CN114878816A

CN114878816A - 猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法

Info

Publication number: CN114878816A
Application number: CN202210602444.7A
Authority: CN
Inventors: 昝洁; 陈翠翠; 梁焕坤; 赖宏锐; 郭桂铃; 李来庆; 宁波
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-05-30
Filing date: 2022-05-30
Publication date: 2022-08-09

Abstract

本发明提供了一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、对照线和吸水垫。本发明的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性；受外界因素影响较小，检测灵敏度和准确性高；能稳定保存，携带方便，不需仪器设备，综合成本较低，非常适合临床和基层单位使用。本发明的试纸操作简单易掌控，无需专业人员操作。

Description

猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法

技术领域

本发明属于体外免疫诊断技术领域，涉及一种用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条及其制备方法。

背景技术

冠状病毒(Coronaviruses，CoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，拥有已知RNA病毒中最大的基因组序列长度。

目前，猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndromecoronavirus,SADS-CoV)在社会上广受关注，针对病毒类抗原的检测，一直是病毒类疾病检测的主要方法之一。目前，对于猪SADS-CoV的检测以核酸法占绝对地位，尚没有SADS-CoV抗原检测试剂。因此，获得能够快读检测该病毒抗体的试剂盒或试纸条成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)抗原的胶体金免疫层析试剂条。本发明采用自行制备的SADS-CoV重组抗原S1蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，然后利用筛选的单克隆抗体，制备了双抗体夹心法检测SADS-CoV-S1抗原的胶体金免疫层析试剂。

本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：

一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、质控线和吸水垫；

样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线和质控线依次设在硝酸纤维膜上；胶体金结合垫上喷有猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体与胶体金结合的复合物；在所述检测线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗体，在质控线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原。

优选地，所述载体板可采用PVC板。

本发明还提供了一种制备本发明试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1制备猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原(SADS-CoV的S1糖蛋白亚单位抗原) 的DNA，并***大肠杆菌中使其表达，再经蛋白纯化技术，获得猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原，记为：SADS-CoV-S1。

S2制备胶体金溶液：取1.0ml的1％氯金酸溶液加入到100mL去离子双蒸水中，得到浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液 2mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中2～8℃保存备用；

S3制备胶体金结合垫：将胶体金与SADS-CoV-S1单克隆抗体复合物溶液喷至结合垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的结合垫置于干燥室干燥，备用；

S4在硝酸纤维膜上制备质控线C和检测线T：将步骤S1制备的抗原溶液稀释至1.0～2.0mg/ml的质控线溶液；将SADS-CoV-S1单克隆抗体溶液稀释成 0.5～1.0mg/ml的检测线溶液；通过喷金划膜仪将所述质控线溶液与所述检测线溶液分别喷至硝酸纤维膜上质控线与检测线的位置，二者之间间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室干燥后，备用；

S5样品垫的预处理：将样品垫用预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室干燥12h后，备用；

S6制备免疫层析检测条：将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，将样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上；胶体金结合垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上；吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上；用切条机切成条状，得到用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条。

优选地，所述步骤S3中胶体金与SADS-CoV-S1单克隆抗体复合物溶液的制备方法如下：在1ml胶体金溶液中加入2～10μl的0.1mol/L K₂CO₃溶液混匀，加入5～10μg SADS-CoV-S1单克隆抗体混匀之后，再加入50～100μl的10％ BSA溶液进行封闭，置于冷冻离心机内离心，弃上清液，取沉淀用胶体金溶液复溶，获得SADS-CoV抗体-胶体金复合物溶液。

优选地，上述使用的胶体金溶液还包含pH8.2的0.02mol/l Tris缓冲液， 0.1％Casein，0.3％～0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)，2～5％海藻糖。

优选地，所述步骤S4稀释液为pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液。

优选地，所述步骤S5样品垫预处理液为：pH7～8，含有质量浓度为0.2-1％的吐温-20和0.1-0.5％的海藻糖的Tris-Hcl缓冲液。

本发明检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条的检测原理为：

将本发明的试剂条的样品垫一端***到样品中，根据双抗夹心免疫层析原理，由胶体金结合标记的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体(即金标抗体)与检测样品中的抗原反应，形成金标抗体-病毒抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维膜上预先包被在检测线上的特异性猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体(即特异抗体)处时，此处的抗体会识别该复合物中的抗原与其结合，其结果便形成了金标抗体-病毒抗原-特异抗体的夹心结构，最终金标抗体上的胶体金颗粒在此处固定并累积，出现肉眼可见的红色线，而未反应的金标抗体仍继续层析前行，当达到预先包被在质控线上的猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原时，发生抗体抗原结合反应，未与样品中病毒抗原结合的金标抗体被重组抗原捕捉，形成金标抗体-病毒重组抗原复合物，从而在质控线也出现由胶体金颗粒固定并累积显现出肉眼可见的红色线。

根据上述检测原理，最终检测结果是：1、检测线、质控线均显示红色，表示检测结果为阳性，说明样品中含有猪急性腹泻综合征冠状病毒；2、检测线不显色，质控线显示红色，表示检测结果为阴性，说明样品中不含有猪急性腹泻综合征冠状病毒或者其含量极低；3、质控线不显色，表示检测结果无效，可能试纸失效。

本发明的有益效果为：本发明的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性；受外界因素影响较小，检测灵敏度和准确性高；能稳定保存，携带方便，不需仪器设备，综合成本较低，非常适合临床和基层单位使用。本发明的试纸操作简单易掌控，无需专业人员操作。

附图说明

图1为本发明试纸条的结构示意图；

图2为重组S1蛋白的单克隆抗体特异性抗原抗体反应评价结果示意图；

图3为本发明试纸条特异性检测结果示意图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1制备本发明免疫层析试纸条

1、制备胶体金溶液的制备

称取100ml超纯水至锥形瓶内，加入1.0ml 1％氯金酸溶液至锥形瓶中混匀，加热至沸腾时，迅速加入适量1％柠檬酸三钠，观察溶液颜色变化，待颜色稳定不变后，继续加热5分钟，然后停止加热，将溶液冷却至室温后，置于2～8℃保存。

2、制备胶体金结合垫

(1)SADS-CoV-S1单克隆抗体制备：

以SADS-CoV GDS04毒株S1蛋白(Genbank数据库中下载)为参考，设计常用引物，在引物5′端引入BamHI与XhoI酶切位点。引物合成后，以 SADS-CoV GDS04毒株cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为： PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，P1和P2各1μL，cDNA 1μL，ddH₂O补至50μL。反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。按Omega公司 EZNAGelExtraction Kit的使用说明书进行胶回收。

S1基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoI双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒再进行测序鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-N。

S1重组蛋白的诱导表达与纯化：

将重组质粒pET32a-S1转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5mL 氨苄抗性的LB中，待OD600约为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后5h，12000rpm离心2min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理5min(超3s，停3s)，超声后4℃，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×loadingbuffer，沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE鉴定。

单克隆抗体的制备：

具体操作步骤如下：

1)制备饲养层细胞：将HAT培养液注射小鼠腹腔，慢慢反复抽吸，液体吸出后，铺于96孔板中。

2)细胞融合：将脾细胞和适量的SP20细胞在融合剂PEG作用下进行细胞融合。融合后的细胞铺于含有饲养层细胞的96孔板中。

3)阳性克隆的筛选：

a)间接ELISA检测方法，将纯化的S1蛋白包被ELISA板，检测融合细胞分泌抗体的情况。

b)间接免疫荧光(IFA)检测方法，将ELISA抗体阳性细胞孔中的上清，加入 SADS-CoV感染Huh 7细胞，然后加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，反应完毕后置荧光显微镜下观察结果。

4)阳性杂交瘤细胞的亚克隆：选取ELISA和IFA阳性孔，采用有限稀释法对筛选到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清，利用上述ELISA和IFA方法进行抗体检测。阳性细胞进入下一轮的亚克隆，共进行三次。

5)腹水的制备：取10～12W的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，1W后每只小鼠腹腔注射5×10个杂交瘤细胞(0.2mL)，7～10天后，鼠体腹腔明显***，采集腹水，ELISA检测其效价，分装，-80℃保存。

6)腹水的纯化：按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS-PAGE电泳鉴定纯度；最终获得SADS-CoV-S1单克隆抗体。重组S1蛋白的单克隆抗体特异性抗原抗体反应评价结果示意图参考图 2。

(2)制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)单克隆抗体与胶体金的复合物：

取1ml的胶体金溶液，加入2～10μl的0.1mol/L K₂CO₃溶液混匀，加入5～ 10μgSADS-CoV-S1单克隆抗体混匀15min，再加入50～100μl的10％BSA溶液进行封闭10min，置于冷冻离心机内4℃，10000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用胶体金复溶液复溶至原体积，获得SADS-CoV抗体-胶体金复合物溶液， 2～8℃储存备用；其中使用的胶体金复溶液含有pH8.2的0.02mol/l Tris缓冲液， 0.1％Casein，0.3％～0.5％PVP40，2～5％海藻糖。

(3)喷金

使用三维喷金划膜仪将SADS-CoV-S1单克隆抗体-胶体金复合物溶液喷至结合垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的结合垫置于干燥室(湿度＜30％)干燥 12h后，加入干燥剂封口备用。

3、包被质控线C、检测线T

(1)制备SADS-CoV-S1重组抗原：

该实施例设计仅表达S1亚单位，但在S1亚单位C端连接一段可形成三聚体的多肽片段，使得表达的S1蛋白能够形成三聚体，尽可能模拟S1蛋白天然三聚体构型和保持抗原天然构型。

具体方式为：从Genbank数据库中下载SADS-CoV的S蛋白S1亚单位抗原(19-532氨基酸残基序列组成)，其中529-532位的PLGD氨基酸残基被GSAS 替代，构成的S1亚单位的序列如SEQ ID NO:1所示。

抗原在N端还添加有His标签，His标签是由6个His残基重复序列和其后的GGSGGS连接链序列组成，序列如HHHHHHGGSGGS。

可形成三聚体的多肽片段是由N端的His标签和124个氨基酸残基的多肽组成，其序列如SEQ ID NO:2所示。

同时为了让S蛋白S1亚单位蛋白能定向包被到金表面(如金纳米颗粒或传感器金膜)或塑料表面(如ELISA板)，本发明也设计了在S蛋白S1亚单位抗原C末端添加-Cys氨基酸残基或聚苯乙烯亲和肽(序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示)，最终制备得SADS-CoV-S1重组抗原，使S蛋白S1亚单位抗原在包被到金或聚苯乙烯表面后仍保持正确的抗原结构或活性。

(2)质控线C、检测线T包被液的制备：取SADS-CoV-S1重组抗原蛋白溶液，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取SADS-CoV-S1单克隆抗体，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成0.5～ 1.0mg/ml的检测线T溶液。

(3)划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室(湿度＜30％)干燥12h后，加入干燥剂封口备用。

4、样品垫的预处理

将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室(湿度＜30％) 干燥12h后，加入干燥剂封口备用；所述样品垫预处理液：pH 7-8，Tris-Hcl缓冲液、0.2％-1％吐温20、0.1％-0.5％海藻糖。

5、制备免疫层析检测条

取吸水垫、已处理的样品垫和胶体金结合垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、胶体金结合垫分别加入干燥剂封口备用；取已切割好的吸水垫、样品垫、胶体金结合垫和划过膜的PVC底板，依次粘贴在载体板上表面，将样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，将样品垫部分覆盖于胶体金结合垫边缘的3～5mm处；胶体金结合垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，将胶体金结合垫覆盖于硝酸纤维素膜边缘的1～2mm处；吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，吸水垫覆盖于硝酸纤维素膜边缘的1～2mm处；猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线和质控线依次设在硝酸纤维膜上；胶体金结合垫上喷有猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体与胶体金结合的复合物；在所述检测线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗体，在质控线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原；将组装好的PVC底板切割成3～4mm 的用于检测SADS-CoV抗原的胶体金免疫层析试剂条。制备完成的本发明的试剂条结构如图1所示。

效果例1准确性考察

养猪场收集45例猪SADS-CoV阳性粪便样本(经核酸法确定的SADS-CoV 阳性样本)，和50例健康猪粪便样本，使用本试剂进行检测。检测结果发现： 45例猪SADS-CoV阳性样本均为阳性，50例健康对照样本均为阴性。阳性样本和阴性样本准确率均达到100％，符合试剂盒要求。

效果例2特异性考察

采用本发明试纸条分别检测猪流行性腹泻病毒(Swine Acute DiarrheaSyndrome coronavirus，SADS-CoV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus，PRCV)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)以及近年发现的猪丁型冠状病(porcine deltacoronavirus，PDCoV)样本(经核酸法确认的阳性样本)。检测结果见表1和图3，PEDV、TGEV、PRCV、PHEV 和PDCoV检测结果均为阴性，说明本发明的胶体金试剂特异性良好。

表1特异性考察结果

效果例3重复性考察

采用本发明试剂分别检测45例猪SADS-CoV阳性粪便样本(经核酸法确定的SADS-CoV阳性样本)，和50例健康猪粪便样本，重复检测3次。3次重复检测结果均一致，本发明试剂的重复性良好。

效果例4稳定性考察

将本发明试剂盒37℃下分别放置5天、10天、15天、20天、30天进行加速破坏性试验，然后分别检测5份阳性样本。放置15天的试剂盒检测结果均为阳性，30天后阳性率明显下降。试剂盒的加速稳定性至少有20天，稳定性就好。测试结果见表2。

表2稳定性考察结果

效果例5与核酸检测方法比较

对23例猪场收集的待检样本分别采用核酸检测试剂盒(RT-PCR法)和本发明试剂进行检测。SPSS软件进行卡方检验，检验结果发现(表3)：配对卡方检验(McNemar test)的P值为1.000，一致性检验(kappa test)的Kappa值为 0.913。卡方检验结果说明了本胶体金法与RT-PCR法在临床样本检测上无显著性差异，准确性较好。

表3本发明胶体金法和RT-PCR法的卡方检验结果

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法

<120> 昝洁

<130> 2022-04-14

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Glu Ser Val Asp Phe Asn Leu Phe Asn Thr Ile Phe Ser Thr His Arg

1 5 10 15

Gly Leu Ser Asn Thr Thr Ser Val Ile Thr Gly Ala Tyr Pro Ser Thr

20 25 30

Asn Lys Ser Asp Trp Ser Cys Asn Thr Arg Thr Gly His Leu Ser Gly

35 40 45

Ser Gly Phe Gly Ile Gly Leu Tyr Val Gln Thr Pro Arg Glu Gln Tyr

50 55 60

Gln Tyr Asp Gly Ser Gly Ala Gly Gly Tyr Thr Ile Ala Val Ser Pro

65 70 75 80

Ile His Val Thr Asn Leu Thr Trp Glu Leu Trp Ile His Arg Lys Trp

85 90 95

Gly Val Asn Ser Val Val Thr Val Arg Leu Cys Arg Trp Trp Gln Phe

100 105 110

Met Ser Phe Asn Ser Thr Ser His Ala Ala Asp Ala Gly Pro Thr Asn

115 120 125

Ala Phe Glu Cys Leu Ile Asn Gly Ser Tyr Pro Thr His Arg Asn Thr

130 135 140

Gly Tyr Met Phe Gly Val Thr Trp Tyr Asn Asp Leu Val Arg Ile Val

145 150 155 160

Phe Pro Pro Thr Val Leu Glu Met Gln Leu Asp Gly Leu Gln Trp Glu

165 170 175

Arg Val Gln Phe Asn Ser Pro Val Asn Ala Gly His Ala Thr Arg Phe

180 185 190

Asn Val Val Lys Asp Ile Ser Thr Val Leu Val Glu Thr Asn Ser Gly

195 200 205

Gly Ser Val Phe Arg Tyr Ser Tyr Cys Ala Asp Gly Phe Val Asn Gly

210 215 220

Leu Gln Cys Lys Leu Arg Leu Phe Asp Ile Pro Pro Gly Val Tyr Ser

225 230 235 240

Asn Ser Glu Val Glu Tyr Pro Thr Ala Leu Tyr Thr Val Val His Asn

245 250 255

Met Ser Ala Cys Pro Glu Arg Pro Asp Ser Tyr Cys Gly Ser Asn Ser

260 265 270

Cys Pro Phe Lys Arg Ala Val Phe Ser Asn Cys Ile Val Asn Tyr Thr

275 280 285

Thr Trp Val Asn Pro Asp Gln Arg Asp Phe Gln His Leu Ile Leu Pro

290 295 300

Asn Gly Lys Phe Asn Pro Phe Thr Glu Cys Asn Gly Leu Asn Arg Ile

305 310 315 320

Val Asp Gly Cys Val Pro Gly Phe Val Leu Arg Val Gly Arg Gly Lys

325 330 335

Ala Val Asn Arg Thr Ile Val Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Tyr Glu Cys

340 345 350

Phe Gly Trp Ser Trp Asn Asp Lys Gln Asp Ser Ile Tyr Asp Trp Trp

355 360 365

Ile Ala Asp Phe Val Ser Thr Gly Ala Phe Val Cys Glu Ser Asn Pro

370 375 380

Glu Ala Pro Lys Thr Gly Val Cys Val Thr Tyr Thr Val Glu Lys Val

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Thr Phe Gln Gly Val Leu Tyr Glu Ser Asn Phe Thr Phe Ala Gln Tyr

405 410 415

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Gly Lys Val Tyr Glu Val Ser Ser Cys Phe Glu Ala Ser Tyr Asp Val

435 440 445

Leu Tyr Arg Asn Asn Gln Ser Phe Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Asp

450 455 460

Cys Asn Gln Leu His Ile Lys Ser Ala Arg Phe Val Asp Arg Leu Leu

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Ser

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<211> 519

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

Asp Ala Gly Pro Thr Asn Ala Phe Glu Cys Leu Ile Asn Gly Ser Tyr

130 135 140

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145 150 155 160

Asp Leu Val Arg Ile Val Phe Pro Pro Thr Val Leu Glu Met Gln Leu

165 170 175

Asp Gly Leu Gln Trp Glu Arg Val Gln Phe Asn Ser Pro Val Asn Ala

180 185 190

Gly His Ala Thr Arg Phe Asn Val Val Lys Asp Ile Ser Thr Val Leu

195 200 205

Val Glu Thr Asn Ser Gly Gly Ser Val Phe Arg Tyr Ser Tyr Cys Ala

210 215 220

Asp Gly Phe Val Asn Gly Leu Gln Cys Lys Leu Arg Leu Phe Asp Ile

225 230 235 240

Pro Pro Gly Val Tyr Ser Asn Ser Glu Val Glu Tyr Pro Thr Ala Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Cys Ile Val Asn Tyr Thr Thr Trp Val Asn Pro Asp Gln Arg Asp Phe

290 295 300

Gln His Leu Ile Leu Pro Asn Gly Lys Phe Asn Pro Phe Thr Glu Cys

305 310 315 320

Asn Gly Leu Asn Arg Ile Val Asp Gly Cys Val Pro Gly Phe Val Leu

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

Ser Ile Tyr Asp Trp Trp Ile Ala Asp Phe Val Ser Thr Gly Ala Phe

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420 425 430

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515

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<213> 人工合成

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1 5 10 15

Phe Asn Leu Phe Asn Thr Ile Phe Ser Thr His Arg Gly Leu Ser Asn

20 25 30

Thr Thr Ser Val Ile Thr Gly Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Lys Ser Asp

35 40 45

Trp Ser Cys Asn Thr Arg Thr Gly His Leu Ser Gly Ser Gly Phe Gly

50 55 60

Ile Gly Leu Tyr Val Gln Thr Pro Arg Glu Gln Tyr Gln Tyr Asp Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ala Gly Gly Tyr Thr Ile Ala Val Ser Pro Ile His Val Thr

85 90 95

Asn Leu Thr Trp Glu Leu Trp Ile His Arg Lys Trp Gly Val Asn Ser

100 105 110

Val Val Thr Val Arg Leu Cys Arg Trp Trp Gln Phe Met Ser Phe Asn

115 120 125

Ser Thr Ser His Ala Ala Asp Ala Gly Pro Thr Asn Ala Phe Glu Cys

130 135 140

Leu Ile Asn Gly Ser Tyr Pro Thr His Arg Asn Thr Gly Tyr Met Phe

145 150 155 160

Gly Val Thr Trp Tyr Asn Asp Leu Val Arg Ile Val Phe Pro Pro Thr

165 170 175

Val Leu Glu Met Gln Leu Asp Gly Leu Gln Trp Glu Arg Val Gln Phe

180 185 190

Asn Ser Pro Val Asn Ala Gly His Ala Thr Arg Phe Asn Val Val Lys

195 200 205

Asp Ile Ser Thr Val Leu Val Glu Thr Asn Ser Gly Gly Ser Val Phe

210 215 220

Arg Tyr Ser Tyr Cys Ala Asp Gly Phe Val Asn Gly Leu Gln Cys Lys

225 230 235 240

Leu Arg Leu Phe Asp Ile Pro Pro Gly Val Tyr Ser Asn Ser Glu Val

245 250 255

Glu Tyr Pro Thr Ala Leu Tyr Thr Val Val His Asn Met Ser Ala Cys

260 265 270

Pro Glu Arg Pro Asp Ser Tyr Cys Gly Ser Asn Ser Cys Pro Phe Lys

275 280 285

Arg Ala Val Phe Ser Asn Cys Ile Val Asn Tyr Thr Thr Trp Val Asn

290 295 300

Pro Asp Gln Arg Asp Phe Gln His Leu Ile Leu Pro Asn Gly Lys Phe

305 310 315 320

Asn Pro Phe Thr Glu Cys Asn Gly Leu Asn Arg Ile Val Asp Gly Cys

325 330 335

Val Pro Gly Phe Val Leu Arg Val Gly Arg Gly Lys Ala Val Asn Arg

340 345 350

Thr Ile Val Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Tyr Glu Cys Phe Gly Trp Ser

355 360 365

Trp Asn Asp Lys Gln Asp Ser Ile Tyr Asp Trp Trp Ile Ala Asp Phe

370 375 380

Val Ser Thr Gly Ala Phe Val Cys Glu Ser Asn Pro Glu Ala Pro Lys

385 390 395 400

Thr Gly Val Cys Val Thr Tyr Thr Val Glu Lys Val Thr Phe Gln Gly

405 410 415

Val Leu Tyr Glu Ser Asn Phe Thr Phe Ala Gln Tyr Tyr Asn Leu Leu

420 425 430

Tyr Val Gly Ser Gln Leu Arg Tyr Val Arg Ile Leu Gly Lys Val Tyr

435 440 445

Glu Val Ser Ser Cys Phe Glu Ala Ser Tyr Asp Val Leu Tyr Arg Asn

450 455 460

Asn Gln Ser Phe Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Asp Cys Asn Gln Leu

465 470 475 480

His Ile Lys Ser Ala Arg Phe Val Asp Arg Leu Leu Pro Ser His Asn

485 490 495

Gly Thr Ala Thr Val Leu Gly Cys Leu Phe Asn Ala Ser Tyr Ala Pro

500 505 510

Asn Asp Thr Met Val Asn Cys Thr Asn Gly Ser Ala Ser Val Ser Ile

515 520 525

Lys Lys Ser Ser Gly Leu Asn Phe Asp Asn Thr Ala Ile Ala Ile Asn

530 535 540

Ala Gly Lys Gly Leu Glu Phe Asp Thr Asn Thr Ser Glu Ser Pro Asp

545 550 555 560

Ile Asn Pro Ile Lys Thr Lys Ile Gly Ser Gly Ile Asp Tyr Asn Glu

565 570 575

Asn Gly Ala Met Ile Thr Lys Leu Gly Ala Gly Leu Ser Phe Asp Asn

580 585 590

Ser Gly Ala Ile Thr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro

595 600 605

Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu

610 615 620

Ser Thr Phe Leu Cys

625

<210> 4

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ser Val Asp

1 5 10 15

Phe Asn Leu Phe Asn Thr Ile Phe Ser Thr His Arg Gly Leu Ser Asn

20 25 30

Thr Thr Ser Val Ile Thr Gly Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Lys Ser Asp

35 40 45

Trp Ser Cys Asn Thr Arg Thr Gly His Leu Ser Gly Ser Gly Phe Gly

50 55 60

Ile Gly Leu Tyr Val Gln Thr Pro Arg Glu Gln Tyr Gln Tyr Asp Gly

65 70 75 80

Ser Gly Ala Gly Gly Tyr Thr Ile Ala Val Ser Pro Ile His Val Thr

85 90 95

Asn Leu Thr Trp Glu Leu Trp Ile His Arg Lys Trp Gly Val Asn Ser

100 105 110

Val Val Thr Val Arg Leu Cys Arg Trp Trp Gln Phe Met Ser Phe Asn

115 120 125

Ser Thr Ser His Ala Ala Asp Ala Gly Pro Thr Asn Ala Phe Glu Cys

130 135 140

Leu Ile Asn Gly Ser Tyr Pro Thr His Arg Asn Thr Gly Tyr Met Phe

145 150 155 160

Gly Val Thr Trp Tyr Asn Asp Leu Val Arg Ile Val Phe Pro Pro Thr

165 170 175

Val Leu Glu Met Gln Leu Asp Gly Leu Gln Trp Glu Arg Val Gln Phe

180 185 190

Asn Ser Pro Val Asn Ala Gly His Ala Thr Arg Phe Asn Val Val Lys

195 200 205

Asp Ile Ser Thr Val Leu Val Glu Thr Asn Ser Gly Gly Ser Val Phe

210 215 220

Arg Tyr Ser Tyr Cys Ala Asp Gly Phe Val Asn Gly Leu Gln Cys Lys

225 230 235 240

Leu Arg Leu Phe Asp Ile Pro Pro Gly Val Tyr Ser Asn Ser Glu Val

245 250 255

Glu Tyr Pro Thr Ala Leu Tyr Thr Val Val His Asn Met Ser Ala Cys

260 265 270

Pro Glu Arg Pro Asp Ser Tyr Cys Gly Ser Asn Ser Cys Pro Phe Lys

275 280 285

Arg Ala Val Phe Ser Asn Cys Ile Val Asn Tyr Thr Thr Trp Val Asn

290 295 300

Pro Asp Gln Arg Asp Phe Gln His Leu Ile Leu Pro Asn Gly Lys Phe

305 310 315 320

Asn Pro Phe Thr Glu Cys Asn Gly Leu Asn Arg Ile Val Asp Gly Cys

325 330 335

Val Pro Gly Phe Val Leu Arg Val Gly Arg Gly Lys Ala Val Asn Arg

340 345 350

Thr Ile Val Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Tyr Glu Cys Phe Gly Trp Ser

355 360 365

Trp Asn Asp Lys Gln Asp Ser Ile Tyr Asp Trp Trp Ile Ala Asp Phe

370 375 380

Val Ser Thr Gly Ala Phe Val Cys Glu Ser Asn Pro Glu Ala Pro Lys

385 390 395 400

Thr Gly Val Cys Val Thr Tyr Thr Val Glu Lys Val Thr Phe Gln Gly

405 410 415

Val Leu Tyr Glu Ser Asn Phe Thr Phe Ala Gln Tyr Tyr Asn Leu Leu

420 425 430

Tyr Val Gly Ser Gln Leu Arg Tyr Val Arg Ile Leu Gly Lys Val Tyr

435 440 445

Glu Val Ser Ser Cys Phe Glu Ala Ser Tyr Asp Val Leu Tyr Arg Asn

450 455 460

Asn Gln Ser Phe Gly Leu Leu Tyr Arg Ser Phe Asp Cys Asn Gln Leu

465 470 475 480

His Ile Lys Ser Ala Arg Phe Val Asp Arg Leu Leu Pro Ser His Asn

485 490 495

Gly Thr Ala Thr Val Leu Gly Cys Leu Phe Asn Ala Ser Tyr Ala Pro

500 505 510

Asn Asp Thr Met Val Asn Cys Thr Asn Gly Ser Ala Ser Val Ser Ile

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530 535 540

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565 570 575

Asn Gly Ala Met Ile Thr Lys Leu Gly Ala Gly Leu Ser Phe Asp Asn

580 585 590

Ser Gly Ala Ile Thr Ile Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro

595 600 605

Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu

610 615 620

Ser Thr Phe Leu Trp Val Arg Trp Gly Arg Val Trp Gly Ala Ala Asp

625 630 635 640

Gly Ala Ser Ala Trp Val Arg Trp Gly Arg Val Trp Gly

645 650

Claims

1.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，其特征在于，所述试纸条上设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、质控线和吸水垫；样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线和质控线依次设在硝酸纤维膜上；胶体金结合垫上喷有猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体与胶体金结合的复合物；在所述检测线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗体，在质控线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述载体板可采用PVC板。

3.一种制备如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1制备猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码猪急性腹泻综合征冠状病毒S1糖蛋白亚单位的DNA，并***大肠杆菌中使其表达，再经蛋白纯化技术，获得猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原，记为：SADS-CoV-S1。

S2制备胶体金溶液：取1.0ml的1％氯金酸溶液加入到100mL去离子双蒸水中，得到浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液2mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中2～8℃保存备用；

S4在硝酸纤维膜上制备质控线C和检测线T：将步骤S1制备的抗原溶液稀释至1.0～2.0mg/ml的质控线溶液；将SADS-CoV-S1单克隆抗体溶液稀释成0.5～1.0mg/ml的检测线溶液；通过喷金划膜仪将所述质控线溶液与所述检测线溶液分别喷至硝酸纤维膜上质控线与检测线的位置，二者之间间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室干燥后，备用；

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中胶体金与SADS-CoV-S1单克隆抗体复合物溶液的制备方法如下：在1ml胶体金溶液中加入2～10μl的0.1mol/L K₂CO₃溶液混匀，加入5～10μg SADS-CoV-S1单克隆抗体混匀之后，再加入50～100μl的10％BSA溶液进行封闭，置于冷冻离心机内离心，弃上清液，取沉淀用胶体金复溶液复溶，获得胶体金与SADS-CoV-S1抗体复合物溶液。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述使用的胶体金溶液还包含pH8.2的0.02mol/l Tris缓冲液，0.1％Casein，0.3％～0.5％聚乙烯吡咯烷酮，2～5％海藻糖。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的稀释液为pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5样品垫预处理液为：pH7～8，含有质量浓度为0.2-1％的吐温-20和0.1-0.5％的海藻糖的Tris-Hcl缓冲液。