疾病患者检体简易迅速地进行蛋白质组分析。本液体活检法阐明与疾病相关的转译后修饰异常，不仅成为临床现场即时执行、确定治疗方针、实现个性化医疗的诊断生物标志物，而且在确定开发新治疗药物的药物开发方针时也给出了极其重要的指导。一般在肽的分析中，样品的前处理技术、修饰基团特异性的浓缩技术的改良等还存在很多课题，但通过活用本方法，有助于阐明转译后修饰异常与疾病的关系。
根据本发明，具体而言，这些片段化DNA(细分化核小体)通过疾病的发生，经由以细胞凋亡为代表的病理性细胞坏死而被释放到血液其它体液中，因而与疾病的关系深切。尤其是，细胞凋亡后的核小体自体的自体荧光的特征，于恶性肿瘤中，蓝色(B)区域的自体荧光强，于良性肿瘤中，绿色(G)区域的自体荧光强(图9)，因此将蓝色(B)区域与绿色(G)区域亮度高的面积值以比(ratio)值(B/G或G/B)观察时，可成功地识别健康人、良性肿瘤、恶性肿瘤，使癌症的极早期诊断、复发判定、转移判定、治疗效果的监控成为可能(图10)。细胞凋亡后经细分化的核小体由于可检测通过基因异常发生的甲基化核小体，如图11所示的多阶段发癌假设模型所示，本发明的检査水平(蛋白(Proteo)检査水平)依据现在的影像诊断水平(PET-CT,CT,MRI)以前的癌症关连物质的检测为基础，可极早期发现癌症。
附图说明
图1为表示使用奥林巴斯(Olympus)公司制造的DM(双色镜(dichroic mirror))405-445/514获得的荧光影像，并显示各试样每个亮度的高点采用10点的方法。
图2为表示使用奥林巴斯公司制造的DM405-445/514取得的470-490nm及600-620nm的影像。
图3为表示使用BS10/90取得的分光光谱。
图4为于硅胶干燥容器显示(a)为将血液离心分离获得的结晶的滴下状态、(b)为利用硅胶使血浆干燥于容器内的状态。
图5A为本发明第1法的第1步骤A：作成测定芯片(chip)(蛋白芯片(chip)(Proteochip))的说明图，
图5B为第2步骤B：决定蛋白芯片(chip)分析范围的说明图，
图5C为第3步骤C：蛋白芯片(chip)的(采用的荧光菌落)面积数值化的说明图。
图6为显示本发明第2法的影像取得步骤(1)→解析范围决定步骤(2)→荧光菌落采用步骤(3)→RGB荧光影像中采用菌落的合计面积值的算出步骤(4)→从获得的RGB合计面积作成B/G、G/R等比(Ratio)值的步骤(5)的说明图。
图7为于自动化进行本发明方法时所采用的显微镜载物台的说明图。
图8为显示本发明Ratio演算方法的概念图。
图9为将存在于经离心分离的上清液(血浆部分)的片段化核小体使用本发明的蛋白芯片(chip)，测定其自体荧光时的分析方法的说明图。
图10为显示可以图9的方法识别的健康人、良性肿瘤、恶性肿瘤的比(Ratio)值分布的图，y轴高表示B区域/G区域的比率、x轴表示检体数。
图11为比较检测本发明的片段化核小体时的检査水平及使用现状的影像诊断(PET-CT,CT,MRI)时的检査水平的多阶段发癌假设模型的比较解说图。
具体实施方式
于实施本发明所述的液体活检法，于第1法较优选采用下列步骤。于第1法，将片段化DNA(细分化核小体)激发，计测其荧光菌落既定阈值以上的像素的总面积，该片段化DNA(细分化核小体)通过来自激光的单波长激发光或利用滤器采用的固定波长宽的激发光所捕捉。
使用机器：奇恩斯(Keyence)公司，荧光显微镜BZ-X710
光源：金属卤素灯80W
荧光滤器：BZ-X滤器DAPI(460±25nm)
分析软件：BZ-X Analyzer
a)癌症关连物质的选择性捕捉步骤：图5A
使具有显示试料中表面负电荷的等离子体子金属介晶区域的测定基板：蛋白芯片(chip)(图5A(1))，与含有体液或细胞的培养液以原状或经稀释作成的检体接触(图5A(2))，将检体中显示正电荷的蛋白质结合体作为疾病关连物质，使其电荷捕捉于等离子体子金属介晶(图5A(3))的步骤。
b)荧光影像取得步骤：
(1)将癌症关连物质所附着的蛋白芯片(chip)安装于荧光显微镜，一边观察明视野影像一边决定芯片(chip)的测定位置(X、Y轴)，按下自动对焦钮将芯片(chip)对焦(Z轴、焦点)。将测定设定切换为BZ-X滤器DAPI，开始荧光影像的测定。
对捕捉于此等离子体子金属介晶(直径约8mm)上的蛋白质结合体照射激发光，通过表面等离子体子增强效果而增强捕捉蛋白质结合体的自体荧光，取得荧光菌落作为荧光影像(图5B)的步骤。
c)荧光菌落的采用步骤：将解析范围(直径5mm)内的荧光菌落的亮度二值化，采用既定阈值以上的亮度的荧光菌落的步骤。
d)演算步骤：
算出所采用的既定阈值以上的荧光菌落的总面积值(图5C)。此处，采用荧光强的物质(蓝色附着物，于以下的测定条件，以亮度值为基础作成二值化阈值13以上)，计算其面积值(单位μm2)。
从面积值分类成3阶段进行判定：0至19999分类为癌症风险低的情况A、20000至29999分类为需观察B、30000以上分类为有癌症风险。
图6为本发明的第2法，采用来自荧光影像的阈值以上的荧光菌落，演算RGB和/或与此相关的二波长比的比(ratio)值的方法。于图6(1)中每1检体取得RGB的3张荧光影像。接着决定解析范围，以ROI包围(图6(2))。此处，使用“荧光菌落的圆形度及亮度”作为阈值，决定解析条件，并排除垃圾等(图6(3))。之后，算出从RGB的荧光影像采用的荧光菌落得合计面积值(图6(4))。详细如下所述。
一般的荧光测定通常为涂抹荧光色素，并以该色素特有的荧光波长进行观察。激发波长或荧光波长根据色素的种类设定所决定的波长进行测定。使用色素的荧光测定为观看色素的荧光，不是观看物质本体的自体荧光的测定法。
另一方面，自体荧光认为是以物质本身的化学组成或化学结构、官能团、修饰化合物、生物学结构等发出。也就是，认为自体荧光具有各个物质固有的荧光波长。于本发明，观看癌症关连物质固有的自体荧光。不是以一般色素的波长而是从多数的激发光测定癌症关连物质固有的自体荧光波长的方法。特定出用以直接测定癌症关连物质固有的自体荧光的最适合的激发光及荧光波长。将癌症关连物质的自体荧光分光，从分析其荧光波长分析的结果决定发出强自体荧光的RGB的激发光及测定RGB自体荧光的波长。光源使用LED光源，于奥林巴斯(Olympus)正立显微镜BX-63安装荧光波长滤器并限定进行测定的荧光波长，取得荧光影像。
具体而言，
B的激发光为于375至400nm荧光波长为460±25nm的范围
G的激发光为于470至495nm荧光波长为510nm以上的长波长的范围
R的激发光为于530至550nm荧光波长为575nm以上的长波长的范围。
B为癌症关连物质的自体荧光所强力发出的激发光及荧光波长，G为良性疾病的自体荧光所强力发出的激发光及荧光波长。将附着癌症关连物质的生物芯片(chip)安装于奥林巴斯正立显微镜BX-63，将LED光源及荧光波长滤器进行上述B的设定。一边观看生物芯片(chip)的即时荧光影像一边将焦距(Z轴)对焦。一旦决定焦距(Z轴)及测定位置(X、Y轴)，即可测定B的设定的荧光影像。接着，将LED光源及荧光波长滤器进行上述G的设定，将焦距(Z轴)聚焦，并与先前B设定相同的测定位置(X,Y轴)合并，测定荧光影像。通过将测定位置(X、Y轴)合并，可取得芯片(chip)相同位置的相同癌症关连物质的各个荧光影像。同样地操作R设定的LED光源及荧光波长滤器，测定相同测定位置(X、Y轴)的荧光影像。
解析法
使用成像软件“cellSens”(日本奥林巴斯光学社制)进行分析。
将相同癌症关连物质以ROI包围，决定解析范围，该相同癌症关连物质附着于以各个激发光测定的3种荧光影像的生物芯片(chip)的相同位置，算出下述RGB设定范围的物质的面积值。B设定成选择亮度值28000至50000范围的附着物并除去圆形度0.3以下的附着物设定。
G设定成选择亮度值27000至50000范围的附着物并除去圆形度0.3以下的附着物。
R设定成选择亮度值21000至50000范围的附着物并除去圆形度0.3以下的附着物。
此亮度值设定范围通过附着物质自体荧光的荧光强度或LED光源的光强度设定范围。另外，通过以圆形度0.3进行解析，解析软件设定成自动除去扭曲形状的异物，提升解析精度。亮度值的范围为10000至70000的范围，较优选为约20000至50000的范围，圆形度的范围为0.9至0的范围，较优选为约0.3。因应荧光菌落的状况调整此圆形度。从通过此测定及解析设定所算出的RGB的面积值，计算出B/G、G/R等二波长比的比(ratio)值，关于大肠，于B/G的比值，于恶性肿瘤具有1.9至1.0的宽，于良性肿瘤为0.1左右，健康人为0.2至0.8。
如此般将激发光分开，并进行荧光测定，据此可获得于各激发光中更强的自体荧光的荧光影像。通过此手法将生物芯片(chip)上相同位置的相同癌症关连物质以不同设定的激发光、荧光波长进行测定及解析，可引出更多物质固有的自体荧光，可提升数值的精确度。
图7为表示将4张蛋白芯片(chip)(测定基板)安装于支架上，进行自动化测定时的显微镜载物台的成像图。事前登录芯片(chip)(1)至(4)的测定位置(X轴、Y轴)，芯片(chip)(1)至(4)的焦距(z轴)分别以主导合并。若决定X、Y及Z轴，则自动进行4张芯片(chip)的3种RGB的测定，可获得4张RGB荧光影像。
属于检体的体液不仅是从淋巴液或血液分离出的血浆或血清，也包含尿、唾液等，蛋白质结合体包含与组织蛋白蛋白结合并显示正电荷的细胞游离DNA(cfDNA)，该细胞游离DNA包含从细胞游离的循环肿瘤DNA(ctDNA)。激发捕捉疾病关连物质的等离子体子金属介晶的光源较优选为使用为了激发肿瘤亲和性荧光物质所使用的405nm波长的激发光。于此情况，可在630nm前后观测到荧光波长，因此本发明中较优选是着眼于630nm前后的峰波长作为癌症关连物质的蛋白质结合体自体荧光的特征。于本发明捕捉到的蛋白质结合体包含循环肿瘤DNA(ctDNA)，其为与组织蛋白结合的核小体或这些高水平化的染色质，组织蛋白接受甲基化修饰时，具有成为利用自体荧光进行的液体活检法的癌症诊断目标的特征。
“具有显示试料中表面负电荷的等离子体子金属介晶的芯片(chip)”
将本发明方法使用的具有等离子体子金属介晶区域的基板称为蛋白芯片(chip)。其制造方法如下所述(参照专利文献1)。
1)将金属络合物水溶液于电极电位低于形成络合物的金属(离子化倾向大)的金属基板上通过电极电位差进行化学还原，使量子结晶(纳米尺寸的金属络合物结晶)凝集。银络合物的情形，通过将硫代硫酸银水溶液在电极电位低于比银(离子化倾向大)的铜或铜合金上进行凝集，采用化学还原法形成银络合物的量子结晶。详言之，金属络合物的水溶液中的浓度应考量主要形成的量子结晶的尺寸而决定，使用分散剂时较优选是也考量其浓度，通常，可使用100ppm至5000ppm的范围，但也依赖配位基的功能，调制所谓纳米团簇(Nanocluster)的纳米尺寸中，较优选为500至2000ppm的浓度。
2)形成量子结晶的金属络合物以具有络合物稳定常数(logβ)以上的方式进行选择，该络合物稳定常数(logβ)以与负载金属的电极电位E相关的式(I)表示。
式(I)：E゜＝(RT/|Z|F)ln(βi)
(此处，E゜表示标准电极电位，R表示气体常数，T表示绝对温度，Z表示离子价，F表示法拉第常数(Faraday constant))
此处，金属络合物为选自Au、Ag、Pt或Pd的等离子体子金属的络合物时，对于激发光具有局部表面等离子体子共鸣增强效果。尤其是金属络合物为银络合物时，较优选是通过稳定常数(生成常数)(logβi)为8以上的银错化剂与卤化银的反应形成，卤化银较优选为氯化银，错合剂较优选为选自硫代硫酸盐、硫氰酸盐、亚硫酸盐、硫脲、碘化钾、硫代水杨酸盐、硫氰尿酸盐中的1种。银络合物具有由平均直径为5至20nm的纳米团簇构成的量子点(Quantum dot)，量子结晶的尺寸成为100至200nm。
3)所谓于本发明使用的蛋白芯片(chip)中的等离子体子金属介晶，为等离子体子金属络合物的量子结晶的氧化物，为利用将于血中带正电的甲基化核小体以电荷补足必需的负带电，通过激发光的照射发挥表面等离子体子增强效果，具有增强经补足的甲基化核小体的自体荧光的效果。银络合物量子结晶的情形，进行碱处理(以次氯酸钠水溶液处理)时，认为通过下述反应而包含以银卤化物作为核的过氧化银，并形成银氧化物复合物的针状纳米结晶群(专利文献1的图5)，而且为于水中带有(-)荷电的一方，由于DNA缠绕的组织蛋白带有(+)荷电(专利文献1的图7(a))，因而发现其选择性吸附以此游离核小体为代表的带有正电荷的癌症关连物质。而且发现含有过氧化银的银氧化物的针状纳米结晶群通过以激光光为代表的激发光的照射而显示表面等离子体子增强效果，检测出以所吸附的组织蛋白为代表的癌症关连物质的自体荧光而较优选。
Na2S2O3+4NaClO+H2O→Na2SO4+H2SO4(2NaHSO4)+4NaCl
Ag++NaCl→AgCl+Na+
Ag++3NaOCl→2AgCl+NaClO3+2Na+
Ag++OH-→AgOH
2Ag++2OH-→Ag2O+H2O
4)本发明的银氧化物的复合针状纳米结晶群含有过氧化银的银氧化物自己组织化而形成神经元状的三维超结构体(介晶)(专利文献1的图8及9)，因此可通过将银离子水溶液使用Ag/AgCl电极进行定电位电析，或是将银的量子结晶以碱处理进行氧化而形成，但，可通过将银络合物量子结晶，例如硫代硫酸银量子结晶进行碱处理(以次氯酸钠水溶液处理)而容易地形成。
5)为了尽可能地吸附疾病关连物质，可使用于实现荧光标识标记的高度检测、敏感度及迅速性且具有节距(pitch)350nm的周期结构的基板上，将银与氧化锌的薄膜成膜形成的等离子芯片(chip)(专利文献2)；或是使金属纳米粒子分散于有机溶剂中，将有机溶剂挥发而使金属纳米粒子于二维方向自己组织化，从粒系均匀的银纳米微粒子形成的局部等离子体子荧光增强片(专利文献3)。
“于本发明使用的检体”
从含有血液的体液作成检体。由于红血球显示强的自体荧光，较优选为进行离心分离仅取出血浆。癌症疾病作为疾病关连物质时，稀释10至50倍，以可容易地测定片段化DNA(细分化核小体)的自体荧光的方式决定稀释率。于磷青铜上滴下约1000ppm的硫代硫酸银络合物水溶液，将作成的硫代硫酸银络合物量子结晶进行碱处理而氧化形成银氧化物介晶，较优选为将该银氧化物介晶稀释20至30倍。细胞的情形时，由于机械性破碎不会改变其物性而较优选。然后，方便的是片段化DNA(细分化核小体)形成稳定的蛋白质结合体(Protein-bound DNA fragments:nucleosome or chromatin)，显示较强的正电荷。因此，片段化DNA(细分化核小体)被选择性捕捉于显示负电荷且通过激发光显示表面等离子体子增强效果的等离子体子金属介晶，且由于片段化DNA(细分化核小体)稳定，即使真空干燥或以干燥剂(硅胶)干燥后保存，再溶解于蒸馏水等中，也可再现干燥前的蛋白质结合体自体荧光的特征。以干燥剂(硅胶)干燥不仅于现场采血、采集离心分离的血浆，如图4所示，也成为可于容器内干燥，以邮寄申请检査。另外，所有疾病中以异常蛋白质蓄积为原因的情况多，例如，阿兹海默病、巴金森氏症、肌肉萎缩性脊随侧索硬化症、亨丁顿氏舞蹈症等神经变性疾病的共通特征为由于神经细胞内凝集的异常蛋白质蓄积所致。异常蛋白质由于具有细胞毒性，引起神经细胞变性或细胞坏死。大多数的异常蛋白质通过泛素化被标记，以蛋白酶体分解，但，蛋白酶体无法将凝集的异常蛋白质破坏，于神经变性疾病的神经细胞，由于经泛素化的异常蛋白质的凝集体蓄积，暗示异常蛋白质的检测作为癌症以外的疾病关连物质的检测而可使用液体活检法。另外，由于iPS细胞有含有癌化基因DNA的情况，可将iPS细胞作为检体并以下列的自体荧光进行iPS细胞癌化的识别而除去。
“荧光影像取得步骤”
此处，对被捕捉于上述等离子体子金属介晶基板上的片段化DNA(细分化核小体)照射激发光，通过表面等离子体子增强效果而增强捕捉片段化DNA(细分化核小体)的自体荧光，取得荧光菌落作为荧光影像。
激发光使用适用于将于正常组织及病变组织其集积/排出特性不同的血紫质诱导体(肿瘤亲和性荧光物质)激发的405nm的激发光的激光光源。蛋白质结合体为采集血液进行离心分离，将获得的血浆以蒸馏水稀释30倍使用。
c)荧光菌落的采用步骤：
使用奥林巴斯DM(分色镜(dichroic mirror))405-445/514，由于获得图1的结果，将各试样每亮度的高点抽出例如10点(因应疾病而决定采集点数)，于中心附近作成圆形的ROI，算出光谱值。荧光菌落的10点采用为以専用软件“cellSens”二值化，采用既定阈值以上的亮度的荧光菌落。
其它的影像取得条件如下所述。
激光：405nm 50％
物镜：10倍(MPLFLN10×)
针孔径：500nm
取得波长：460-504nm
狭缝宽度：4nm
阶(step)：2nm
解像度：1024×1024
平均化：4次
d)演算步骤：
以采用的既定阈值以上的荧光菌落像素的总面积值或RGB及于与此相关的二波长域的像素的总面积比演算比(ratio)值。
其结果，根据总面积值及不同波长域的总面积的比(ratio)值可识别健康人、良性肿瘤、恶性肿瘤。另外，根据R、G、B的二波长比率及与此相关的二波长的比率(ratio)识别健康人、良性肿瘤、恶性肿瘤。
使用奥林巴斯公司制的DM405-445/514，取得470-490nm及600-620nm的影像，确认比(ratio)值是否有变化的结果获得图2的结果。关于***，G/R于良性肿瘤时为2.0左右，于健康人为1.70左右，于恶性肿瘤具有超过1.76至1.86为止的宽，明显显示与阶段(stage)的关连。此结果为通过试样数的增加可提升数值的精确度。
另外，由于每个点的亮度不同，以470nm的亮度作为100％，将各波长的亮度以比例表示，将10点的平均值作为每试样的数值并作成图表。另外，如图3所示，可确认于610nm前后的波长存在癌症关连物质的峰。
“目标对象及其以荧光显微镜观测到的捕捉目标对象的自体荧光影像”
于本发明将于癌症疾病及其它疾病中异常地产生的片段化DNA(细分化核小体)作为检测对象。发现与如此疾病关连的蛋白质结合体具有正电荷而被选择性捕捉于等离子体子金属介晶，经由激发光照射，通过等离子体子金属介晶的表面等离子体子增强效果而增强，发光具有可以荧光显微镜确认的既定以上亮度的自体荧光(图1)。这些蛋白质结合体通过疾病的发生而以细胞凋亡为代表的病理性细胞坏死而释放于血液及其它体液中，观测到图1所示的如夜空星座的多菌落，于小的观测到约25μm的扩展，于大的观测到约150μm的扩展。凋亡细胞为由于CAD(凋亡蛋白酶活性化DNase)的阻碍因子被分解，经活化的CAD将DNA以核小体单位切断，因而捕捉到约200bp倍数的片段化DNA(细分化核小体)。详言之，已知人类血浆中的细胞游离DNA(cfDNA)作为组织蛋白或与TF关连的蛋白质结合而释放于血中优先生存，于健康人主要为源自骨髄系淋巴系的细胞系，于确定病状认为是来自1种或多种的进一步组织的贡献，包含从癌症等病理学状态中的cfDNA推测细胞类型的核小体的足迹(footprint)，告知其组织的起源(非专利文献5：Cell，2016January14；164:Cell-free DNAcomprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin)。因此，已报导肿瘤的恶性度与更高度坏死有关，于循环血液中增加肿瘤DNA(ctDNA)，也报导血浆DNA显示与以核酸酶切断的核小体类似的可予测的片段化模型，于健康人及癌症患者可评估cfDNA的大小分布，血浆中的cfDNA参予肿瘤形成或转移的进行，且明白cfDNA作为液体活检的诊断生物标记的重要性(非专利文献4：Circulating Tumor DNAas a Liquid Biopsy for Cancer；Climinal Chemistry 2015；61:112-123)。
此处，癌症的发生是由于癌症基因及癌症抑制基因异常而产生的基因疾病为广被接受的事实，已知不仅是由于碱基序列的突变、缺失所致的基因性基因异常，于碱基的修饰导致的表观遗传的基因异常也导致癌症发生。于此表观遗传的基因的影响认为主要是于基因的转录控制机构作用，包括基因体DNA的甲基化修饰、与基因体DNA形成复合体的组织蛋白的乙酰化修饰或甲基化修饰。因此，检测与此cfDNA的组织蛋白的结合体不仅检测基因性的基因异常，也检测通过于碱基的修饰所致的表观遗传的基因异常，据此不仅可区别健康人及癌症患者，也暗示癌症发生部位的识别性。
(癌症关连物质的选择性捕捉)
作为血清中的癌症关连物质的片段化DNA(细分化核小体)包含DNA所缠绕的组织蛋白(核小体)、这些聚集成为绳状结构的染色质(纤维)。球蛋白也带正电荷，相比于其它癌症关连物质，球蛋白的增加最大为2倍以下，相对于此，于本发明探测的物质伴随癌的进行而增加至100倍以上，因此球蛋白以外的增加表示探测到癌症关连物质，所采用的荧光菌落的一定阈值以上的像素的总面积与癌症的阶段有关。
参照下列图表详细地说明本发明的实施方式。
(实施例1)
调制硫代硫酸银1000ppm水溶液，将该水溶液在磷青铜板上滴下1滴，放置约3分钟，将溶液吹散后，查看SEM像，已作成量子结晶。于显示实施例1制造的纳米粒子凝集体(量子结晶)的各种SEM像的照片(参照专利文献1的图1)中，为100nm左右的薄六角柱状结晶，于表面发现数纳米级的凹凸。无法确认金属纳米结晶所特有的刻面。于表示于磷青铜板上滴下后的放置时间及量子结晶形状关系的照片(专利文献1的图6)中，首先，确认生成六角形的量子结晶，一边维持形状一边成长，于表示量子结晶的EDS光谱(元素分析)结果的图表(专利文献1的图4)中，虽然形成于磷青铜板上的结晶检测到银及源自络合物配位基的元素，但，调制硫代硫酸银1000ppm水溶液，将该水溶液于铜板上滴下1滴，放置约3分钟，并将溶液吹散时仅检测到银。
(量子结晶的建造)
量子结晶为1000ppm硫代硫酸银络合物水溶液时，滴下至磷青铜板上并放置3分钟时，形成100nm左右的六角柱状，可从SEM像确认各六角柱状的量子结晶具有数纳米级的凹凸，但，无法确认金属纳米结晶所特有的刻面，由于以EDS元素分析检测到银及源自络合物配位基的元素，因此全体为银络合物的纳米结晶，推测于其表面出现的凹凸为络合物中的银作为团簇形成量子点而扩展。本发明的银络合物量子结晶形成于磷青铜板上，另一方面，观察到于铜基板上只析出银的纳米粒子的现象时，推测硫代硫酸银络合物的平衡电位为0.33，因与铜的电极电位(0.34)同等，于铜基板上只有银(0.80)析出，为磷青铜时为0.22，因电极电位稍低而析出银络合物的结晶。因此，为了作成量子结晶，认为重要的是：1)络合物水溶液为500至2000ppm的稀薄区域、2)相对于金属络合物水溶液的平衡电位，负载金属的电极电位稍低、3)以电极电位差使金属络合物凝集。另外，使用1000ppm硫脲银络合物水溶液时也相同。
(对于银氧化物的介晶的考察1)
于上述量子结晶基板滴下5％次氯酸钠水溶液，进行2分钟后除去时，观察到于专利文献1的图11表示的结晶结构，由于观察到针状的结晶及橄榄球状块的大块，若以EDS光谱(元素分析)分析各个组成，从以下的反应式认为针状的结晶皆为由氯化银及氧化银的复合结晶构成，但，专利文献1的图7的结果无法确认氯，明了以银及氧为主导。
Na2S2O3+4NaClO+H2O→Na2SO4+H2SO4+4NaCl (1)
Ag++NaCl→AgCl+Na+ (2)
Ag++3NaOCl→2AgCl+NaClO3+2Na+ (3)
Ag++OH-→AgOH (4)
2Ag++2OH-→Ag2O+H2O (5)
因此，本发明的介晶形成认为是银离子及硫代硫酸离子在氯离子存在下通过碱氧化反应生成，但，于通常的水溶液中只形成氧化银，从下述XPS测定推测为由过氧化银主导形成。
(对于银氧化物的介晶的考察2)
XPS测定：
于上述量子结晶基板花费2分钟滴下次氯酸钠水溶液25μl，制作再结晶基板，不经过浸蚀直接将Ag及O进行XPS测定(使用机种：ULVAC-PHI(股)公司制造)/PHI5000VersaProbeII(扫描型X线光电子分光分析装置))。另外，为了比较对象，测定氧化银粉及氯化银粉的Ag。另一方面，将再结晶基板以氩气团簇离子枪浸蚀5分钟，将Ag及O进行XPS测定。从EDS的结果(专利文献1的图8)推测XPS测定结果(专利文献1的图9及图10)，认为529eV附近的峰为源自过氧化银(AgO)的O峰，530eV附近的峰为源自氧化银(Ag2O)的O峰。进行浸蚀时氧量减少，529eV附近的峰为源自过氧化银(AgO)的O峰，大于530eV附近的峰为源自氧银(Ag2O)的O峰，说明于基板附近形成过氧化银。此是被推测会影响介晶形成时的催化作用及基板的电极电位。此外，EDS测定为将上述再结晶基板利用JSM-7001F(使用机种：日本电子(股)公司制造，场发射分析扫描式电子显微镜)进行。
另外，即使以次氯酸水溶液、0.01当量浓度氢氧化钠水溶液、0.01当量浓度盐酸水溶液、0.1摩尔碳酸钠水溶液处理硫代硫酸银的量子结晶，仍不能获得相同的结果。据此，针状结晶的形成认为是在银离子及硫代硫酸离子存在下通过上述反应产生。氧化银于水溶液中带负电荷，通过光还原使金属银析出。过氧化银由于其倾向显着，吸附正电荷的癌症关连物质且获得吸附的癌症关连物质与银粒子之间的表面等离子体子增强效果。
(片段化DNA(细分化核小体)的影像诊断)
核小体是以染色质的基本构成单位，在由4种组织蛋白(H2A、H2B，H3、H4)构成的组织蛋白8聚体以DNA包裹的结构，但，组织蛋白除了担任将DNA包裹的角色的外，于调节DNA的可及性(Accessibility)及基因控制也担任重要的角色。通过组织蛋白的转译后修饰控制与DNA或其它核蛋白质的相互作用，于可逆性的基因表现造成影响。组织蛋白修饰的种类己知主要有甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、瓜胺酸化、ADP核糖基化。组织蛋白的序列中通过哪个部位受到这些修饰，周围的基因表现活化或被抑制。若将这些组织蛋白的转译后修饰部位的组合及于基因表现的影响使用各种组织蛋白编码关连抗体(Genetex公司抗组织蛋白抗体)，将于本发明的等离子体子芯片(chip)捕捉到的组织蛋白编码的经修饰的状态以荧光影像观测时，可进行组织蛋白编码假设的验证。
DNA甲基化被认为深度参与此染色质结构控制。于DNA甲基化高密度所看到的基因体DNA部位，通常染色质结构坚定，观察到转录抑制或DNA变异率降低。另外，于基因体DNA的甲基化模型及基因体印记，X染色体不活化或细胞肿瘤化观察到明确的相关。因此，于片段化DNA(细分化核小体)中的组织蛋白及染色质的结构解析是掌握说明与癌症关连的关键，将组织蛋白尾解析化学修饰的因子可说是具有重要的意义。使用本发明的等离子体子芯片(chip)时，通过捕捉作为癌症关连物质的片段化DNA(细分化核小体)，根据其所捕捉到的结晶的多少，通过荧光影像诊断可判断癌症状是否存在。因此，其癌症状为何种臓器的癌症、其进行状态为何种程度可通过解析组织蛋白尾的化学修饰、重塑因子(Remodelingfactor)而判定。因此，作为分光条件使用445nm波长的激光光，使用激光用反射镜使用奥林巴斯公司制造的“BS10/90”，于455至655nm的范围每5nm测定分光光谱时，于从大肠癌症患者的血液采集的试样中，于515nm附近观测到峰，于从健康人的血液采集的试样未观测到该峰，认为通过分光可将何种臓器的癌单独或考虑于RGB区域的既定阈值以上的像素的总面积或于RGB区域的二波长域的既定阈值以上的像素的总面积比率G/G，G/B等而确定。因此，通过此染色质重塑事象，关于如何发生癌症、是否正进展着的信息，可使临床医生更正确地预测此类癌对何种特定的化学疗法剂会如何反应，于此方法，以肿瘤的化学感受性的知识为基础，可合理地设计化学疗法。
此外，于本发明，从以RGB获得的荧光影像计算出于二波长域的既定阈值以上的像素的总面积比的比(ratio)值，于G获得的荧光影像中，良性肿瘤有变高的倾向，于B获得的荧光影像中，恶性肿瘤有变高的倾向。因此，于实施例，关于***，以G/R解析比(ratio)值时，于良性肿瘤具有2.0左右，于健康人具有1.7，于恶性肿瘤具有1.76至1.86宽度的结果，另一方面，关于大肠，以B/G解析比(ratio)值时，恶性肿瘤具有1.9至2.0宽度，于健康人为0.2至0.8，于良性肿瘤为0.1左右。
(G区域短波长域/G区域长波长域的像素比率)
光源使用LED光源(XYLIS制波长360至770nm)，于奥林巴斯正立显微镜BX-63安装下列荧光波长滤器并限定进行测定的荧光波长，取得荧光影像。与上述同样地采用各波长域既定的阈值以上的像素，采用其总面积。
将9名大肠检査患者的试料(从血液离心分离所采集的血浆)滴在上述生物芯片(chip)上作成检体，寻求分子侧G区域及分母侧G区域的既定阈值以上的像素总面积。作为分子侧的激发光的滤器使用BP470至495nm，作为荧光滤器使用BA510至550nm。采用使用上述镜单元获得的荧光影像既定以上的阈值的像素作为比(Ratio)的分子并算出像素总面积。
另一方面，作为分母侧激发光的滤器使用BP460至480nm，作为荧光滤器使用BA495至540nm。采用使用上述镜单元获得的荧光影像既定以上的阈值的像素作为比(Ratio)的分母并算出像素总面积。算出以上的G区域分子/G区域分母的比(Ratio)，与以其它方法检査决定的阶段比较时，如下述表1所示。通过此明了于本发明方法获得的结果可观察到与实际检査决定的恶性/良性及阶段有密切关系。
[表1]
Figure BDA0003713184880000231
Figure BDA0003713184880000241

Claims (5)

1.一种利用自体荧光的液体活检法，包含下列步骤：a)使用具有试料中等离子体子金属介晶区域的测定基板，并使其与检体接触，将检体中的片段化DNA(细分化核小体)作为疾病关连物质，于等离子体子金属介晶捕捉电荷的步骤，其中，该检体为含有体液或细胞的培养液原状或经稀释作成；b)对该等离子体子金属介晶上捕捉到的片段化DNA(细分化核小体)照射激发光，通过表面等离子体子增强效果而增强其自体荧光，决定片段化DNA(细分化核小体)的荧光菌落的荧光影像的固定测定区域(ROI)，取得RGB任一区域的荧光菌落影像的步骤；c)采用该荧光菌落影像中显示既定阈值以上亮度的像素的步骤；d)演算于采用的测定区域的既定波长域中既定阈值以上的像素的总面积值、或采用的测定区域不同的二波长区域的既定阈值以上的像素的总面积值的比的步骤。
2.根据权利要求1所述的液体活检法，其中，等离子体子金属介晶为包含过氧化银介晶的等离子体子金属络合物量子结晶的氧化物，具有正电荷且具有表面等离子体子增强效果。
3.根据权利要求1所述的液体活检法，将捕捉的片段化DNA(细分化核小体)以B或G区域的相同或不同的二波长域的激发波长激发而获得荧光菌落，将该荧光菌落通过不同的二波长域的滤器采集，将B区域的既定阈值以上的像素的总面积值作为恶性肿瘤，另一方面，将G区域的既定阈值以上的像素的总面积值作为良性肿瘤，由此采集的像素的各总面积值的比(ratio)值为B区域/G区域或G区域/B区域的比值。
4.根据权利要求2所述的液体活检法，其中，于既定阈值以上的像素的总面积值的B区域/G区域的比值中，恶性肿瘤具有1.9至2.0的宽，健康人为0.2至0.8，良性肿瘤为0.1左右。
5.根据权利要求1所述的液体活检法，其中，捕捉到的片段化DNA(细分化核小体)含有经甲基化的癌抑制基因、经高甲基化的RB基因、p16以外的p14、p53。
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EP3974387A1 (en) * 2016-03-07 2022-03-30 X-Zell Inc. Compositions and methods for identifying rare cells
JP2021156576A (ja) * 2018-06-21 2021-10-07 有限会社マイテック 疾病関連タンパク結合体を標的とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法

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