CN112724203A - 一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用。本发明筛选出了新的非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位，完成了对p54蛋白N端B细胞表位的鉴定，完善了p54蛋白的抗原表位图谱。本发明筛选出的抗原表位(2DSEFFQPV9)为首次发现，在非洲猪瘟各毒株之间高度保守，对ASFV的血清学检测具有重要意义。该抗原表位肽及由其衍生的具有同等功能的抗原表位肽能够用于制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性抗体、制备检测或鉴定ASFVp54蛋白的试剂，并为研发预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染疫苗奠定了基础。

Description

一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种巨大而复杂的DNA病毒，是非洲猪瘟(ASF)的病原体。ASF是一种在家猪和野猪中高度传染性的出血性疾病，近年来造成了巨大的经济损失。在不同宿主中由病毒的不同毒力引起的临床体征和死亡率各不相同。在家猪和野猪中，由高毒力分离株引起的感染会导致急性形式的ASF，其发病率和死亡率高达100％。中度或低毒性的病毒以亚急性和慢性形式产生较弱的临床体征，但存活时间更长。非洲野猪(疣猪，丛林猪和大森林猪)可以被感染而没有任何临床症状，因此可以充当贮藏库。此外，钝缘蜱属的软壁虱也是ASFV的天然宿主和贮藏库。这些动物被认为是进一步入侵的来源，并在ASFV的快速传播和流通中发挥重要作用。最近在从中国绵羊和牛身上收集的革蜱属的硬壁虱中发现了一种新的ASFV变异株，从而扩大了ASFV的载体和宿主。鉴于这种跨界动物疾病(TAD)的重要性，它已被列入世界动物卫生组织(OIE)陆生动物卫生法典，并且是必须向OIE报告的疾病。
该疾病的爆发给那些受感染的地区带来了沉重负担，并给未受感染的地区构成了威胁。 ASF于1921年首发于非洲肯尼亚。在1957年之前，它仅在撒哈拉以南地区循环。1957年至 1960年，ASF第一次跨洲际蔓延到了欧洲，后来又扩散到了南美和加勒比海地区。由于采取了有效的生物安全措施，90年代中期，大多数受感染地区清除了ASFV。然而，在2007年，一种来自南非的高毒力，Ⅱ型ASFV毒株第二次跨洲际传播到佐治亚州，随后迅速传播到俄罗斯和几个邻国，并继续在这些地区流通。目前，ASF已遍布非洲，亚洲和欧洲的多个国家。值得注意的是，2018年8月3日，我国农业和农村事务部(MARA)确认了中国境内ASF 的首次爆发。其后，在不到两个月的时间内迅速传播到全国多个省份。最近，MARA在云南省又确认了一次新的ASF疫情。随着其在中国的传播，ASF对世界养猪业的危害和威胁也越来越大。
表位是病毒结构蛋白的重要抗原元件，一般为3～20氨基酸序列，在诱导机体体液免疫和细胞免疫反应中发挥重要作用。根据它们各自的受体不同，表位可以分类为B细胞表位和 T细胞表位，同时根据结构不同，表位又分为线性表位和构象表位。表位的研究对于完善病毒蛋白结构及病毒与宿主作用关系的研究意义重大，同时对病毒的检测，表位疫苗的制备提供材料基础，应用价值巨大。
先前的报道表明，p72，p30和p54是感染过程中最具抗原性的三种蛋白质。病毒结构蛋白p54由E183L基因编码，位于病毒包膜的内膜中，代表进行ASF检测和监测的血清学候选物。国内外对于ASFV p54蛋白表位的研究并不是非常完善，Petrovan等人制备了针对杆状病毒表达的p54(60-178)大C端的一组12种小鼠单克隆抗体(mAb)，基于这些单抗采用肽扫描技术对p54蛋白大C端抗原表位进行分析，得到65-75aa，93-113aa，118～127aa三个线性B细胞表位区域；虽然P54蛋白编码序列在不同毒株间具有多态性，但p54的N端在各毒株间相对保守，且含有唯一的半胱氨酸，在病毒形态形成，病毒活力，以及入侵等过程中具有重要作用。然而对于p54蛋白N端的研究鲜有报道。如何获得合适的靶抗原及其表位，研制快速、简便、准确的检测产品，以及研制有效、安全、广谱、新型ASFV表位疫苗或药物一直是本领域技术人员所努力解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽。
本发明的第二个目的是提供上述抗原表位肽的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽，其氨基酸序列为1)或2)：
1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列。
本发明实施例部分通过***性地从两端截短阳性多肽P1建立截短文库确定了表位活性所需的最小表位肽为“2DSEFFQPV9”，而后设计丙氨酸扫描文库以鉴定表位中的关键残基。并利用ELISA方法确定截短肽库和丙氨酸扫描肽库中各肽与非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗的反应性，确定表位“2DSEFFQPV9”的关键氨基酸为6FQPV9。根据以上结论，本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽最小表位活性序列及关键氨基酸的基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得衍生序列；本领域技术人员知晓，基于不同种类氨基酸的物理化学性质以及常规蛋白质工程方法，与丙氨酸结构类似的中性非极性氨基酸，包括甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸也能够用于替代抗原肽中的非关键氨基酸获得衍生序列；而衍生序列仍具备用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的能力。
进一步的，所述在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列为XXXXXFQPVXXXXXX，其中，FQPV为关键氨基酸不能变动，X为任意氨基酸。
优选的，X为中性非极性氨基酸；所述中性非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸。
优选的，2)所述在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，表位为线性表位。
优选的，表位为含Alpha、Beta、Turn、coil结构中的至少一种。
另一方面，本发明提供了上述非洲猪瘟病毒P54蛋白抗原表位肽的应用。
本发明提供了上述抗原表位肽在在制备非洲猪瘟病毒特异性抗体中的应用。
优选的，将上述抗原表位肽与载体蛋白偶联得到的融合蛋白作为免疫原免疫动物。
进一步优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
本发明提供了上述抗原表位肽在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染试剂中的应用。
优选的，所述试剂包含上述的抗原表位肽或与该抗原表位肽特异性结合的抗体。
本发明取得的有益效果：
本发明筛选出了新的非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽，完成了对p54蛋白N端B细胞表位的鉴定，完善了p54蛋白的抗原表位图谱。本发明筛选出的抗原表位(2DSEFFQPV9) 为首次发现，在非洲猪瘟各毒株之间高度保守，对ASFV的血清学检测具有重要意义。该抗原表位肽及由其衍生的具有同等功能的抗原表位肽能够用于后续检测鉴定p54蛋白、研究其功能及在p54蛋白ASFV病毒感染机体中的作用机制提供帮助。
另一方面，本发明提供的上述p54蛋白抗原表位肽能够作为抗原用于制备非洲猪瘟病毒 p54蛋白的特异性抗体，且抗原纯度更高，避免了基因工程表达抗原纯化中菌体杂蛋白的残留所致的非特异性反应，简化了p54蛋白单克隆抗体筛选步骤，有助于p54蛋白结构和功能的研究。试验证明，本发明制备的能够与该抗原表位肽特异性结合的单克隆抗体能够与ASFV HLJ/18毒株发生特异性反应，表明该B细胞表位的单克隆抗体能够用于ASFVp54蛋白特异性检测和鉴定，对非洲猪瘟检测试剂的开发具有重要的参考意义。
附图说明
图1为单抗与ASFV p54蛋白反应的Western-blotting鉴定结果；
图中，M为蛋白Marker；泳道1为p54蛋白表达菌的全细胞裂解液。
图2为单抗与真核表达的p54蛋白(ASFV SY18株)结合能力的IFA法鉴定结果；
图3为p54蛋白p54N29 B细胞表位的间接ELISA鉴定结果图；
图中，P1-P3为覆盖p54蛋白1-29位氨基酸的重叠多肽；NC为SMCC-BSA，作为阴性对照，PC为多肽p54N29，作为阳性对照。
图4为截短肽库确定最小表位图；
其中，A图为N端截短多肽与单抗反应结果，B图为C端截短多肽与单抗反应结果。
图5为p54蛋白p54N29的B细胞表位关键氨基酸序列的鉴定图；
图中，E1为抗原表位2DSEFFQPV9；F5A,F6A,Q7A,P8A,V9A分别为抗原表位2DSEFFQPV9对应位点突变成丙氨酸的多肽，即：2DSEAFQPV9、2DSEFAQPV9、2DSEFFAPV9、2DSEFFQAV9、2DSEFFQPA9。
图6为抗原表位2DSEFFQPV9在不同毒株间的保守性分析结果图。
图中，包括来自NCBI参考数据库中12株经典非洲猪瘟的p54序列和8株中国非洲猪瘟毒株的p54序列。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
1.ASFV p54蛋白N端多肽完全抗原的合成
(1)以中国报道的第一例ASF爆发中的ASFV毒株SY18的p54蛋白序列为参考，通过固相合成多肽技术合成可以模拟p54蛋白N端区域 (1MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFST29)的多肽，命名为p54N29。
(2)多肽偶联载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)或卵清白蛋白(OVA)：利用水溶性的氨基-巯基交联剂Sulfo-SMCC将多肽p54N29分别与BSA和OVA进行偶联，经透析后获得免疫原BSA-p54N29及包被原OVA-p54N29。
2.免疫BALB/c小鼠
首免将免疫原BSA-p54N29中加入弗氏完全佐剂，经乳化后通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，免疫剂量20μg/只；第二次和第三次免疫用弗氏不完全佐剂与免疫原乳化后以相同的方法和剂量进行，免疫间隔为3周；三免后三周，尾静脉采血测定抗体效价，选择效价较高的小鼠于细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是40μg/只。
3.细胞融合及单克隆抗体制备
采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；于融合后10天，以OVA-p54N29作为包被原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞；用WB以及IPMA 鉴定单抗特异性。
4.体内诱生腹水法制备单抗
选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。
5.单抗的鉴定
(1)间接ELISA测定单抗效价：用CBS液将OVA-p54N29稀释成浓度为2μg/mL的包被液包被酶标板，100μl/孔，4℃封闭过夜；第一孔加入用5％的脱脂奶1:1000稀释的单抗(一抗)，2倍稀释至第11孔，依次加入酶标板中，50μl/孔，阳性对照为ASFV猪阳性血清，37℃孵育30min；弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG (二抗)加入反应孔中，50μl/孔。37℃孵育30min；弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；每孔加入现配的TMB显色液100μl，暗室反应15min；每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应；酶标仪读取每孔的OD450值。经检测单克隆抗体效价为1：1.024×106。
(2)亚型鉴定：用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Sigma，Mouse MonoclonalAntibody Isotyping Ki)对单抗的亚型进行鉴定，鉴定结果显示单克隆抗体属于IgG1，轻链型为Kappa 型。
(3)Western-blotting鉴定：单克隆抗体的Western-blotting鉴定：将p54基因(GenBank 登录MH717102)的完整编码序列(CDS)，亚克隆到pET-28a质粒中，构建原核表达载体 pET28a-p54，将重组克隆pET28a-p54转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，用单克隆抗体进行western印迹检测，结果显示单抗可与原核表达的ASFV p54蛋白发生特异性反应(图1)。 (4)IFA鉴定：p54蛋白的瞬时表达选用HEK293T细胞，在转染前一天以5×105个细胞/孔的速度接种到6孔板中。第二天，将融合率为70–80％的pLVX-IRES-ZsGreen1转染给HEK293T细胞，p54基因来自于中国分离的第一株ASF流行株Pig/HLJ/2018，并使用
Figure RE-GDA0002966024890000061
2000(Invitrogen)克隆到EcoRI/BamHI限制位点，美国生命科技公司)构建真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA/ASFV P54。在转染后24小时，用含有1％过氧化氢的甲醇(预冷至-20℃)在室温(RT)下固定15分钟，并用于下一步免疫荧光分析(IFA)，一抗选用上述实施例制备的单克隆抗体用5％的脱脂奶1：1000进行稀释，二抗选用1:500稀释的FITC标记的羊抗鼠。在荧光显微镜下进行观察，结果判定：非洲猪瘟病毒感染的细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞和阴性对照无荧光。结果显示单抗可与ASFV SY18株p54蛋白发生特异性反应(图2)。
实施例2抗原表位关键氨基酸序列的鉴定
1.重叠多肽的设计
采用多肽扫描法设计合成3段多肽，覆盖整个NTD，相邻多肽重叠7个氨基酸。多肽段氨基酸序列如表1所示。
表1
命名 定位 氨基酸序列
P1 1-15aa MDSEFFQPVYPRHYG
P2 9-23aa VYPRHYGECLSPVTT
P3 18-29aa LSPVTTPSFFST
2.间接ELISA筛选能与抗体结合的短肽
用CBS缓冲液稀释多肽，包被酶标板，37℃，2h；PBST洗板2～3次；用5％脱脂奶封闭，37℃，2h；以本发明实施例1获得的单克隆抗体作为一抗进行间接ELISA，37℃孵育1h；洗板后，加入HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)，37℃孵育30min；洗板后加入TMB底物显色液， 5min后终止显色，用酶标仪读数。结果显示筛选到的单克隆抗体可与多肽P1(1MDSEFFQPVYPRHYG15)发生特异性反应(图3)。
3.确定p54蛋白N29的B细胞表位关键氨基酸序列
通过***性地从两端截短阳性多肽P1建立截短文库(表2)，结果如图4所示，其中，A 图为N端截短多肽与单抗反应结果，B图为C端截短多肽与单抗反应结果，由图4可知，表位活性所需的最小表位肽为“2DSEFFQPV9”，在确定了最小的表位肽后，设计丙氨酸扫描文库以鉴定表位中的关键残基(表3)。所有合成肽的纯度等于或大于95％。并利用ELISA方法确定截短肽库和丙氨酸扫描肽库中各肽与单抗的反应性，确定表位“2DSEFFQPV9”的关键氨基酸为6FQPV9(图5)。
表2
命名 氨基酸序列 命名 氨基酸序列
1-15 MDSEFFQPVYPRHYG 1-14 MDSEFFQPVYPRHY
2-15 DSEFFQPVYPRHYG 1-13 MDSEFFQPVYPRH
3-15 SEFFQPVYPRHYG 1-12 MDSEFFQPVYPR
4-15 EFFQPVYPRHYG 1-11 MDSEFFQPVYP
5-15 FFQPVYPRHYG 1-10 MDSEFFQPVY
6-15 FQPVYPRHYG 1-9 MDSEFFQPV
7-15 QPVYPRHYG 1-8 MDSEFFQP
8-15 PVYPRHYG 1-7 MDSEFFQ
9-15 VYPRHYG E1 DSEFFQPV
表3
命名 氨基酸序列 命名 氨基酸序列
E1 <sup>2</sup>DSEFFQPV<sup>9</sup> F5A <sup>2</sup>DSEAFQPV<sup>9</sup>
F6A <sup>2</sup>DSEFAQPV<sup>9</sup> Q7A <sup>2</sup>DSEFFAPV<sup>9</sup>
P8A <sup>2</sup>DSEFFQAV<sup>9</sup> V9A <sup>2</sup>DSEFFQPA<sup>9</sup>
4.分析所得表位在各毒株之间的保守性
为了评估鉴定出的表位在流行毒株中保守性，利用从NCBI参考序列(RefSeq)数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/)中检索到的12种ASFV参考毒株和8种中国流行株，通过在MEGA 6.0中的ClustalW方法对这20个序列进行了比对，并在Jalview中进行了展示，结果发现在这20个毒株中，氨基酸2DSEFFQPV9高度保守(图6)。
实施例3抗原表位肽在在制备非洲猪瘟病毒特异性抗体中的应用
在抗体具体制备过程中，将本发明提供的抗原表位肽与载体蛋白偶联得到的融合蛋白作为免疫原免疫动物，从而获得非洲猪瘟病毒p54蛋白的特异性抗体。所述载体蛋白为BSA(牛血清白蛋白)或卵清白蛋白(OVA)。
实施例4抗原表位肽在在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染试剂中的应用
在具体应用中，所述试剂包含上述的抗原表位肽或与该抗原表位肽特异性结合的抗体。
1.多肽偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)或者卵清白蛋白(OVA)
利用EDC(碳二亚胺)或者EDC与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)联用将多肽和载体欧联：
(1)将载体蛋白BSA溶解在偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.7)，终浓度10mg/ml。
(2)将待偶联多肽溶解在偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.7)，终浓度4mg/ml。
(3)将步骤1)和步骤2)的溶液混合，多肽与载体蛋白摩尔比为10:1。
(4)将EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)试剂(Frdbio)溶解在偶联缓冲液(0.1M MES，pH4.7)中配制成1M EDC溶液。
(5)步骤(3)的混合液在磁力搅拌下，缓慢滴加步骤(4)的EDC溶液(EDC滴加的摩尔量与多肽相同)，置25℃磁力搅拌反应2h。(如果此过程中，产生沉淀应该减少EDC 的用量直到得到可溶性溶液为止。)
(6)透析或凝胶过滤去除未偶联的多肽和EDC试剂，并置换成PBS溶液(0.01M PBS,pH7.4)。(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与EDC可以显著提高偶联效率，如果采用此方案，只需要在步骤5)中加入NHS至终浓度为5mM即可。)
2.非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立
(1)用CBS液将上述OVA欧联多肽稀释成浓度为2μg/mL的包被液包被酶标板，100μl/ 孔，4℃封闭过夜；
(2)样品的前处理方法：用离心方法对待检猪血清样品进行处理(3000rpm，3min)，以除去杂质，取上清用抗体稀释液进行100倍稀释后用于检测。
(3)一抗加入用抗体稀释液1:100稀释的血清样品，50μl/孔，阳性对照为实施例1中的单克隆抗体，阴性对照是非洲猪瘟标准阴性血清，37℃孵育60min；每孔设置三个重复。
(4)弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；
(5)将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)加入反应孔中，50μl/孔，37℃孵育30min；弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；
(6)每孔加入现配的TMB显色液100μl，暗室反应15min；
(7)每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应；
(8)酶标仪读取每孔的OD450值。
(9)结果判定，当检测样品OD值>阴性对照OD值的2.1倍时，判定样品中非洲猪瘟病毒抗体水平为阳性；当检测样品OD值≤阴性对照OD值的2.1倍时，判定样品中非洲猪瘟病毒抗体水平为阴性。
(10)部分已知临床阳性及血清样品检测结果如下表4所示。
表4
Figure RE-GDA0002966024890000091
<110> 郑州大学
<110> 河南中泽生物工程有限公司
<120> 一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽及其应用
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽（E1）
<400> 1
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val
1 5
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> p54N29
<400> 2
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr
20 25
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P1肽
<400> 3
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P2肽
<400> 4
Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr
1 5 10 15
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P3肽
<400> 5
Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-15肽
<400> 6
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 2-15肽
<400> 7
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 3-15肽
<400> 8
Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 4-15肽
<400> 9
Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 5-15肽
<400> 10
Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 6-15肽
<400> 11
Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 7-15肽
<400> 12
Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 8-15肽
<400> 13
Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 9-15肽
<400> 14
Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-14肽
<400> 15
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-13肽
<400> 16
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His
1 5 10
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-12肽
<400> 17
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-11肽
<400> 18
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-10肽
<400> 19
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-9肽
<400> 20
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-8肽
<400> 21
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro
1 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-7肽
<400> 22
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 1-7肽
<400> 23
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> F5A肽
<400> 24
Asp Ser Glu Ala Phe Gln Pro Val
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> F6A肽
<400> 25
Asp Ser Glu Phe Ala Gln Pro Val
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> Q7A肽
<400> 26
Asp Ser Glu Phe Phe Ala Pro Val
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P8A肽
<400> 27
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Ala Val
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> V9A肽
<400> 28
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Ala
1 5

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列为1)或2)：
1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，2)所述在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列为：XXXXXFQPVXXXXXX，其中，FQPV为关键氨基酸不能变动，X为任意氨基酸。
3.根据权利要求2所述的抗原表位肽，其特征在于，X为中性非极性氨基酸；所述中性非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸。
4.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，2)所述在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所衍生的，能够用于制备非洲猪瘟病毒特异性抗体和/或与非洲猪瘟病毒特异性抗体特异性结合的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，表位为线性表位。
6.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，表位为含Alpha、Beta、Turn、coil结构中的至少一种。
7.如权利要求1抗原表位肽在制备非洲猪瘟病毒特异性抗体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的抗原表位肽与载体蛋白偶联得到的融合蛋白作为免疫原免疫动物。
9.如权利要求1抗原表位肽在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒感染试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂包含如权利要求1所述的抗原表位肽或与该抗原表位肽特异性结合的抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114409743A (zh) * 2021-12-27 2022-04-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位及其应用
CN116143888A (zh) * 2022-10-10 2023-05-23 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN116987155A (zh) * 2022-09-15 2023-11-03 河南农业大学 一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554375A (zh) * 2018-12-13 2019-04-02 郑州大学 美洲型prrsv n蛋白抗原表位及其应用
CN110642925A (zh) * 2019-09-29 2020-01-03 中牧实业股份有限公司 非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒
CN110760006A (zh) * 2019-10-31 2020-02-07 河南省生物工程技术研究中心 一种非洲猪瘟免疫***靶向基因工程疫苗
CN110981944A (zh) * 2019-11-11 2020-04-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法
WO2020264312A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Phibro Animal Health Corporation African swine fever vaccine

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554375A (zh) * 2018-12-13 2019-04-02 郑州大学 美洲型prrsv n蛋白抗原表位及其应用
WO2020264312A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 Phibro Animal Health Corporation African swine fever vaccine
CN110642925A (zh) * 2019-09-29 2020-01-03 中牧实业股份有限公司 非洲猪瘟病毒合成肽elisa抗体检测试剂盒
CN110760006A (zh) * 2019-10-31 2020-02-07 河南省生物工程技术研究中心 一种非洲猪瘟免疫***靶向基因工程疫苗
CN110981944A (zh) * 2019-11-11 2020-04-10 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙娟等: "抗原表位鉴定方法的研究进展", 《国外医学(医学地理分册)》 *
汪世华主编: "《抗体技术》", 30 March 2009, 军事医学科学出版社 *
赵宁宁等: "鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋白1(EtMIC1)抗原表位的筛选及其关键氨基酸的鉴定", 《中国动物学会寄生虫学专业委员会第十六次全国学术会议暨第七次国际寄生虫学学术研讨会论文摘要集》 *
郑珩、王非编著: "《药物生物信息学》", 30 April 2004, 化学工业出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114409743A (zh) * 2021-12-27 2022-04-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位及其应用
CN114409743B (zh) * 2021-12-27 2023-09-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位及其应用
CN116987155A (zh) * 2022-09-15 2023-11-03 河南农业大学 一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽及应用
CN116143888A (zh) * 2022-10-10 2023-05-23 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN116143888B (zh) * 2022-10-10 2024-05-14 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用

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