CN114875011B

CN114875011B - Amp磷酸转移酶突变体、其编码基因及在atp合成中的应用

Info

Publication number: CN114875011B
Application number: CN202210500299.1A
Authority: CN
Inventors: 秦浩杰; 任丽梅; 杨梦茜; 张蕴之; 米雅萱; 王素霞; 刘�东; 高文杲
Original assignee: Meibangmeihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Meibangmeihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-05-10
Also published as: CN114875011A

Abstract

本发明公开了一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用。所述突变体的氨基酸序列由SEQ：ID：NO:1所示序列经过一次或多次突变得来。包含其第124位（A124L）、312位（G312M）、393位（F393K）三个突变位点中一个或多个突变位点。本发明还提供了包含腺苷激酶和AMP磷酸转移酶突变体的复合生物催化剂以及其在ATP合成中的应用。本发明突变体酶活性更高、稳定性更高、ATP生成占比更高，固定化后重复批次大于100批，可以进一步降低全酶法生产ATP的成本，且本发明可以降低酶种类低至2种即可完成整体腺苷磷酸化合成ATP反应，有利于大规模工业化应用。

Description

AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用。

背景技术

三磷酸腺苷简称ATP，是一种不稳定的高能化合物，在细胞中与ADP相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。ATP在人体能量代谢中起着重要的作用，作为代谢的中间体、辅酶参与生物体内糖类、蛋白质、核酸和脂肪等的代谢。在临床应用上，对肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。

ATP的合成主要有化学法和生物法，生物法又包括微生物发酵法和生物酶催化法。微生物发酵法是利用酵母菌酶系，以酵母体内酶为催化剂，通过糖酵解、底物水平磷酸化合成ATP。此法虽然生产效果良好，成本低，但存在反应过程复杂，参与催化反应的酶系众多，反应过程不易控制，且产品批次间质量差异较大、分离纯化复杂等问题。

而生物酶催化法是以生物酶为催化剂，与底物直接接触，底物转化率高，生产成本低，生产过程更加高效稳定、容易控制且节能环保。在原料成本方面，除底物和一定量镁盐等无机盐外，发酵法需消耗大量酵母泥、葡萄糖及磷酸盐，而生物酶法则需要添加一定量的磷酸供体和相应的催化酶即可完成。

腺苷激酶(Adenosine kinase，AK)属于核糖激酶家族，催化腺苷磷酸化为AMP，也可以ATP为磷酸供体，进行催化反应，AK是腺苷利用合成途径的第一种酶，因此它在调节细胞内和细胞外腺苷水平方面起着关键作用。AMP磷酸转移酶(AMP phosphotransferase，AMP-PPT)是以多磷酸作为磷酸供体，将AMP磷酸化生成ADP的酶。AMP磷酸转移酶突变体(AMP-PPTM)是在原有菌株基础上利用PCR技术对其基因进行突变，筛选出酶活性、稳定性、生成的ATP占比高的突变体，从而改变原有的功能，兼具AMP磷酸化合成ADP和ADP磷酸化合成ATP双重功能。

酶催化法相比发酵法而言，具有高效稳定、反应体系简单、反应过程容易操作等优点。如2001年，Akihiko MARUYAMA等报道了以腺嘌呤为底物，在产氨基酸菌催化作用下合成ATP，反应28h后ATP生成量为70.6mg/mL，底物转化率为82％。专利CN104762347A提出的一种三磷酸腺苷(ATP)的生产方法。此工艺较为复杂，反应过程不易控制，成本较高，酶系活力下降较快，底物腺苷浓度30g/L反应4.5h，腺苷转化率为95.3％，ATP生成量约为42.5g/L，ATP生成率为89.57％，总收率为81.2％。专利CN110777180A公开的“一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法”，该方法采用三种酶组合进行固定化，腺苷浓度30g/L，反应6h，经分离纯化得三磷酸腺苷干品445g。反应时间相对较长，酶组合种类多且固定化酶量加入量大在一定程度上提高生产成本。专利CN106191170A公开了一种多酶参与的ATP合成工艺。该工艺以腺苷为底物，采用AK酶、Ppk2酶、AK酶、Pap酶四种酶组合反应合成ATP，底物浓度30g/L，反应8小时，腺苷转化率为85％，ATP生成率为87.71％，生成量约为50g/L，总收率为80％。该工艺酶组合由四种酶组成，增加了成本，其次随着酶种类增加副反应也会增加给后期分离纯化带来很大的影响，同时酶种类的增加也会使反应受到一定的抑制，从而出现底物转化不完全等一系列问题。

综上所述，为进一步达到降低生产成本、简化工艺流程、提高底物转化率、提高产品品质且生产工艺环境友好的目的，需研究开发一种活力更好、稳定性更强的催化用酶及更为简单高效的ATP生产新工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用，以解决现有ATP合成技术存在的酶活力低、酶种类多、成本高、工艺控制难等问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(一)AMP-PPTM酶的选择与进化筛选

本发明提供了一种AMP磷酸转移酶突变体，其为下列任一突变体：

突变体1，所述突变体1是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu；

突变体5，所述突变体5是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met；

突变体6，所述突变体6是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala；

突变体7，所述突变体7是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第393位的Phe突变为Lys；

突变体8，所述突变体8是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第177位的Gly突变为Ala、将其第393位的Phe突变为Lys；

突变体9，所述突变体9是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第124位的Ala突变为Leu、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys；

突变体10，所述突变体10是在如SEQ：ID：NO:1所示的氨基酸序列基础上，将其第177位的Gly突变为Ala、将其第312位的Gly突变为Met、将其第393位的Phe突变为Lys。

本发明还提供了编码上述AMP磷酸转移酶突变体的基因。

本发明选择绿脓杆菌(Paeruginosa pseudomonas)物种，NCBI序列号：553898144为原始序列，通过随机突变后利用活力筛选的方法获得活力较好的正向突变点。对初始筛选活力高的突变体进行累计突变，即将正向突变点通过分子生物学手段叠加以提高原有ATP合成活力。在诸多突变中，筛选到10个代表性正向突变体。在这10个代表性突变体后期的累加实验中发现。其中含有第124位(A124L)、312位(G312M)、393位(F393K)三个突变位点的突变体9可将ATP合成活力提高约80倍，在50℃15min下温度稳定性可提高20倍，可达到单酶高能力合成ATP的效果，重命名为AMP-PPTM。

(二)复合生物催化剂的制备：复合生物催化剂包括腺苷激酶和上述的AMP磷酸转移酶突变体，优选采用AMP-PPTM突变体。

AK酶来源：从酿酒酵母基因组中提取腺苷激酶基因组(GenBank:GHM90234.1)并进行PCR扩增，将回收的酶基因片段连接到pET28a质粒载体上，获得重组质粒pET28a-AK。重组质粒转入Escherichia coli DH5α感受态细胞内保存。将上述重组质粒转入Escherichiacoli BL21(DE3)感受态细胞内，筛选阳性克隆，培养诱导离心破碎获取AK酶。

AMP-PPTM酶来源：将突变体扩增后的基因片段连接到pET28a质粒载体上，获得重组质粒pET28a-AMP-PPTM。重组质粒转入Escherichia coli DH5α感受态细胞内保存。上述重组质粒转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞内，筛选阳性克隆，培养诱导离心破碎获取AMP-PPTM酶。

所用复合生物催化剂为腺苷激酶(AK酶)和AMP磷酸转移酶突变体酶的组合。通过基因工程改造、摇瓶小试、微生物液体发酵、蛋白破碎且按照0.6:1的酶活比例组合以获取新型复合生物催化剂；该复合生物催化剂可以以游离酶或冻干粉形式参与催化反应，也可将其进行固定化，制备成固定化酶参与反应。

(三)催化反应：将上述的复合生物催化剂应用于ATP合成中。

在酶催化反应中，底物腺苷浓度20-30g/L，ATP盐0.5-1.5g/L，镁离子5-15g/L，六偏磷酸钠20-40g/L，游离态复合生物催化剂2000-3000U/L；反应pH6.0-8.0，温度30-40℃，时间3-5h。或者

底物腺苷浓度20-30g/L，ATP盐0.5-1.5g/L，镁离子5-15g/L，六偏磷酸钠20-40g/L，固定化复合生物催化剂0.3-0.5kg/L；反应pH6.0-8.0，温度30-40℃，时间3-5h。本发明添加的底物、酶、盐可一次性加入，也可按照工业操作分批加入。

(四)分离产物ATP和复合生物催化剂：

固定化的复合生物催化剂可在恒温反应釜中通过离心、过滤方式直接分离；

游离的复合生物催化剂通过切向流***处理获得。其中，切向流***包括进料口、出料口、回流口，内设有10KD/30KD截留膜，反应转化液进入切向流***处理后截留液为回收的酶液，滤出液为经酶分离后(分离酶后)的含ATP的反应液。

(五)成品制备：

步骤(四)中得到的经酶分离后(分离酶后)含ATP的反应液，经脱色、离子交换层析、浓缩结晶、干燥等处理获得ATP产品。

本发明上述技术方案具有以下有益效果：

(1)开发了一种ATP新型复合生物催化剂，酶种类只有两种(AK酶+AMP-PPTM酶)；

(2)使用ATP新型复合生物催化剂，高效稳定且廉价，ATP生产过程简单，易操作；

(3)以腺苷为底物，在一定程度上降低生产ATP的成本，产物生成率、总收率更高；

(4)建立了酶回收体系，污染小，且生产过程中杂质色素较少，易于后续ATP的纯化。

附图说明

图1：实施例3中反应30min各物质变化情况。

图2：实施例3中反应2h各物质变化情况。

图3：实施例3中反应3h各物质变化情况。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。

实施例1AMP磷酸转移酶突变体的获取方法

通过随机突变PCR试剂盒引入随机突变，结合HPLC方法筛选突变体与野生型间ATP合成能力差异。选择正向突变单克隆菌株，提取质粒送测序，获得突变点，共获得单点突变4个，见突变体1-4。后期通过引物设计引入定点突变方式构建突变体5-10，并测试活性。

通过相同条件下活力筛选方法获得高活力、高稳定性菌株共十株，分别命名为突变体1-10，其中含有第124位(A124L)、312位(G312M)、393位(F393K)的突变体9(命名为AMP-PPTM酶)在ATP合成活力上可提高约80倍，温度稳定性上可提高约20倍，活力稳定性提高最为显著，结果见表1。

表1：氨基酸序列突变位置对酶活等的影响

实施例2：AMP-PPTM酶性质的确定

将含AMP磷酸转移酶及其突变体质粒分别各自转化至Escherichia coli BL231(DE))中，得到突变体，将菌株接种于LB培养基中，待菌体OD₆₀₀值达到0.6时，加入终浓度为0.1mM IPTG诱导表达AMP磷酸转移酶及其突变体，过夜诱导，诱导条件为20℃。摇瓶水平收集菌体量为5g/L。菌体经破碎制备成粗酶液。

根据AMP-PPTM酶的活力值，来确定优质菌株。酶活测试1mL反应体系：底物腺苷(13.5mM/L)，ATP二钠盐(5mM/L)、镁离子(50mM/L)和六偏磷酸钠(50mM/L)，pH7.0、37℃反应30min，高效液相色谱法测定ATP生成量以及底物腺苷减少，计算评估AMP-PPTM酶活性。酶活定义：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。

实施例3：催化反应各物质检测方法的确定

利用高效液相色谱法，检测催化反应底物剩余与产物生成情况。色谱条件：C18反相柱，流动相磷酸缓冲盐-甲醇，流速1.2mL/min，柱温30℃，波长254nm。测试100mL反应体系，反应30min，检测体系各物质情况，如图1：ATP生成率为33％，另有少许AMP、ADP生成；反应2h，检测ATP的生成情况，如图2：ATP生成率为81％，AMP次之；反应3h后，检测ATP的生成量，如图3，底物基本消耗完全，ATP生成率为97％。

实施例4：AK酶、AMP-PPTM酶工程菌的高密度发酵培养

(一)AMP-PPTM酶工程菌种子液的培养

1、将AMP-PPTM酶基因克隆至pET28a表达载体内，获得表达AMP-PPTM酶的质粒，将其命名为pET28a-AMP-PPTM质粒，将该质粒转化至BL21(DE3)细胞，获得AMP-PPTM酶基因阳性的基因工程菌BL21(DE3)[pET28a-AMP-PPTM]。

2、取上述制备得到的基因工程菌BL21(DE3)[pET28a-AMP-PPTM]，将其接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间12h；从平板上挑取单菌落接种至LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)内，在37℃、220r的恒温摇床中培养12h得到发酵的种子培养液。

(二)AMP-PPTM酶工程菌的高密度发酵培养

采用5L发酵罐进行AMP-PPTM酶高密度发酵，装液量为3L。将上述培养得到的种子液按5％接种量接入到发酵培养基中(蛋白胨30g/L，酵母粉30g/L，甘油50g/L，Na₂HPO₄16.4g/L，KH₂PO₄ 8g/L，无水硫酸镁0.6g/L，NaCl 10g/L)，温度控制在37℃，转速、通气联动保持溶氧控制在25％，自动流加氨水保持pH值控制在6.5-7.5。发酵约8h后，当溶氧发生突变时，开始流加补料培养基(甘油50％(v/v)，蛋白胨40g/L，酵母粉40g/L)，流加速率为30mL/h；当培养约6h，OD₆₀₀为24时，调节培养温度至20℃，加入0.1mM IPTG进行诱导，共诱导10h(每隔1h进行取样，用于后续蛋白表达量分析)；发酵结束后，菌体OD₆₀₀最后为110，所得菌体湿重为95g/L。

AK酶工程菌的高密度发酵培养方法与上述方法基本一致。

实施例5：游离酶法制备三磷酸腺苷的方法

具体包括以下步骤：

(一)复合生物催化剂制备：制备高产AK酶、AMP-PPTM酶菌株，经发酵离心后获得湿菌体；按照1:10比例用pH7.0 20mM PBS缓冲液混悬后，用高压均质机破碎，高速离心获取粗酶液，然后将AK酶、AMP-PPTM酶按照0.6：1的酶活比例制得复合生物催化剂。

(二)在20L恒温反应釜内，10L反应体系内加入腺苷250g，ATP钠盐10g，六水氯化镁100g，六偏磷酸钠300g，用适当纯净水溶解，配制过程中均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH至7.0，在反应体系中加入复合生物催化剂2000U/L开始反应。反应期间控制pH为7.0，温度为37℃。反应3h后，腺苷转化率为98％，ATP生成率为95.47％，生成量为45.3g/L。

(三)通过离心、超滤等方法，将步骤(二)中的反应液通过切向流***分离出AK酶和AMP-PPTM酶,渗透液为含ATP、ADP、AMP及盐离子的清液，浓缩液为我们所分离出来的酶以及其他成分。

对浓缩液内酶剩余酶活测定，检测其相对反应前减少12％，添加适量新酶即可重复步骤(二)操作。

(四)分离ATP：对步骤(三)渗透液进行脱色、离子交换层析、浓缩、结晶、干燥制得ATP成品，纯度可达99％以上，总收率为85.92％。

实施例6：pH8.0对游离酶法制备三磷酸腺苷的影响

pH8.0下游离酶法制备三磷酸腺苷的方法，具体包括以下步骤：

(二)在20L恒温反应釜内，10L反应体系内加入腺苷200g，ATP钠盐10g，六水氯化镁150g，六偏磷酸钠400g，用适当纯净水溶解，配制过程中均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH至8.0，在反应体系中加入复合生物催化剂2500U/L开始反应。反应期间控制pH为8.0，温度为37℃。反应5h后，腺苷转化率为95％，ATP生成率为90.62％，生成量为34.4g/L。

对浓缩液内酶剩余酶活测定，检测其相对反应前减少13％，添加适量新酶即可重复步骤(二)操作。

(四)分离ATP：对步骤(三)渗透液进行脱色、离子交换层析、浓缩、结晶、干燥制得ATP成品，纯度可达97％以上，总收率为84.27％。

实施例7：pH6.0对游离酶法制备三磷酸腺苷的影响

pH6.0下游离酶法制备三磷酸腺苷的方法，具体包括以下步骤：

(二)在20L恒温反应釜内，10L反应体系内加入腺苷250g，ATP钠盐10g，六水氯化镁50g，六偏磷酸钠400g，用适当纯净水溶解，配制过程中均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH至6.0，在反应体系中加入复合生物催化剂2000U/L开始反应。反应期间控制pH为6.0，温度为37℃。反应4h后，腺苷转化率为96％，ATP生成率为92.94％，生成量为44.1g/L。

(三)通过离心、超滤等方法，将步骤(一)中的反应液通过切向流***分离出AK酶和AMP-PPTM酶,渗透液为含ATP、ADP、AMP及盐离子的清液，浓缩液为我们所分离出来的酶以及其他成分。

(四)分离ATP:对步骤(三)渗透液进行脱色、离子交换层析、浓缩、结晶、干燥制得ATP成品，纯度可达98％以上，总收率为83.65％。

实施例8：30℃下新型酶法制备三磷酸腺苷

30℃下新型酶法制备三磷酸腺苷的方法，具体包括以下步骤：

(二)在20L恒温反应釜内，10L反应体系内加入腺苷250g，ATP钠盐10g，六水氯化镁150g，六偏磷酸钠300g，用适当纯净水溶解，配制过程中均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH至7.0，在反应体系中加入复合生物催化剂3000U/L开始反应。反应期间控制pH为7.0，温度为30℃。反应6h后，ATP生成率为94.20％，生成量为44.7g/L，腺苷转化率为97％。

对浓缩液内酶剩余酶活测定，检测其相对反应前减少11％，添加适量新酶即可重复步骤(二)操作。

(四)分离ATP：对步骤(三)渗透液进行脱色、离子交换层析、浓缩、结晶、干燥制得ATP成品，纯度可达99％以上，总收率为84.78％。

实施例9：40℃下新型酶法制备三磷酸腺苷

40℃下新型酶法制备三磷酸腺苷的方法，具体包括以下步骤：

(二)在20L恒温反应釜内，10L反应体系内加入腺苷300g，ATP钠盐10g，六水氯化镁150g，六偏磷酸钠300g，用适当纯净水溶解，配制过程中均匀搅拌防止出现沉淀，调节pH至7.0，在反应体系中加入复合生物催化剂2500U/L开始反应。反应期间控制pH为7.0，温度为40℃。反应3h后，ATP生成率为94.93％，生成量为54.05g/L，腺苷转化率为98％。

(四)分离ATP：对步骤(三)渗透液进行脱色、离子交换层析、浓缩、结晶、干燥制得ATP成品，纯度可达99％以上，总收率为85.44％。

实施例10：固定化酶的制备方法

将AK酶和AMP-PPTM酶按照0.6:1的酶活比例配制成20L混合液。在恒温反应釜中加入环氧固定化载体LX-1000EP湿载体5kg与上述酶液混合，控制28℃摇床慢摇24h，过滤收集载体，用pH7.0、20mM磷酸盐缓冲液、水分别洗涤2-3遍，得到固定化复合生物催化剂。

实施例11：固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法

固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，具体包括以下步骤：

在反应釜中，10L体系加入底物腺苷250g，ATP盐10g，六水氯化镁100g，六偏磷酸钠300g，其他为纯净水。用10M氢氧化钠调节pH至7.0，加入上述固定化ATP新型复合生物催化剂0.4kg，在37℃、300r条件下反应4h，每1h取样高效液相色谱检测底物剩余与产物生成情况。反应结束后反应液经过滤回收ATP固定化新型复合生物催化剂，过滤液经离心、超滤、脱色、离子交换层析、浓缩干燥等步骤可获得ATP干粉410g，总收率为85.3％。

实施例12：提高固定化酶量对制备三磷酸腺苷的影响

观察提高固定化酶量对制备三磷酸腺苷的影响，具体包括以下步骤：

在20L恒温反应釜中，10L体系加入底物腺苷200g，ATP盐15g，六水氯化镁150g，六偏磷酸钠400g，其他为纯净水。用10M氢氧化钠调节pH至7.0，加入上述固定化ATP新型复合生物催化剂0.5kg，在37℃、300r条件下反应3h，每1h取样高效液相色谱检测底物剩余与产物生成情况。反应结束后反应液经过滤回收ATP固定化新型复合生物催化剂，过滤液经离心、切向流处理、脱色、离子交换层析、浓缩干燥等步骤可获得ATP干粉320.2g，总收率为84.2％。

实施例13：降低固定化酶量对制备三磷酸腺苷的影响

在20L恒温反应釜中，10L体系加入底物腺苷250g，ATP盐5g，六水氯化镁50g，六偏磷酸钠200g，其他为纯净水。用10M氢氧化钠调节pH至7.0，加入上述固定化复合生物催化剂0.3kg，在37℃、300r条件下反应5h，每1h取样高效液相色谱检测底物剩余与产物生成情况。反应结束后反应液经过滤回收ATP固定化新型复合生物催化剂，过滤液经离心、切向流处理、脱色、离子交换层析、浓缩干燥等步骤可获得ATP干粉386g，总收率为83.6％。

实施例14：固定化酶重复批次实验

固定化酶重复批次实验，具体包括以下步骤：

在反应釜中，10L体系加入底物腺苷300g，ATP盐10g，六水氯化镁100g，六偏磷酸钠300g，其他为纯净水。用10M氢氧化钠调节pH至7.0，加入上述固定化ATP新型复合生物催化剂0.4kg，在37℃、300r条件下反应4h，每1h取样高效液相色谱检测底物剩余与产物生成情况。反应结束后反应液经过滤回收ATP固定化新型复合生物催化剂，过滤液经离心、超滤、脱色、离子交换层析、浓缩干燥等步骤可获得ATP干粉492g，总收率为85.3％。

将回收的固定化新型复合生物催化剂重新投放至反应中，重复上述实验，重复100次，经过分离纯化平均可获得干粉380g，平均总收率为84％。

实施例15：ATP的分离纯化工艺

ATP的分离纯化工艺，该工艺包括下述顺序步骤：

(一)转化法制备ATP：利用上述酶法制备ATP，收集转化反应液。

(二)ATP转化反应液的预处理：将转化反应液通过离心除去反应中的变性蛋白等大颗粒杂质，取上清液用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液；滤液继续采用切向流***进行除盐，获取三磷酸腺苷浓缩液并进行稀释；

(三)ATP预处理液脱色：将步骤(二)收集到的三磷酸腺苷浓缩稀液使用6N盐酸终止反应，按照2％的添加量加入活性炭粉末，在30℃下搅拌30min，布氏漏斗抽滤，收集滤液待用；

(四)ATP脱色液离子交换层析处理，去除脱色液内的离子和其他杂质。

(五)ATP层析液真空浓缩结晶：将步骤(四)收集到层析液在55℃真空浓缩后，4℃下加入3倍体积的95％乙醇搅拌冷却结晶，收集晶体。

(六)ATP晶体的干燥:将收集到的晶体在80℃的烘箱中烘至6h，得到ATP成品，总体收率80％以上。

序列表

<110> 美邦美和生物科技有限公司

<120> AMP磷酸转移酶突变体、其编码基因及在ATP合成中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 绿脓杆菌(Paeruginosa pseudomonas)

<400> 1

Val Arg Ile Arg Gly Ser Trp Pro Gln His Arg Gln Gly His Leu Arg

1 5 10 15

Glu Gly Arg His Arg Val Ala Arg Ser Ala Ala Arg Gly Ala Val Arg

20 25 30

Ala Gln Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Asp His Pro Asp Gln Arg His

35 40 45

Arg Gly Arg Arg Gln Gly Arg Asp Gly Gln Ala Ala Gln Arg Val Asp

50 55 60

Gly Pro Ala Pro Asn Arg Gly Ala Glu Leu Pro Pro Ser Phe Arg Arg

65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Pro Ala Ala

85 90 95

Gln Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Leu Arg Gln Leu Val Gln Pro Asp Ala

100 105 110

Leu Arg Ala Gly Arg Gly Ala Tyr Gln Gly Gly Gln Ala Gly Pro Gly

115 120 125

His Arg Cys Arg Arg Thr Leu Arg Ala His Ala Leu Arg Arg Arg Arg

130 135 140

Ala Ala Leu Gln Val Leu Val Pro Ser Leu Gln Glu Thr Val Glu Gly

145 150 155 160

Ala Ser Gln Gly Ala Gly Glu Gly Pro Ala Ala Gln Leu Glu Ala Gln

165 170 175

Ser Ala Gly Leu Glu Ala Glu Arg Gly Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu

180 185 190

Arg Arg Ala Cys Ala Ala Pro Tyr Gln Pro Gly Leu Arg Ala Leu Val

195 200 205

Arg Gly Gly Arg Arg Gly Arg Ala Leu Pro Arg Pro Asp Arg Arg Pro

210 215 220

His Pro Ser Arg Arg Val Ala Gly Arg Ala Gly His Gln Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gln Ala Pro Ala Ala Arg Arg Thr Ala Gly Val Glu Pro Gly Gln Pro

245 250 255

Trp Pro Ala Gly Leu Pro Gly Pro Gly Pro Val Pro Gly Gln Gly Arg

260 265 270

Leu Gln Gly Ala Ala Arg Arg Arg Ala Gly Ala Pro Gly Arg Ala Asp

275 280 285

Pro Arg Gln Ala Leu Pro Pro Ala Phe Ala Gly Arg Gly Val Arg Gly

290 295 300

Gln Arg Arg Gly Arg Gln Gly Arg Arg His Pro Pro Cys His Arg Arg

305 310 315 320

Ala Gly Pro Ala Pro Val Pro Tyr Arg Ala Asp Arg Arg Ala Asp Arg

325 330 335

Arg Gly Ala Cys Ala Ala Leu Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ala His Ser

340 345 350

Gly Ala Ser Pro Val His His Leu Arg Pro Phe Leu Val Arg Pro Arg

355 360 365

Ala Gly Gly Ala His Arg Gly Leu Leu Arg Thr Gly Arg Leu Ala Thr

370 375 380

Arg Leu Trp Arg Asp Gln Leu Arg Gly Ala Ala Gln Arg Val Arg Asp

385 390 395 400

His Arg Gly Glu Val Leu Ala Gly Asp Arg Gln Ala Asp Pro Asp Gly

405 410 415

Ala Leu Gln Gly Thr Arg Glu Asn Pro Leu Gln Ala Leu Gln Asp His

420 425 430

Arg Gly Arg Leu Ala Gln Pro Arg Gln Val Gly Pro Val Arg Gly Arg

435 440 445

Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Pro Tyr Gln His Arg Asp Arg Ala Leu Asp

450 455 460

Pro Gly Arg Ser Gln Arg Gln Ala Leu Arg Pro Gly Gln Gly Ala Ala

465 470 475 480

His His Gln Arg Arg His Arg Gly Gly Val Gln Glu Gly Gln Val

485 490 495

Claims

1.一种AMP磷酸转移酶突变体，其特征在于，其为下列任一突变体：

2.编码权利要求1所述AMP磷酸转移酶突变体的基因。

3.一种复合生物催化剂，其特征在于，包含腺苷激酶和权利要求1所述的AMP磷酸转移酶突变体。

4.根据权利要求3所述的复合生物催化剂，其特征在于，所述复合生物催化剂是由所述的腺苷激酶和AMP磷酸转移酶突变体组成的游离酶或固定化酶。

5.根据权利要求4所述的复合生物催化剂，其特征在于，腺苷激酶和AMP磷酸转移酶突变体的酶活比例为0.6:1。

6.权利要求1所述的AMP磷酸转移酶突变体在ATP合成中的应用。

7.权利要求3-5任一所述的复合生物催化剂在ATP合成中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，合成体系中，底物腺苷浓度20-30g/L，ATP盐0.5-1.5g/L，镁离子5-15g/L，六偏磷酸钠20-40g/L，游离态复合生物催化剂2000-3000U/L；反应pH6.0-8.0，温度30-40℃，时间3-5h。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，合成体系中，底物腺苷浓度20-30g/L，ATP盐0.5-1.5g/L，镁离子5-15g/L，六偏磷酸钠20-40g/L，固定化复合生物催化剂0.3-0.5kg/L；反应pH6.0-8.0，温度30-40℃，时间3-5h。