CN108982875A - 硒蛋白p胶体金检测卡的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硒蛋白P胶体金检测卡的制备与应用。本发明公开的硒蛋白P胶体金检测卡，包括相互连接的连接垫、吸收垫和具有相互分离的检测线和质控线的包被膜，包被膜位于所述连接垫和连接垫之间，连接垫上负载有胶体金标记SePm抗体；检测线包被有SePm抗体，质检线包被有作为抗原的SePm蛋白；胶体金标记SePm抗体为利用胶体金修饰SePm抗体得到的复合物；SePm抗体为利用SePm蛋白作为抗原得到的单克隆抗体或多克隆抗体；SePm蛋白为氨基酸序列是序列2的蛋白质。实验证明，本发明的硒蛋白P胶体金检测卡可以用来检测硒蛋白P，进一步可以用来评价人体是否缺硒。

Description

硒蛋白P胶体金检测卡的制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，硒蛋白P胶体金检测卡的制备与应用。

背景技术

硒(Selenium,Se)是哺乳动物必需的微量元素之一。硒有多种生理功能，缺硒会导致多种病理状态，如：肝坏死、心肌病、心血管疾病的发病危险度增高、艾滋病人的死亡率增高等，流行病学调查表明，补硒可以降低癌症的发病率。著名的长寿无癌村广西巴马，当地水和土壤硒含量高于其他地区十倍。中国是一个2/3地区缺硒的国家，许多人处于缺硒状态，因此科学补硒可以提高人的健康状况。

硒是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生理功能的。硒蛋白是一类特殊的蛋白质，其特征是蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine,SeCys)的形式存在。SeCys大多位于蛋白的活性中心，对蛋白的结构和功能起重要的作用。SeCys由一个特殊的密码子——位于开放读码框(ORF)内的UGA密码子来编码(在一般蛋白质中UGA作为终止密码子起作用)，在翻译的同时掺入到正在合成的多肽链中，故现在把SeCys看作是组成蛋白质的第21种氨基酸。

迄今，在哺乳动物中已发现25种硒蛋白，包括4种谷胱甘肽过氧化物酶、3种脱碘酶、硫氧还蛋白还原酶等和其他功能未知的硒蛋白，如硒蛋白P、硒蛋白W、15kDa硒蛋白等。

硒蛋白P(Selenoprotein P，SelP)最初是在1977年被Herrman在大鼠血浆中发现，以后Burk和Tappel也证实了此蛋白，因为是在血浆中发现的硒蛋白，就以血浆英文第一字母P命名，Selenoprotein P，SelP这个名称一直被大家所接受。

硒蛋白P在血浆中含量很低，因此纯化分离很困难。经过多次失败后，1987年我国学者杨建国终于在美国Burk的实验室采用免疫亲和层析技术，世界上首次分离纯化了大鼠血浆硒蛋白P。以后又研究了该蛋白的部分生化特性，进一步研发和克隆了大鼠和人的硒蛋白P的基因。

硒蛋白P在组织中广泛分布。SelP在结构上与别的硒蛋白不同，一般硒蛋白仅含一个SeCys，而SelP含有至少10个SeCys(人、小鼠、大鼠有10个、牛有12个、石斑鱼有17个)。人硒蛋白P(HSelP)cDNA全长2048bp，编码381个氨基酸，含10个读码框内TGA，编码10个硒半胱氨酸，3’非翻译区保守，有两个SECIS(Selenocysteine insertion sequence)，是合成HSelP必不可少的结构，可指导多个硒代半胱氨酸掺入。一般硒蛋白仅有一个SECIS，而SelP有2个SECIS，并且其指导SeCys掺入作用是所有硒蛋白中最强的。另外，硒蛋白P含有多个组氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸，组成两个组氨酸富集区，有结合肝素的特性并且可利用此区的特性进行蛋白纯化。人血液中60％的硒存在于硒蛋白P中，其余为谷胱甘肽过氧化物酶及其他硒蛋白。

HSelP含有的10个SeCys，其中第一个SeCys位于N端的第40位，其余9个位于C端的1/3。HSelP在血浆中天然存在两个亚型，一种为全长的硒蛋白P，一种为硒蛋白P较短亚型，即在第2个SeCys/UGA处蛋白合成提前终止。两种亚型的N端相同，C端不同。含有多达10个SeCys的人硒蛋白P的重组表达十分困难，而SelP从血浆中的纯化步骤繁琐，收率较低，保持活性困难，因为难以获得大量的蛋白，自从70年代发现SelP以来，其特性和功能至今仍不清楚。

文献报道，使人血硒含量达到饱和时，谷胱甘肽过氧化物酶需要服用硒元素35微克/天，而血硒蛋白P则需要服用49微克/天。因此，科学家已经公认硒蛋白P可以做为人体硒状态的指标。评价人体是否缺硒，测定硒蛋白P含量即可。为此，目前需要一种快速检测硒蛋白P含量的方法和工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测硒蛋白P及硒含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种硒蛋白P的免疫检测产品，所述产品包括相互连接的连接垫、吸收垫和具有相互分离的检测线和质控线的包被膜，所述包被膜位于所述连接垫和所述吸收垫之间，其特征在于：所述连接垫上负载有胶体金标记SePm抗体；所述检测线包被有SePm抗体，所述质检线包被有作为抗原的SePm蛋白；

所述胶体金标记SePm抗体为利用胶体金修饰SePm抗体得到的复合物；

所述SePm抗体为利用所述SePm蛋白作为抗原得到的单克隆抗体或多克隆抗体；

所述SePm蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述单克隆抗体为杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞为将所述SePm蛋白免疫动物后得到的免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到的细胞；

所述多克隆抗体为利用所述SePm蛋白免疫所述动物得到的多克隆抗体。

所述SePm抗体可特异识别所述SePm蛋白。

上述产品中，所述包被膜可为具有相互分离的所示检测线和所述质控线的硝酸纤维素膜。

上述产品中，所述检测线的条数可为1-5条。

所述产品还可含有样品垫，所述样品垫位于所述连接垫的非包被膜一侧并与所述连接垫相连。

上述产品中，所述检测线上所述SePm抗体的包被量可为2μg/cm。

所述质检线上所述SePm抗原的包被量可为0.2μg/cm。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的SePm蛋白，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的SePm蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的SePm蛋白的编码基因可通过将序列1的第8-1111位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1的第8-1111位所示的DNA分子编码序列2所示的SePm蛋白。

上述产品中，所述SePm蛋白的制备方法可包括：将所述SePm蛋白的编码基因导入微生物中，得到重组微生物，使所述重组微生物中所述SePm蛋白的编码基因表达，得到所述SePm蛋白。

上述产品中，所述SePm蛋白的编码基因可为b1)、b2)、b3)或b4)：

b1)序列表中序列1的第8-1111位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码序列为序列表中序列1的第8-1111位的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SePm蛋白的cDNA分子或DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SePm蛋白的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述编码基因可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SePm蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SePm蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SePm蛋白且具有SePm蛋白功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码SePm蛋白质的核酸分子的表达盒(SePm基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SePm蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SePm基因转录的启动子，还可包括终止SePm基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述重组微生物可为将pET-SePm导入所述微生物中得到的重组微生物，所述pET-SePm为将序列表中序列1的第8-1111位所示的DNA分子导入pET-30aSETB载体的多克隆位点间得到的能表达所述SePm或所述SePm与其他多肽形成的融合蛋白的重组载体。

上述产品中，所述胶体金标记SePm抗体的制备方法可包括：将胶体金与所述SePm抗体进行反应得到所述胶体金标记SePm抗体。

所述胶体金与所述SePm抗体的配比可为10ng所述胶体金：1μg所述SePm抗体。

所述胶体金的直径可为15-40nm。

上述产品中，所述动物可为1)、2)或3)：

1)哺乳动物；

2)家兔；

3)小鼠。

所述SePm蛋白、所述SePm蛋白的编码基因、所述SePm抗体或所述杂交瘤细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了检测或辅助检测硒蛋白P的方法，所述方法包括：将待测样品加至所述产品的样品垫上，根据所述产品的检测线是否呈现红色确定待测样品是否含有硒蛋白P：如所述产品的检测线与质检线均呈红色，所述待测样品含有或候选含有硒蛋白P；如所述产品的检测线不呈红色，质检线呈红色，所述待测样品不含有或候选不含有硒蛋白P；如所述产品的检测线和质检线均不呈红色，所述产品失效，所述待测样品是否含有硒蛋白P未知。

本发明还提供了下述X1或X2：

X1、所述SePm蛋白、所述SePm蛋白的编码基因、所述SePm抗体、所述杂交瘤细胞或所述产品在下述X1a-X1f中任一种中的应用：

X1a、制备检测或辅助检测硒蛋白P产品；

X1b、检测或辅助检测硒蛋白P；

X1c、制备检测或辅助检测硒产品；

X1d、检测或辅助检测硒；

X1e、制备评价人体是否缺硒产品；

X1f、评价人体是否缺硒；

X2、所述检测或辅助检测硒蛋白P的方法在上述X1d或X1f中的应用。

实验证明，本发明的硒蛋白P的免疫检测产品可以用来检测硒蛋白P，进一步可以用来评价人体是否缺硒。

附图说明

图1为SePm融合蛋白表达纯化后的电泳图。其中，泳道1-泳道4为不同上样量的纯化后的SePm融合蛋白。

图2为点杂交检测SePm多抗的灵敏度。其中，1表示SePm融合蛋白的浓度为200μg/ml，2表示SePm融合蛋白的浓度为20μg/ml，3表示SePm融合蛋白的浓度为2μg/ml，4表示SePm融合蛋白的浓度为200ng/ml，5表示SePm融合蛋白的浓度为20ng/ml。图3为利用SePm检测肝癌细胞系HepG2中硒蛋白P。其中1和2均为肝癌细胞系HepG2无血清培养24小时后收集的培养液上清。

图4为SePm单抗灵敏度的检测结果。1:200ng/mL；2:20ng/mL；3:2ng/mL；4:0.2ng/mL。

图5为SePm单抗特异性的检测结果。M为蛋白质分子量标准，1、2和3均为正常人血清；4为SePm融合蛋白。

图6为硒蛋白P胶体金检测卡示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、SePm及其抗体的制备

根据Genbank的人硒蛋白P基因序列(NM_005410序列)，将硒代半胱氨酸密码子TGA突变为半胱氨酸密码子TGT(或TGC)，结合大肠杆菌基因密码子偏爱特点(密码子使用频率)，对密码子进行优化，得到人硒蛋白P突变蛋白质(将其命名为SePm)的编码基因，SePm编码基因的序列如序列表中序列1的第8-1111位所示，编码序列表中序列2所示的SePm。

一、SePm的制备

人工合成序列1所示的DNA分子，序列1的第2-7位为NheI的识别序列，第1112-1117位为XhoI的识别序列。利用NheI和XhoI对序列1所示的DNA分子双酶切，得到目的基因片段；利用NheI和XhoI对pET-30aSETB载体(即pET-30b(+)，NOVAGEN公司)双酶切，得到载体骨架。连接目的基因片段与载体骨架，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-SePm，pET-SePm能表达SePm融合His标签的融合蛋白质(以下简称SePm融合蛋白)。

将pET-SePm导入大肠杆菌JM109(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为ZH2Y-SePm，ZH2Y-SePm能表达SePm融合蛋白。将pET-30aSETB载体导入大肠杆菌JM109(DE3)，得到对照菌株。

制备SePm融合蛋白：

1、将ZH2Y-SePm菌株接种到含有50μg/ml的硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃和200rpm摇床中培养12h。

2、步骤1完成后在菌液中加IPTG至其终浓度为1mM诱导蛋白表达，蛋白诱导表达5小时后，将得到的菌液从摇床中取出，离心收集细菌，得到细菌沉淀。

3、在细菌沉淀中加入细菌裂解液后，超声破碎细菌细胞，再离心取上清液。

4、将步骤3的上清液过镍柱(HiTrap Chelating预装柱)进行纯化。对洗脱的目的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定，结果如图1所示。

将ZH2Y-SePm菌株进行摇甁培养并进行SePm融合蛋白表达纯化，得到纯化后的SePm融合蛋白，纯化后的SePm融合蛋白产量约为10-30mg/L菌液。

图1表明，本方法可以获得具有可溶性、高产量的SePm融合蛋白。

将对照菌株进行上述实验，无目的条带出现。

二、SePm多抗的制备

将步骤一的SePm融合蛋白溶于PBS中得到SePm融合蛋白浓度为2mg/ml的SePm融合蛋白溶液。利用步骤一的SePm融合蛋白作为免疫原免疫兔(济南金丰实验动物有限公司,新西兰兔)，散多点皮内注射。每4周后加强一次免疫。初次免疫用弗氏完全佐剂(completefreund's adjuvant,CFA)与SePm融合蛋白溶液等体积混合后免疫兔，SePm融合蛋白的用量为100微克；之后每次免疫多点皮下注射。3个月后心包穿刺取血，4℃放置过夜。次日，吸出淡黄色抗血清，将抗血清2000rpm下离心10分钟，去除血凝块，获得SePm蛋白的兔抗人多克隆抗体(以下简称SePm多抗)。

将SePm融合蛋白作为抗原利用SePm多抗进行检测，实验结果证实SePm多抗可以识别SePm融合蛋白，且可以识别到浓度为20ng/ml的SePm融合蛋白(图2)。

利用SePm多抗检测肝癌细胞系HepG2的硒蛋白P，结果表明，SePm多抗能识别肝癌细胞系HepG2的硒蛋白P(图3)。

三、SePm单抗的制备

利用步骤一的SePm融合蛋白作为免疫原免疫小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司,BALB/c,9-12周龄)制备SePm单克隆抗体(即SePm单抗)，具体方法如下：

1.小鼠免疫：用SePm融合蛋白为抗原免疫小鼠，免疫采用腹腔注射法，首次免疫取100微升SePm融合蛋白(2mg/ml)，加入100微升生理盐水,再加等量弗氏完全佐剂，充分乳化后腹腔注射，每只注射体积为50微升，2周后进行二次免疫，采用弗氏不完全佐剂，与抗原混合乳化，免疫途径和剂量同第一次，第二次免疫后第14天采血进行点杂交检测。同时采用二次免疫方法加强免疫一次，间隔2周后取血测抗体。

2.细胞融合：取加强免疫后血清效价高于104的小鼠,处死,于超净工作台内无菌取出脾脏,研磨后进行细胞计数,将脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8:1比例混匀后离心,在37℃水浴中将预温的800微升50％PEG4000于60秒内逐滴加入有细胞的离心管中,边加边轻微摇动，加完后于37℃水浴静置作用90秒后，加入RPMI1640培养液以终止反应，然后以1000R/每分钟,(离心半径9CM)离心7分钟,去上清,用HAT选择培养液重悬细胞，按100微升/孔加到已加有饲养细胞层(杂交瘤方法)的96孔微孔板内，将培养板置于5％CO₂培养箱中37度下培养。

3.阳性克隆的筛选和阳性细胞的单克隆化：融合后的第1、7天用半量换液的方式更换培养液，融合10天后,分别检测融合细胞上清液抗体水平，筛选抗体阳性孔，二天后再进行复检，利用有限稀释法进行第一次单克隆化,然后再进行第二次和第三次亚克隆，对单克隆化获得细胞扩大培养后,将细胞株放入5毫升离心管内-80度保存。

4.单抗腹水的制备和纯化：取12周龄BALB雌鼠于腹腔注射石蜡油0.5毫升每只,一周后将对数生长期的杂交瘤细胞(1-4)×10 ⁵个/毫升注入小鼠腹腔，以后采集腹水,用辛酸法对腹水单抗纯化，得到SePm单抗。

5.单抗灵敏度的测定:

采用纤维素膜上抗原梯度稀释点杂交方法,测定单抗的灵敏度：将SePm抗原(SePm融合蛋白)进行梯度稀释，最低稀释到0.2ng/mL,SePm单抗能检测到各种浓度的SePm抗原(图4),说明SePm单抗灵敏度高，已经达到国家检测要求。

6.单抗特异性的测定

采用western-blot的方法,测定SePm单抗的特异性，所用样本为纯化的SePm融合蛋白、正常人(不缺硒个体)血清(3个血清样品),结果显示SePm单抗可以特异识别天然硒蛋白P，特异性好(图5)。

实施例2、硒蛋白P胶体金检测卡的制备与应用

分别利用实施例1制备的SePm单抗和SePm多抗作为SePm抗体制备硒蛋白P胶体金检测卡，具体操作步骤如下：

一、胶体金标记硒蛋白P抗体

取直径为40nm的胶体金与SePm单抗在pH 7.2的缓冲液中通过搅拌使其结合，胶体金与SePm单抗的配比为10ng胶体金：1μg SePm单抗。所用缓冲液为10mM Tris缓冲液。采用高速离心法除去未结合的SePm单抗。在离心管底部深红色沉淀即为胶体金标记的SePm抗体复合物(胶体金-SePm抗体复合物)。

二、胶体金-SePm抗体复合物喷涂金垫

将步骤一得到的沉淀用胶体金缓冲液(10mM Tris缓冲液)重悬，得到复合物悬液，将复合物悬液喷涂于金垫上，真空干燥，金垫上复合物悬液的用量为2μl/cm，得到喷涂有胶体金-SePm抗体复合物的金垫。

三、免疫层析膜的划线

以SePm抗体作为硝酸纤维素膜上的检测线(T线)包被抗体，以SePm融合蛋白(SePm抗原)作为硝酸纤维素膜上的质控线(C线)包被物，具体方法如下：

将SePm抗体溶液(溶剂为PBS，溶质为SePm抗体，SePm抗体的浓度为2.0mg/ml)利用喷涂的方法于硝酸纤维素膜上划线(T线，检测线)，SePm抗体溶液用量为1.0μl/cm。将SePm抗原溶液(溶剂为PBS，溶质为SePm融合蛋白，SePm融合蛋白浓度为0.2mg/ml)喷涂的方法于硝酸纤维素膜上划线(C线，质检线)，SePm抗原溶液用量为1.0μl/cm。然后将含有检测线和质检线的硝酸纤维素膜于相对湿度为10％以下的干燥条件下进行抽湿4小时后，得到免疫层析膜，干燥密封保存待用。

四、检测卡的制备

以塑料聚乙烯板作为支撑体(底板)，组装硒蛋白P胶体金检测卡，按照待测样品的流动方向检测卡的各部分为：由3-5层滤纸组成的样品垫、由二层玻璃纤维层中间夹一层喷涂有胶体金-SePm抗体复合物的玻璃纤维层(连接垫)、免疫层析膜、吸收垫(图6)，连接垫与样品垫均与免疫层析膜重叠3mm，连接垫与检测线紧邻但不重叠，样品垫与连接垫重叠3mm，吸收垫与免疫层析膜重叠3mm，吸收垫与质检线紧邻但不重叠。将其裁成5mm宽的条状，得到硒蛋白P胶体金检测卡，将检测线处为SePm单抗的检测卡命名为硒蛋白P胶体金检测卡A，将检测线处为SePm多抗的检测卡命名为硒蛋白P胶体金检测卡B，4℃密封干燥保存备用。

硒蛋白P胶体金检测卡的预期反应结果：

当待检样品沿着检测卡通过毛细作用由样品垫处水平向前泳动时，如果被检样品中含有硒蛋白P，硒蛋白P首先与胶体金-SePm抗体复合物上的SePm抗体结合，形成抗原抗体复合物，该复合物继续流动，抗原抗体复合物中的抗原(硒蛋白P)被此处预先包被的SePm的抗体捕获并截留下来，随着红色复合物截留量增多，逐渐形成一条红线，没有被捕获的抗原抗体复合物继续向前流动，复合物中的抗体在质检线处与质检线上的抗原结合，形成一条红线。如果被检样品中不含硒蛋白P时，胶体金-SePm抗体复合物与固定在质检线上的SePm抗原结合，并在质检线上富集，逐渐形成一条红线，而在检测线处不能形成红线。

在检测待测样品时，在检测线和质检线同时出现红色条带的判为阳性反应，待检样品中含有硒蛋白P；只在质检线出现红色条带的判为阴性反应，待检样品中不含硒蛋白P；如果质检线未出现红色条带，则表明检测卡失效。

五、检测卡的应用

1)尿液样品的检测

选择十个已知含有硒蛋白P的临床尿液样品作为待测样品，分别利用硒蛋白P胶体金检测卡A与硒蛋白P胶体金检测卡B进行检测：分别将尿液样品滴入硒蛋白P胶体金检测卡的样品垫上，5分钟后观察结果，结果显示，有五个临床尿液样品的检测结果为阳性，有五个临床尿液样品的检测结果为阴性，硒蛋白P胶体金检测卡A与硒蛋白P胶体金检测卡B结果一致，且均与临床结果一致，表明两种检测卡均可用于检测尿液中的硒蛋白P，且准确率高。

2)血浆(或血清)样品的检测

选择十个已知含有硒蛋白P的临床血浆样品作为待测样品，分别利用硒蛋白P胶体金检测卡A与硒蛋白P胶体金检测卡B进行检测：每个样品取100微升,滴在硒蛋白P胶体金检测卡的样品垫上，5分钟后观察结果，结果显示，有八个临床血浆样品的检测结果为阳性，有二个临床血浆样品的检测结果为阴性，硒蛋白P胶体金检测卡A与硒蛋白P胶体金检测卡B结果一致，且均与临床结果一致，表明两种检测卡均可用于检测血浆中的硒蛋白P，且准确率高。

以上结果表明，本发明的硒蛋白P胶体金检测卡可以用来检测硒蛋白P。

<110> 张明程、杨建国

<120> 硒蛋白P胶体金检测卡的制备与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctagcggt ggtggtggta ctgaatctca agatcagagc tctctgtgca aacaaccgcc 60

agcatggagc attcgtgacc aagatccgat gctgaactcc aatggttccg taactgtcgt 120

tgcactgctg caggcaagct gttacctgtg cattctgcag gcatccaaac tggaagatct 180

gcgtgtcaaa ctgaagaaag aaggttacag caacatcagc tacattgtgg tcaaccatca 240

gggtatcagc tctcgtctga aatacactca tctgaagaac aaggtgtctg agcacattcc 300

ggtctatcag caagaagaga accagaccga tgtctggact ctgctgaatg gtagcaaaga 360

cgatttcctg atctacgatc gttgtggtcg tctggtatac catctgggtc tgccgttcag 420

ctttctgact ttcccatacg tggaagaagc catcaagatt gcgtactgtg agaagaaatg 480

cggtaactgc tctctgacta ctctgaaaga cgaagacttc tgcaaacgtg taagcctggc 540

tactgttgac aagaccgttg aaactccgtc tccacattac caccatgagc accatcacaa 600

tcatggtcat cagcatctgg gtagctctga actgtctgag aatcagcaac caggtgcacc 660

taatgctccg actcatccag ctcctccagg tctgcatcac catcacaagc acaaaggtca 720

gcatcgtcaa ggtcatccag agaatcgtga tatgcctgca agcgaagatc tgcaagacct 780

gcagaagaaa ctgtgtcgta agcgttgcat caatcaactg ctgtgcaaac tgccgactga 840

tagcgaactg gctccacgta gctgttgctg tcactgtcgt catctgatct tcgagaagac 900

tggttctgca atcacctgtc agtgcaaaga gaacctgcca tctctgtgta gctgccaagg 960

tctgcgtgca gaagagaaca tcactgaatc ctgtcagtgt cgtctgcctc cagctgcatg 1020

ccagatctct cagcaactga ttccgactga agccagcgca tcttgtcgtt gcaagaatca 1080

ggctaagaaa tgcgaatgtc cgtctaacta actcgagg 1118

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Gln Ser Ser Leu Cys Lys Gln

1 5 10 15

Pro Pro Ala Trp Ser Ile Arg Asp Gln Asp Pro Met Leu Asn Ser Asn

20 25 30

Gly Ser Val Thr Val Val Ala Leu Leu Gln Ala Ser Cys Tyr Leu Cys

35 40 45

Ile Leu Gln Ala Ser Lys Leu Glu Asp Leu Arg Val Lys Leu Lys Lys

50 55 60

Glu Gly Tyr Ser Asn Ile Ser Tyr Ile Val Val Asn His Gln Gly Ile

65 70 75 80

Ser Ser Arg Leu Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Ser Glu His

85 90 95

Ile Pro Val Tyr Gln Gln Glu Glu Asn Gln Thr Asp Val Trp Thr Leu

100 105 110

Leu Asn Gly Ser Lys Asp Asp Phe Leu Ile Tyr Asp Arg Cys Gly Arg

115 120 125

Leu Val Tyr His Leu Gly Leu Pro Phe Ser Phe Leu Thr Phe Pro Tyr

130 135 140

Val Glu Glu Ala Ile Lys Ile Ala Tyr Cys Glu Lys Lys Cys Gly Asn

145 150 155 160

Cys Ser Leu Thr Thr Leu Lys Asp Glu Asp Phe Cys Lys Arg Val Ser

165 170 175

Leu Ala Thr Val Asp Lys Thr Val Glu Thr Pro Ser Pro His Tyr His

180 185 190

His Glu His His His Asn His Gly His Gln His Leu Gly Ser Ser Glu

195 200 205

Leu Ser Glu Asn Gln Gln Pro Gly Ala Pro Asn Ala Pro Thr His Pro

210 215 220

Ala Pro Pro Gly Leu His His His His Lys His Lys Gly Gln His Arg

225 230 235 240

Gln Gly His Pro Glu Asn Arg Asp Met Pro Ala Ser Glu Asp Leu Gln

245 250 255

Asp Leu Gln Lys Lys Leu Cys Arg Lys Arg Cys Ile Asn Gln Leu Leu

260 265 270

Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Cys Cys Cys

275 280 285

His Cys Arg His Leu Ile Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala Ile Thr Cys

290 295 300

Gln Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Cys Gln Gly Leu Arg

305 310 315 320

Ala Glu Glu Asn Ile Thr Glu Ser Cys Gln Cys Arg Leu Pro Pro Ala

325 330 335

Ala Cys Gln Ile Ser Gln Gln Leu Ile Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser

340 345 350

Cys Arg Cys Lys Asn Gln Ala Lys Lys Cys Glu Cys Pro Ser Asn

355 360 365

Claims (10)

1.硒蛋白P的免疫检测产品，包括相互连接的连接垫、吸收垫和具有相互分离的检测线和质控线的包被膜，所述包被膜位于所述连接垫和所述吸收垫之间，其特征在于：所述连接垫上负载有胶体金标记SePm抗体；所述检测线包被有SePm抗体，所述质检线包被有作为抗原的SePm蛋白；

所述胶体金标记SePm抗体为利用胶体金修饰SePm抗体得到的复合物；

所述SePm抗体为利用所述SePm蛋白作为抗原得到的单克隆抗体或多克隆抗体；

所述SePm蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述多克隆抗体为利用所述SePm蛋白免疫动物得到的多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于：所述产品还含有样品垫，所述样品垫位于所述连接垫的非包被膜一侧并与所述连接垫相连。

3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：所述检测线上所述SePm抗体的包被量为2μg/cm；

和/或，所述质检线上所述SePm抗原的包被量为0.2μg/cm。

4.根据权利要求1-3中任一所述的产品，其特征在于：所述SePm蛋白的制备方法包括：将所述SePm蛋白的编码基因导入微生物中，得到重组微生物，使所述重组微生物中所述SePm蛋白的编码基因表达，得到所述SePm蛋白。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述SePm蛋白的编码基因为b1)、b2)、b3)或b4)：

b1)序列表中序列1的第8-1111位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码序列为序列表中序列1的第8-1111位的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SePm蛋白的cDNA分子或DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SePm蛋白的cDNA分子或DNA分子。

6.根据权利要求1-5中任一所述的产品，其特征在于：所述胶体金标记SePm抗体的制备方法包括：将胶体金与所述SePm抗体进行反应得到所述胶体金标记SePm抗体。

7.根据权利要求1-6中任一所述的产品，其特征在于：所述动物为1)、2)或3)：

1)哺乳动物；

2)家兔；

3)小鼠。

8.权利要求1-7中任一所述SePm蛋白、所述SePm蛋白的编码基因或所述SePm抗体。

9.检测或辅助检测硒蛋白P的方法，包括：将待测样品加至权利要求2-7中任一所述产品的样品垫上，根据所述产品的检测线是否呈现红色确定待测样品是否含有硒蛋白P：如所述产品的检测线与质检线均呈红色，所述待测样品含有或候选含有硒蛋白P；如所述产品的检测线不呈红色，质检线呈红色，所述待测样品不含有或候选不含有硒蛋白P；如所述产品的检测线和质检线均不呈红色，所述产品失效，所述待测样品是否含有硒蛋白P未知。

10.下述X1或X2：

X1、权利要求1-7中任一所述SePm蛋白、所述SePm蛋白的编码基因、所述SePm抗体或所述产品在下述X1a-X1f中任一种中的应用：

X1a、制备检测或辅助检测硒蛋白P产品；

X1b、检测或辅助检测硒蛋白P；

X1c、制备检测或辅助检测硒产品；

X1d、检测或辅助检测硒；

X1e、制备评价人体是否缺硒产品；

X1f、评价人体是否缺硒；

X2、权利要求9所述方法在上述X1d或X1f中的应用。