CN114891111A - 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 - Google Patents
特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114891111A CN114891111A CN202111509433.6A CN202111509433A CN114891111A CN 114891111 A CN114891111 A CN 114891111A CN 202111509433 A CN202111509433 A CN 202111509433A CN 114891111 A CN114891111 A CN 114891111A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igg4
- seq
- protein
- variable region
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 22
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N Pro-Pro-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RCYUBVHMVUHEBM-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Ser Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RBWKVOSARCFSQQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- OTQSTOXRUBVWAP-NRPADANISA-N Gln-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OTQSTOXRUBVWAP-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAXARWKYFIIHKD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N Ile-Glu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N PHIXPNQDGGILMP-YVNDNENWSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- OQSQCUWQOIHECT-YJRXYDGGSA-N Ser-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OQSQCUWQOIHECT-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 3
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 3
- CWVHKVVKAQIJKY-ACRUOGEOSA-N Tyr-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N CWVHKVVKAQIJKY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N Asn-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYTHOBCLNIOFBL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N Gln-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- SDTPKSOWFXBACN-GUBZILKMSA-N His-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SDTPKSOWFXBACN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QHSSUIHLAIWXEE-IHRRRGAJSA-N Pro-Tyr-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O QHSSUIHLAIWXEE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N Tyr-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N XYNFFTNEQDWZNY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- KHPLUFDSWGDRHD-SLFFLAALSA-N Tyr-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)C(=O)O KHPLUFDSWGDRHD-SLFFLAALSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010045397 lysyl-tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAXHINASXXXILC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asp-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PAXHINASXXXILC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RTFWCVDISAMGEQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OVPHVTCDVYYTHN-AVGNSLFASA-N Asp-Glu-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OVPHVTCDVYYTHN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O KPSHWSWFPUDEGF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N Glu-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFNUFCFRAZPJFW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- AKEDPWJFQULLPE-IUCAKERBSA-N His-Glu-Gly Chemical compound N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O AKEDPWJFQULLPE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 208000004187 Immunoglobulin G4-Related Disease Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N Leu-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMDDEJADNKQTBR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PELXPRPDQRFBGQ-KKUMJFAQSA-N Lys-Tyr-Asn Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O PELXPRPDQRFBGQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- TXJJXEXCZBHDNA-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)N TXJJXEXCZBHDNA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N Ser-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N Thr-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KVEWWQRTAVMOFT-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- UQHPXCFAHVTWFU-BVSLBCMMSA-N Trp-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UQHPXCFAHVTWFU-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- NXRGXTBPMOGFID-CFMVVWHZSA-N Tyr-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NXRGXTBPMOGFID-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HZDQUVQEVVYDDA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108010057952 lysyl-phenylalanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229910052702 rhenium Inorganic materials 0.000 description 1
- WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N rhenium atom Chemical compound [Re] WUAPFZMCVAUBPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078580 tyrosylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
本分案申请涉及生物医药技术领域，具体涉及特异性结合人IgG4的蛋白及其应用，公开了抗人IgG4抗原的蛋白序列，能很好的应用到临床检测试剂中，实现对于样本中IgG4的简单、快速、高特异性检测，突破了目前国内自主研发IgG4抗体或抗原结合片段的技术壁垒，实现了低成本、高效率的原料开发，对于未来的国内检测试剂有重大作用。
Description
本分案申请的母案申请日为2020年12月31日，申请号为202011644854.5，发明名称为“特异性结合人IgG4的蛋白及其应用”，根据第一次审查意见不具备单一性，作出分案申请。
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及特异性结合人IgG4的蛋白及其应用。
背景技术
IgG4相关性疾病是一种与IgG4淋巴细胞密切相关的慢性、***性疾病，该类疾病以血清IgG4水平升高以及IgG4阳性细胞浸润多种器官和组织为特征，常受累多种器官，因此IgG4的准确测量可以为临床研究提供参考，具有很高的应用价值。
但IgG4与IgG中其他亚类IgG1，IgG2或IgG3的同源性非常高，且在正常健康血清中的IgG4存在比例仅占4％左右，为人体内含量最低的免疫球蛋白G亚型，所以，IgG4的检测非常困难，对检测试剂的灵敏度和特异性的要求都很高，因此开发出性能优异的抗体是十分必要的，但目前国内IgG4抗体开发依旧存在着较高的技术壁垒，市面上基本没有IgG4的相关检测试剂，只有西门子的生化试剂被广泛应用，但西门子的检测试剂并不具有普适性，必须配合昂贵的特种蛋白仪，且存在检测时间较长的问题。
因此，开发出性能优良的IgG4特异性抗体，使其能够被广泛应用到各类IgG4检测试剂中，并最终能够实现对IgG4的高灵敏、高特异性、快速测量是十分重要的。
发明内容
本发明提供人IgG4结合蛋白，以解决IgG4检测困难、检测时间较长的问题，利用低廉的成本实现对人体血液中微量IgG4的高灵敏、高特异性、快速测量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
特异性结合人IgG4的蛋白，所述蛋白为抗IgG4抗体或抗原结合片段，包括：
a)如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab16
或
a)如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab18
或
a)如SEQ ID NO:13所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:14所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:15所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:16所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:17所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:18所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab20
或
a)如SEQ ID NO:19所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:20所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:21所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:22所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:23所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:24所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab27
或
a)如SEQ ID NO:25所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:26所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:27所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:28所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:29所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:30所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab28
优选地，上述蛋白为抗IgG4单克隆抗体。
在另一方面，本发明还公开了编码SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:7-12、SEQ ID NO:13-18、SEQ ID NO:19-24和/或SEQ ID NO:25-30可变区的核酸。
在另一方面，本发明公开了，包含所述核酸的表达载体。
在另一方面，本发明公开了，包含所述表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明还公开了一种包含上述中任意一项所述的特异性结合人IgG4的蛋白，其中所述蛋白优选为：单克隆抗体Ab16、Ab18、Ab20、Ab27或Ab28。
优选地，所述试剂盒包含所述任意两种或多种抗体的组合，且每种组合中的抗体同时识别IgG4蛋白，测定IgG4蛋白浓度。
在另一方面，本发明公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的上述任意种所述的单克隆抗体。
在另一方面，本发明公开了一种偶联物，由所述的单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
此外，本发明还公开了所述的蛋白和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备检测IGG4表达的产品中的应用。
本发明的有益效果在于：利用本发明公开的特异性结合人IgG4的蛋白及其应用，可以实现对IgG4的特异性检测，相比于现在市面广泛使用的检测方法，操作简便、用时更短。
附图说明
图1是Ab28制备的试剂抗干扰实验；
图2是不同工艺检测相关性比较。
图3是Ab16制备的试剂盒与西门子试剂盒检测相关性；
图4是Ab18制备的试剂盒与西门子试剂盒检测相关性；
图5是Ab20制备的试剂盒与西门子试剂盒检测相关性；
图6是Ab27制备的试剂盒与西门子试剂盒检测相关性；
图7是Ab28制备的试剂盒与西门子试剂盒检测相关性；
图8是Ab16制备的试剂盒与西门子试剂盒临床相关性；
具体实施例
本发明提供抗IgG4单克隆抗体，以解决IgG4检测困难、检测时间较长的问题。
实施例1重组蛋白人IgG4的表达纯化
将人花粉过敏原IgG4基因序列克隆至真核表达载体构建真核表达质粒，该表达质粒转染HEK293细胞后用悬浮培养5天，离心收集细胞上清。采用G柱纯化得到抗原蛋白。
实施例2小鼠免疫及抗体检测
将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的抗原蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠。采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40ug抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40ug抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。筛选达到106的小鼠取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。
实施例3细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆
筛选通过三个步骤筛选获得的杂交瘤：1)确认与IgG4结合的能力；2)确认特异性。
1)为了筛选到高亲和力的抗人IgG4抗体，采用结合人IgG4蛋白进行阳性孔筛选。选取ELISA阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆，选出亲和力最高的单克隆杂交瘤细胞。
2)特异性的评价：从1)中选择的克隆产生的抗体的特异性进行评价。用PBS将骨髓瘤人IgG1(Sigma)，骨髓瘤人IgG2(Sigma)，骨髓瘤人IgG3(Sigma)，骨髓瘤人IgG4(Sigma)调整为1μg/mL。将调整后的样品以100μL的份数添加到96孔板中。用摇床摇动后的操作与上述1)相同。在众多克隆中，选择了与骨髓瘤人IgG1、2和3相比显示出对骨髓瘤人IgG4有反应的17个克隆，其中反应性较强的有5个。
实施例4单克隆抗体的生产纯化
使用6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500ul石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向腹腔内注入约1X106数量的目的杂交瘤细胞。两周之后开始腹水搜集。搜集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体。
实施例5单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。经过鉴定，17株抗体的重链均为IgG1，轻链为Kappa。用杂交瘤细胞提取制备mRNA，使用Takara公司的反转录酶PrimeScriptTMIIReverse Transcriptase结合针对特定亚型设计的引物进行反转录。最后采用标准的抗体可变区基因克隆引物进行抗体基因序列扩增。扩增产物链接T载体以后经过质粒测序获得抗体基因序列。
实施例6单克隆抗体的线性实验
试剂配方：R1：TRIS缓冲液100mmo/L、KCl 0.1mol/L、Tween 20 3g/L、叠氮化钠1g/L；R2：PBS缓冲液50mmoL，KCl 0.3mol/L、IgG4单克隆抗体500mg/L、乳胶微球40mL/L、BSA30g/L。
检测用仪器：全自动生化分析仪(日立7180)
具体操作方法：将Ab12-Ab28抗体制成试剂盒，即试剂2中的IgG4单克隆抗体分别是Ab12-Ab28，
(1)将待测的血清样本与试剂R1以及试剂R2混合，搅拌混匀，使其充分反应；
(2)用全自动生化分析仪(日立7180)测定反应后的吸光度差值(主波长340nm，副波长700nm)；
(3)根据吸光度变化值计算出样本中IgG4的浓度。
(4)以浓度为X轴，吸光值为Y轴作图，计算R2，验证不同抗体的性能。
检测原理：
样品中IgG4可与试剂中的抗IgG4抗体结合形成抗原-抗体-微球复合物，产生一定浊度，该浊度高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行IgG4的定量测定。
样本中补体IgG4(g/L)＝CS×ΔAT/ΔAS(g/L)
(式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，CS校准液中IgG4的浓度)
实验结果如下表所示
表1制备单克隆抗体线性实验
结果表明，Ab16、Ab18、Ab20、Ab27、Ab28的R2均在0.9以上，证明线性较好，能够保证检测结果的准确性；且K值均大于1000，证明样本检测的梯度较好，说明抗原抗体的结合能力较强，其中Ab28的效果最好，选择其作为后续试验中采用的抗体。
实施例7抗体效价测定
IgG4全长原核抗原稀释至1ug/ml，按每孔100ul添加至96孔板中，4℃孵育过夜，洗板。抗体稀释至合适浓度，按照3倍比进行稀释，每孔100ul，37摄氏度孵育1h，洗板。羊抗鼠HRP酶标抗体按照1：3000稀释，37℃孵育30min，显色3min，A450nm检测吸光度。
其中对照为4℃孵育的抗体本身，结果如表2-6所示。
表2 Ab16间接效价测定
表3 Ab18间接效价测定
表4 Ab20间接效价测定
表5 Ab27间接效价测定
表6 Ab28间接效价测定
结果表明：在较低的浓度下，检测信号已经存在较大的梯度，说明四株抗体的灵敏度均较高，适合用于后续试验。
实施例8抗体稳定性测定
将抗体在既定缓冲中进行37℃热加速7天，通过SDS-PAGE及ELISA间接法对加速抗体进行评价，与4℃作对照，鉴定抗体的长期稳定性。另外通过在-20℃进行反复冻融5次，以同样的标准对抗体的冻融稳定性进行评价，结果如表8-12所示。
表8 Ab16稳定性测定
| 浓度ng/ml | 冻3次 | 冻5次 | 加速7d | 加速14d | 加速21d | 4℃ |
| 1000 | 2.437 | 2.409 | 2.613 | 2.657 | 2.655 | 2.586 |
| 300 | 2.318 | 2.305 | 2.502 | 2.524 | 2.533 | 2.479 |
| 100 | 2.28 | 2.172 | 2.351 | 2.407 | 2.359 | 2.324 |
| 33.33 | 1.658 | 1.698 | 1.757 | 1.695 | 1.719 | 1.738 |
| 11.11 | 1.092 | 1.181 | 1.21 | 1.253 | 1.271 | 1.219 |
| 3.70 | 0.509 | 0.579 | 0.688 | 0.731 | 0.776 | 0.769 |
| 1.23 | 0.261 | 0.275 | 0.316 | 0.369 | 0.351 | 0.275 |
| 0.41 | 0.125 | 0.147 | 0.151 | 0.169 | 0.174 | 0.137 |
| 0.14 | 0.085 | 0.093 | 0.098 | 0.111 | 0.106 | 0.096 |
| 0 | 0.061 | 0.061 | 0.063 | 0.061 | 0.061 | 0.062 |
表9 Ab18稳定性测定
表10 Ab20稳定性测定
| 浓度ng/ml | 冻3次 | 冻5次 | 加速7d | 加速14d | 加速21d | 4℃ |
| 1000 | 2.323 | 2.225 | 2.387 | 2.438 | 2.402 | 2.339 |
| 300 | 2.223 | 2.156 | 2.245 | 2.256 | 2.310 | 2.255 |
| 100 | 2.132 | 2.107 | 2.130 | 2.284 | 2.272 | 2.154 |
| 33.33 | 1.753 | 1.721 | 1.792 | 1.854 | 1.833 | 1.801 |
| 11.11 | 1.052 | 1.185 | 1.231 | 1.334 | 1.365 | 1.295 |
| 3.70 | 0.582 | 0.576 | 0.657 | 0.703 | 0.727 | 0.608 |
| 1.23 | 0.223 | 0.217 | 0.304 | 0.328 | 0.325 | 0.295 |
| 0.41 | 0.124 | 0.137 | 0.152 | 0.165 | 0.173 | 0.140 |
| 0.14 | 0.082 | 0.092 | 0.097 | 0.112 | 0.106 | 0.096 |
| 0 | 0.063 | 0.048 | 0.063 | 0.061 | 0.061 | 0.060 |
表11 Ab27稳定性测定
| 浓度ng/ml | 冻3次 | 冻5次 | 加速7d | 加速14d | 加速21d | 4℃ |
| 1000 | 2.558 | 2.431 | 2.687 | 2.885 | 2.743 | 2.560 |
| 300 | 2.446 | 2.315 | 2.539 | 2.775 | 2.709 | 2.449 |
| 100 | 2.332 | 2.271 | 2.013 | 2.861 | 2.272 | 2.354 |
| 33.33 | 1.742 | 1.992 | 1.955 | 2.385 | 2.222 | 1.985 |
| 11.11 | 1.025 | 1.215 | 1.512 | 1.624 | 1.475 | 1.215 |
| 3.70 | 0.585 | 0.597 | 0.685 | 0.705 | 0.755 | 0.614 |
| 1.23 | 0.255 | 0.245 | 0.326 | 0.365 | 0.355 | 0.307 |
| 0.41 | 0.145 | 0.127 | 0.155 | 0.185 | 0.173 | 0.158 |
| 0.14 | 0.075 | 0.092 | 0.097 | 0.105 | 0.126 | 0.106 |
| 0 | 0.047 | 0.064 | 0.073 | 0.066 | 0.067 | 0.062 |
表12 Ab28稳定性测定
| 浓度ng/ml | 冻3次 | 冻5次 | 加速7d | 加速14d | 加速21d | 4℃ |
| 1000 | 2.687 | 2.563 | 2.773 | 2.879 | 2.885 | 2.735 |
| 300 | 2.546 | 2.449 | 2.643 | 2.771 | 2.760 | 2.535 |
| 100 | 2.431 | 2.272 | 2.416 | 2.568 | 2.575 | 2.433 |
| 33.33 | 1.745 | 1.925 | 1.975 | 1..953 | 2.091 | 1.985 |
| 11.11 | 1.191 | 1.285 | 1.513 | 1.645 | 1.475 | 1.415 |
| 3.70 | 0.685 | 0.629 | 0.687 | 0.735 | 0.755 | 0.619 |
| 1.23 | 0.359 | 0.286 | 0.356 | 0.368 | 0.397 | 0.324 |
| 0.41 | 0.134 | 0.127 | 0.151 | 0.165 | 0.173 | 0.157 |
| 0.14 | 0.085 | 0.095 | 0.097 | 0.123 | 0.121 | 0.093 |
| 0 | 0.061 | 0.061 | 0.063 | 0.061 | 0.062 | 0.061 |
实验结果显示，上述所有抗体(Ab16、Ab18、Ab20、Ab27、Ab28)可以在4℃下稳定保存，在37℃加速一个月性质依旧稳定，保证了开瓶使用试剂的性能，从而保证检测结果的准确和稳定，且加速之后的抗体性能还要更加灵敏，可能是加速条件中其他添加物质对抗体产生了良性的影响。
此外，本发明抗体还可以反复冻融，不会对抗体本身的性能产生影响，非常适合实际应用场景。
实施例9抗干扰实验
本实施例试剂配方同上，其中R2中的IgG4单克隆抗体为Ab28
因为在血清中IgG1、IgG2、IgG3、IgG4存在高度的相似性，所以本实验考察IgG1、IgG2、IgG3的存在对本发明抗体是否具有干扰性，因为血液中IgG1:IgG2:IgG3:IgG4＝66:23:7:4，所以本实验按照比例添加干扰物质。
将浓度为1mg/ml纯化的重组IgG4蛋白与浓度为1.75mg/ml IgG3、5.75mg/mlIgG2、16.5mg/ml IgG1混匀。用不含IgG4的血清作为稀释液，分别配制浓度为0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L的重组IgG4蛋白和混合液。按照上述实验条件，用上述制备的IgG4含量检测试剂盒分别测定各稀释样品的浓度。结果表明制备的IgG4含量检测试剂盒测定纯化的重组IgG4蛋白和混合液中的重组IgG4蛋白(图1)的线性回归直线斜率达到了0.99以上，说明用本发明单克隆抗体制备的的IgG4检测试剂盒测定单纯的IgG4蛋白和混合的IgG4蛋白时差异较小，试纸条能够耐受IgG1、IgG2、IgG3对IgG4含量测定的干扰。
实施例10制备工艺探究
一般用于实验研究，需要小批量的单克隆抗体的制备，但工业应用需要大批量的生产，工艺的不同，往往会对单克隆抗体的性能产生影响，本实施例，探究本发明制备的Ab28小批量生产和大批量生产的工艺影响。
其中小批量生产采用涡旋，大批量采用搅拌
结果如下表和图2所示
表13不同工艺
结果显示R2＝0.998，表明混匀的方式并不会对抗体的性能产生实质性的影响。实际操作中可以自行选择。
实施例11相关性实验
本发明试剂和检测方法同实施例6中所示。
对照试验为西门子的BN II特种蛋白仪检测IGG4
具体操作如下(详细可参考西门子BN II操作说明书)：
(1)仪器自动初始化，约20分钟；
(2)录入稀释条、质控品、校准品、清洗液；
(3)录入样品信息，根据样品浓度选择稀释倍数；
(4)取出并清洗稀释条、烘干→开始新一轮测试。
目前西门子BN II检测样品存在以下问题：①初始化时间很长，需要20分钟左右。②采样速度慢，需要先录入样本信息，对样本放置及状态都有特定的要求，实验操作复杂。③仪器采用稀释的方法测试，超过浓度范围的浓度需要稀释再进行测试，大大增加了检测时间(测试30个样本，需要2个小时以上)④稀释条一旦测试用完，需要停机换稀释条，上述所有操作重新进行，非常损耗时间。
相比于操作复杂的特种蛋白仪，利用生化仪大大简化了操作，缩短了时间，生化仪操作不需要在仪器中放置或者更换稀释条，只需要开机、设置参数、录入质控品、采集样本进行检测，测试30个样本，需约10分钟的时间。
本实施例选择上述实施例中，性能较好的Ab16、Ab18、Ab20、Ab27、Ab28单克隆抗体制备的试剂盒，用西门子公司的试剂盒与本发明试剂盒相比较，同时检测不同浓度的样本，验证本发明单克隆抗体在实际应用中的性能。
结果如下表所示
表14本发明试剂盒与西门子试剂盒相关性
从上表和图3-7中可以看出，上述五铢单克隆抗体，应用到试剂盒中，检测试剂样本与西门子检测结果的相对偏差在15％以内，R2在0.99以上，表明本发明单克隆抗体制备的试剂盒与西门子试剂盒相比相关性较好，目前西门子的试剂盒是市场上普遍使用的、性能优良的检测试剂，通过与西门子试剂的相关性探究，可以证明本发明单克隆抗体的优良性能，但目前西门子试剂盒检测存在最大的问题在于需要特种蛋白仪，检测时间较长，不利于临床试验对检测及时、快速的要求，而通过上述操作的描述，可以知道本发明检测方便、快速，不需要其他的仪器，只需要利用市面上普遍存在的生化仪就能实现对样本中IGG4的检测，因此，本发明不仅能够达到进口试剂优良的性能，而且简单、快速，适用于临床检测。
实施例12临床试验
操作步骤和试剂同上述实施例
结果如下表和图8所示：
表15本发明试剂盒与西门子试剂盒临床相关性
结果表明，在小于4g/L的检测范围内，本发明与西门子相关性较好，IGG4含量大于4g/L的样本，检测时会进行稀释，稀释到可以检测的浓度进行测量，得出结果。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 中元汇吉生物技术股份有限公司
<120> 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用
<130> 2020.12.29
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> mouse
<400> 1
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 2
Thr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> mouse
<400> 3
His Glu Gly Tyr Tyr Lys Tyr Lys Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> mouse
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> mouse
<400> 5
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> mouse
<400> 6
Gln Gln Ser Ile Glu Glu Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> mouse
<400> 7
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 8
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> mouse
<400> 9
His Glu Asp Tyr Tyr Lys Tyr Lys Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> mouse
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Phe Phe His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> mouse
<400> 11
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> mouse
<400> 12
Gln Gln Ser Ile Glu Glu Pro Pro Thr
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> mouse
<400> 13
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 14
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> mouse
<400> 15
His Glu Asp Tyr Tyr Lys Tyr Lys Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> mouse
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> mouse
<400> 17
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> mouse
<400> 18
Gln Gln Ser Ile Glu Glu Pro Pro Thr
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> mouse
<400> 19
Thr Tyr Val Met His
1 5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 20
Asn Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> mouse
<400> 21
Asn Asp Tyr Asp Pro Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> mouse
<400> 22
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> mouse
<400> 23
Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> mouse
<400> 24
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> mouse
<400> 25
Ser Ser Ile Ile His
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 26
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> mouse
<400> 27
Gly Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> mouse
<400> 28
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ile
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> mouse
<400> 29
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> mouse
<400> 30
Leu His Tyr Asp Asp Phe Pro Pro Thr
1 5
Claims (9)
1.特异性结合人IgG4的蛋白，其特征在于，所述蛋白为抗IgG4抗体或抗原结合片段，包括：
a)如SEQ ID NO:19所列的重链可变区CDR1；
b)如SEQ ID NO:20所列的重链可变区CDR2；
c)如SEQ ID NO:21所列的重链可变区CDR3；
d)如SEQ ID NO:22所列的轻链可变区CDR1；
e)如SEQ ID NO:23所列的轻链可变区CDR2；
f)如SEQ ID NO:24所列的轻链可变区CDR3；
上述抗人IgG4抗体或抗原结合片段，命名为Ab27。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为抗IgG4单克隆抗体。
3.编码抗人IgG4单克隆抗体的核酸，其特征在于，所述核酸编码抗体的可变区如SEQID NO：19-24。
4.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3中所述的核酸。
5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4中所述的表达载体。
6.一种IgG4检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2中所述的特异性结合人IgG4的蛋白。
7.一种结合物，其特征在于，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1或2中任意一种蛋白。
8.一种偶联物，其特征在于，由权利要求1或2中所述的蛋白、和/或权利要求7所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
9.权利要求1或2中所述的蛋白和/或权利要求7中所述的结合物和/或权利要求8中所述的偶联物在制备检测IgG4表达的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111509433.6A CN114891111A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111509433.6A CN114891111A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202011644854.5A CN112646040B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011644854.5A Division CN112646040B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114891111A true CN114891111A (zh) | 2022-08-12 |
Family
ID=75367093
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111509433.6A Pending CN114891111A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202111507694.4A Pending CN114891110A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202111516429.2A Pending CN114891112A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202111509420.9A Pending CN114920845A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202011644854.5A Active CN112646040B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Family Applications After (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111507694.4A Pending CN114891110A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202111516429.2A Pending CN114891112A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202111509420.9A Pending CN114920845A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
| CN202011644854.5A Active CN112646040B (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (5) | CN114891111A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101607985A (zh) * | 2008-12-24 | 2009-12-23 | 中国科学院生物物理研究所 | 抗人cea的单克隆抗体，包含其的组合物，及其用途 |
| CN109265542A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-25 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用 |
| CN110133278A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 浙江众意生物科技有限公司 | 一种用于检测人vegf蛋白表达水平的体外试剂盒 |
| CN110655572A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-07 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种抗丝状病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN111315759A (zh) * | 2017-10-12 | 2020-06-19 | E&S医疗保健有限公司 | 硫氧还蛋白1表位及与其特异性结合的单克隆抗体 |
| CN111499746A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-07 | 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 | 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2171336C (en) * | 1993-09-07 | 2011-06-21 | Stephen Dudley Holmes | Recombinant il4 antibodies useful in treatment of il4 mediated disorders |
| US5914110A (en) * | 1993-09-07 | 1999-06-22 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders |
| GB0520644D0 (en) * | 2005-10-11 | 2005-11-16 | Domantis Ltd | Antibody polypeptide library screening and selected antibody polypeptides |
| CA2939200A1 (en) * | 2014-02-19 | 2015-08-27 | Jody Berry | Ebola monoclonal antibodies |
| WO2016034968A1 (en) * | 2014-09-02 | 2016-03-10 | Pfizer Inc. | Therapeutic antibody |
| LT3194434T (lt) * | 2014-09-15 | 2019-09-25 | Molmed Spa | Chimeriniai antigeno receptoriai |
| CN106040187A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-10-26 | 广东医学院附属医院 | 一种人IgG4抗体的吸附柱及其制备方法和用途 |
| KR102661060B1 (ko) * | 2017-07-06 | 2024-04-25 | 니토 보세키 가부시기가이샤 | 항인간 IgG4 모노클로날 항체, 및 그 항체를 이용한 인간 IgG4 측정 시약 |
| RU2734432C1 (ru) * | 2019-04-23 | 2020-10-16 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR |
| CN110551213B (zh) * | 2019-10-17 | 2022-08-16 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用 |
| CN111635458A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-09-08 | 上海健信生物医药科技有限公司 | 靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段及其制备和应用 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202111509433.6A patent/CN114891111A/zh active Pending
- 2020-12-31 CN CN202111507694.4A patent/CN114891110A/zh active Pending
- 2020-12-31 CN CN202111516429.2A patent/CN114891112A/zh active Pending
- 2020-12-31 CN CN202111509420.9A patent/CN114920845A/zh active Pending
- 2020-12-31 CN CN202011644854.5A patent/CN112646040B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101607985A (zh) * | 2008-12-24 | 2009-12-23 | 中国科学院生物物理研究所 | 抗人cea的单克隆抗体，包含其的组合物，及其用途 |
| CN111315759A (zh) * | 2017-10-12 | 2020-06-19 | E&S医疗保健有限公司 | 硫氧还蛋白1表位及与其特异性结合的单克隆抗体 |
| CN109265542A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-25 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用 |
| CN110133278A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-16 | 浙江众意生物科技有限公司 | 一种用于检测人vegf蛋白表达水平的体外试剂盒 |
| CN110655572A (zh) * | 2019-10-11 | 2020-01-07 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种抗丝状病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用 |
| CN111499746A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-07 | 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 | 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112646040B (zh) | 2022-03-25 |
| CN114891112A (zh) | 2022-08-12 |
| CN112646040A (zh) | 2021-04-13 |
| CN114920845A (zh) | 2022-08-19 |
| CN114891110A (zh) | 2022-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102549704B1 (ko) | Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법 | |
| CN113004412B (zh) | 胃蛋白酶原i单克隆抗体及其应用 | |
| JP5199067B2 (ja) | 免疫凝集反応試薬キット及び抗原の測定方法 | |
| CN114181308B (zh) | 一种降钙素原抗体及其应用 | |
| CN107003307B (zh) | 降低干扰的方法 | |
| WO2019166664A1 (en) | Anti – pla2-gib antibodies and the uses thereof | |
| CN114634576B (zh) | 抗pivka-ii单克隆抗体及其应用 | |
| CN113045666B (zh) | 胃蛋白酶原ii单克隆抗体及其应用 | |
| KR101138460B1 (ko) | 항-ｆａｓｎ 자가면역 항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 | |
| CN113045646B (zh) | 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的抗体 | |
| WO2013187371A1 (ja) | 癌の検出方法及び膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体 | |
| CN112646040B (zh) | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 | |
| CN114891103B (zh) | 一种钙卫蛋白单克隆抗体及试剂盒 | |
| CN113933498B (zh) | 一种检测黄原胶的双抗体夹心elisa方法 | |
| CN111378034A (zh) | 抗恶性疟原虫hrp-ii抗体 | |
| CN111793136A (zh) | 一种nmp22抗体对及其应用 | |
| JP5782690B2 (ja) | 抗ｎｐ−ｈ２８９抗体の作製方法 | |
| CN117683121B (zh) | 抗水痘-带状疱疹病毒抗体及其应用 | |
| CN113150143B (zh) | 一种用于检测血清中g17含量的配对抗体及其应用 | |
| CN116143929B (zh) | 抗重组人凝血因子VIIa-Fc融合蛋白的抗体及其应用 | |
| CN117264072B (zh) | 一种抗sn38单抗及其应用 | |
| CN114181313B (zh) | 抗ck-mb的抗体或其抗原结合部分及其应用 | |
| CN111208307B (zh) | 一种与参照分子具有相同或不同的靶蛋白结合的分子的筛选方法 | |
| CN116284382A (zh) | 抗降钙素原抗体及其应用 | |
| CN117783526A (zh) | 一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220812 |