CN105779522B - 一种微生物酶转化法生产l‑4‑羟基异亮氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物酶转化法生产L‑4‑羟基异亮氨酸的方法,包括以下步骤：1、培养成熟的菌种；2、将成熟的可诱导生产L‑4‑羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入发酵罐中，进行发酵培养，发酵过程温度两阶控制，前期温度4‑36℃，后期30‑32℃；3、发酵后收集菌体，加入磷酸盐缓冲液洗涤，再加入a‑酮戊二酸、异亮氨酸、硫酸亚铁、硫酸镁、抗坏血酸，强制通风催化；4、催化液先经过陶瓷膜除菌，超滤膜，活性炭脱色，弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩、重结晶，得到L‑4‑羟基异亮氨酸。本发明制备方法的反应体系简单高效且提取流程简便易行，转化率高达95.4%以上，且产品纯度可达98%以上。
Description
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法。
背景技术
L-4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine）是一种自然界存在的非蛋白质氨基酸。研究发现，L-4-羟基异亮氨酸具有促进胰岛素分泌、提高胰岛素耐受和调节血脂等多方面作用。L-4-羟基异亮氨酸不仅能够促进周围组织对葡萄糖的摄取利用，还能够减少肝脏葡萄糖输出以提高外周组织的胰岛素耐受。相比现在已经用于治疗T2DM的药物，L-4-羟基异亮氨酸调控的胰岛素合成是严格依赖葡萄糖浓度。因此，L-4-羟基异亮氨酸不会引起类似低血糖等副作用。同时还发现L-4-羟基异亮氨酸能有效降低血液中甘油三酯和胆固醇的量，具有加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，L-4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。
受技术和成本的限制，我国L-4-羟基异亮氨酸的产量不能满足国内和外贸出口的需求。目前报道的L-4-羟基异亮氨酸生产方法包括提取法、化学合成法以及酶法，但仅提取法用于工业化生产且存在提取率低、分离纯化困难、原材料需求量大和成本高等不足，传统的化学法不论是有机合成或化学拆分均因生产成本高而失去竞争力。生物方法中因酶催化方法制备方法效率相对较高，但仍存在操作繁琐，原料昂贵，生产成本过高的问题，而目前缺乏相关可用于工业化大规模生产的工艺技术。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，采用高密度发酵且酶活高，反应体系简单高效且提取流程简便易行，收率可达75%且产品纯度在98%以上，该方法效率高，成本低，易于产业化生产。
本发明为解决上述技术问题，所提供的技术方案是：一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度33℃-37℃，pH6.5-7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为12-16：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
所述可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为：根据苏云金芽孢杆菌YL-03中基因IDO（即编码L-异亮氨酸羟化酶的基因）对其进行人工修饰，获得基因序列如SEQ ID NO.1所示；克隆出该基因，并将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌。
（2）、将成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导，溶氧控制在30-50%，pH6.5-7.0，底糖耗尽后，流加质量浓度为10-80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过程温度两阶控制，加入IPTG诱导前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30-32℃进行培养；
（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸 30-35g/L、异亮氨酸26-30g/L、硫酸亚铁0.5-4g/L、硫酸镁0.1-1g/L 、抗坏血酸0.01-0.2g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0-6.5，催化温度为28-32℃，得到催化液；所述菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；
（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L-4-羟基异亮氨酸。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-20g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，维生素B 10-20mg/L，维生素H 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-10g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，VB1 0.5-20mg/L，VH 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，玉米浆0.5-10mL，柠檬酸钠0.5-2g/L.消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌前先加热至60-80℃，并保持10-40min。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为30-60min。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中洗脱用的氨水质量浓度为1%-3%，洗脱流速为1-1.5BV/h。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：步骤（4）中所述蒸发浓缩，蒸发浓缩后 4-羟基异亮氨酸粗品的终浓度为500-600g/L。
有益效果
一、申请人针对目前发酵工艺方法中的不足，在天津科技大学、中国氨基酸技术服务中心的帮助指导下，通过对发酵配方及过程控制、微生物酶转化方案和控制工艺、提取方案及控制工艺的改进，使得提取工艺简单，转化率高达95.4%以上，且产品纯度可达98%以上，极大提高了L-4-羟基异亮氨酸的生产能力及效率，可满足L-4-羟基异亮氨酸的大规模工业化生产，具有较高的社会和经济效益；
二、本发明中的方法技术上的进步包括以下方面：1、发酵培养：在发酵过程中对发酵过程温度进行两阶控制，发酵前期即加入IPTG前诱导前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30-32℃培养进行降温表达；诱导后降低温度可以降低菌体比生长速率，降低质粒丢失率，有益于酶结构的形成，防止形成包涵体，有利于目的基因的表达后保证酶分子的生物活性。培养基增加玉米浆作为有机氮源，为菌体生长和酶表达提供氨基酸、生长因子等。同时加入柠檬酸钠抑制EMP途径，减少碳代谢流损耗，减少乙酸等代谢副产物的生成，利于蛋白的表达。目前现有的报道多集中于摇瓶水平，且未见以甘油为碳源进行4-羟基异亮氨酸的发酵培养，诱导后降低温度可以降低菌体比生长速率，有利于目的基因的表达后保证酶分子的生物活性。流加甘油进行培养，细胞得率显著高于葡萄糖，且有利于目的基因的诱导表达，酶总量高，经济效益得到明显提升。一次发酵可满足3批次的催化。2、酶转化：较常规试验相比，酶催化周期短，4h内酶反应结束，节省生产时间，常规催化转化率一般在85%左右，有较多的异亮氨酸残余，不利于后续提取纯化，且造成底物浪费，严重影响经济效益。本发明加入足量的α-酮戊二酸，较现有技术方法相比，反应速率和转化率明显提高。过量的α-酮戊二酸一方面满足菌体自身代谢体系消耗、同时促进该酶促反应的进行。同时降低酶促反应温度，增加Mg2+增强酶活力，降低铁离子含量减轻后续的提取压力。3、提取：现有技术中对提取方案的研究主要是从植物提取入手的，对催化体系的提取涉及甚少。经过122弱酸性阳离子树脂除盐后，可大幅度提高732树脂吸附量，且减少了后续单元分离难度。经过在75%的乙醇中重结晶后，产品液相纯度得到明显提升，可达98%以上。
具体实施方式
一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度33℃-37℃，pH6.5-7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为12-16：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
所述可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为：根据苏云金芽孢杆菌YL-03中基因IDO（即编码L-异亮氨酸羟化酶的基因）对其进行人工修饰，获得基因序列如SEQ ID NO.1所示；克隆出该基因，并将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌。
（2）、将成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导，溶氧控制在30-50%，pH6.5-7.0，底糖耗尽后，流加质量浓度为10-80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过程温度两阶控制，加入IPTG诱导前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30-32℃进行培养；
（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸 30-35g/L、异亮氨酸26-30g/L、硫酸亚铁0.5-4g/L、硫酸镁0.1-1g/L 、抗坏血酸0.01-0.2g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0-6.5，催化温度为28-32℃，得到催化液；所述菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；
（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L-4-羟基异亮氨酸。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-20g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，维生素B 10-20mg/L，维生素H 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-10g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，VB1 0.5-20mg/L，VH 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，玉米浆0.5-10mL，柠檬酸钠0.5-2g/L.消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌前先加热至60-80℃，并保持10-40min。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为30-60min。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：所述步骤（4）中洗脱用的氨水质量浓度为1%-3%，洗脱流速为1-1.5BV/h。
作为本发明一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法的进一步改进：步骤（4）中所述蒸发浓缩，蒸发浓缩后 4-羟基异亮氨酸粗品的终浓度为500-600g/L。
本发明中转化率的计算方式如下：
理论上1mol的L-异亮氨酸能催化产生1mol的L-4-羟基异亮氨酸。
以L-4-羟基异亮氨酸含量的转化情况计
转化率（%）=（L-4-羟基异亮氨酸产量）/（理论 L-4-羟基异亮氨酸含量）*100%
L-4-羟基异亮氨酸的含量用，DNFB柱前衍生后液相进行检测。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度36℃，pH7.0，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为14，即得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
本实施例中可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌通过购买获得；其构建方法为，克隆出其基因序列如SEQ ID NO.1所示的基因；将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰20mg/L和消泡剂0.4ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加终浓度（以发酵液体积计算）为0.1mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）进行诱导。发酵过程温度分段控制，发酵前期控制温度在36℃，待加入诱导剂后，调整温度30℃培养，底糖耗完后，流加50%甘油进行发酵；
发酵罐罐配方：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁2g/L，VB1（维生素B1） 10mg/L，VH(维生素H) 2mg/L，硫酸亚铁50mg/L，硫酸锰50mg/L，玉米浆10mL，柠檬酸钠1g/L.消泡剂0.5ml/L，其余为水。
（3）、发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸 30g/L、异亮氨酸 25g/L、硫酸亚铁 3g/L、硫酸镁1 g/L 、抗坏血酸0.1 g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体，强制通风催化，维持pH 6.5，催化温度为30度。4h内底物反应完毕，转化率达95.4%；较常规试验相比，本方案酶催化周期短，4h内酶反应结束，常规方法催化转化率一般在85%左右，有较多的异亮氨酸残余，不利于后续提取纯化，且造成底物浪费，影响经济效益。
（4）、催化液经过陶瓷膜除菌，再过3Kd分子量的超滤膜除去一部分色素和蛋白，并经1%活性炭保温脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为500g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，在75%的乙醇中重结晶，纯度为98.8%。
实施例2
一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度37℃，pH6.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为12：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰20mg/L，消泡剂0.4ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.2mmol/L。发酵过程温度分段控制，发酵前期控制温度在36℃，待加入诱导剂后，调整温度30℃培养，底糖耗完后，流加60%甘油进行发酵；
发酵罐罐配方：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁2g/L，VB1 10mg/L，VH 2mg/L，硫酸亚铁50mg/L，硫酸锰50mg/L，玉米浆10mL，柠檬酸钠1g/L，消泡剂0.5ml/L，其余为水。
（3）、发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：加入a-酮戊二酸 30g/L、异亮氨酸26g/L、硫酸亚铁 3g/L、硫酸镁0.5g/L 、抗坏血酸0.05 g/L，强制通风催化，维持pH 6.5，催化温度为30度。4h内底物反应完毕，L-4-羟基异亮氨酸产酸为27.86 g/L, 理论L-4-羟基异亮氨酸产酸为29.2 g/L，转化率达95.4%，较常规试验相比，酶催化周期短，4h内酶反应结束，方法催化转化率在85%左右，有较多的异亮氨酸残余，不利于后续提取纯化，且造成底物浪费，影响经济效益。
（4）、催化液经过陶瓷膜除菌，再过3Kd分子量的超滤膜除去一部分色素和蛋白，并经1%活性炭保温脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为600g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，在75%的乙醇中重结晶，纯度为98.6%。
实施例3
一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度36℃，pH6.8，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为13：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
种子罐培养基配方：葡萄糖10g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨3g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁2g/L，VB1 15mg/L，VH 5mg/L，硫酸亚铁30mg/L，硫酸锰30mg/L，消泡剂0.4ml/L，其余为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.2mmol/L。发酵过程温度分段控制，发酵前期控制温度在35℃，待加入诱导剂后，调整温度31℃培养，底糖耗完后，流加80%甘油进行发酵；
发酵罐罐配方：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁2g/L，VB1 10mg/L，VH 2mg/L，硫酸亚铁50mg/L，硫酸锰50mg/L，玉米浆10mL，柠檬酸钠1g/L，消泡剂0.5ml/L，其余为水。
（3）、发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸 32g/L、异亮氨酸 28g/L、硫酸亚铁 2g/L、硫酸镁0.5g/L 、抗坏血酸0.05 g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体，强制通风催化，维持pH 6.2，催化温度为28℃。4h内底物反应完毕，转化率达96.4%
（4）、催化液经过陶瓷膜除菌，再过3Kd分子量的超滤膜除去一部分色素和蛋白，并经1%活性炭保温脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为500g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，在75%的乙醇中重结晶，纯度为98.3%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
相关对比试验实施例：
本试验采用现有技术中的方法和本发明中的方法分别进行发酵生产L-4-羟基异亮氨酸，然后对各组的发酵结果进行对比。发酵中所采用的菌种均为“可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌”，该菌的构建方法为：克隆出其基因序列如SEQ ID NO.1所示的基因；将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；”；将现有技术方法和本发明方法各分两组，即现有技术方法A组，现有技术方法B组，本发明方法A组和本发明方法B组。其中各组的方法操作条件如下：
现有技术方法A组：
将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度36℃，pH7.0，溶氧控制在25%以上，移种时OD600值为14，得到成熟的菌种；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰10mg/L，消泡剂0.4ml/L，余量为水。
将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.1mmol/L。发酵过程，发酵控制温度在36℃，底糖耗完后，流加液糖发酵；
发酵培养基：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，VB1 2mg/L，VH 1mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰5mg/L，消泡剂0.3ml/L，余量为水。。 发酵周期21h左右最高时OD600值为35。
发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并加入生理盐水洗涤，对菌体进行预处理。30度温育处理后，加入a-酮戊二酸28g/L、异亮氨酸 25g/L、硫酸亚铁 5g/L、抗坏血酸0.02 g/L，强制通风催化，维持pH 7，催化温度为32度。18h内底物反应完毕，L-4-羟基异亮氨酸产酸为24.3g/L, 理论L-4-羟基异亮氨酸产酸为28.05 g/L转化率达86.6%；
催化液经过陶瓷膜除菌，并经1%活性炭保温脱色，蒸发后90%的乙醇沉淀，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，树脂吸附量30g/L，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为500g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，得到的4-羟基异亮氨酸含量可达40%。产品收率40.4%。
现有技术方法B组：
将将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度37℃，pH7.0，溶氧控制在25%以上，移种时OD600值为15，得到成熟的菌种；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰10mg/L，消泡剂0.4ml/L，余量为水。
将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵4h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.1mmol/L。发酵过程，发酵控制温度在36℃，底糖耗完后，流加液糖发酵；
发酵培养基：葡萄糖7g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2g/L，VB1 2mg/L，VH 1mg/L，硫酸亚铁10mg/L，硫酸锰5mg/L，消泡剂0.3ml/L，余量为水。 发酵周期21h左右最高OD600值为 40。
发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并加入碳酸盐缓冲液洗涤，对菌体进行预处理。25度温育处理后，加入a-酮戊二酸 23g/L、异亮氨酸 20g/L、硫酸亚铁 3g/L、、抗坏血酸0.05 g/L，强制通风催化，维持pH 7，催化温度为32度。16h内底物反应完毕，L-4-羟基异亮氨酸产酸为19.1g/L, 理论L-4-羟基异亮氨酸产酸为22.4 g/L，转化率达85.3%。
催化液经过陶瓷膜除菌，并经0.5%活性炭保温脱色，上732阳离子交换树脂吸附并用2%氨水洗脱，树脂吸附量25g/L，蒸发浓缩，得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，得到的4-羟基异亮氨酸含量可达35%。用硅胶柱层析纯化粗品，纯度可达80.1%。产品收率32.6%。
本发明方法A组：
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度36℃，pH7.0，溶氧控制在25%以上，移种时OD600值为14，得到成熟的菌种；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰20mg/L，消泡剂0.4ml/L，余量为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.1mmol/L。发酵过程温度分段控制，发酵前期控制温度在36℃，待加入诱导剂后，调整温度30℃培养，底糖耗完后，流加50%甘油进行发酵；
发酵罐罐配方：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁2g/L，VB1 10mg/L，VH 2mg/L，硫酸亚铁50mg/L，硫酸锰50mg/L，玉米浆10mL，柠檬酸钠1g/L，消泡剂0.5ml/L，余量为水。21h下罐、菌体最高OD600值为65.
（3）、发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并加入磷酸盐缓冲液洗涤，对菌体进行预处理。使用磷酸盐缓冲液为缓冲体系，加入a-酮戊二酸 30g/L、异亮氨酸 25g/L、硫酸亚铁 3g/L、硫酸镁1 g/L 、抗坏血酸0.1 g/L，强制通风催化，维持pH 6.5，催化温度为30度。4h内底物反应完毕，转化率达95.4%；
（4）、催化液经过陶瓷膜除菌，再过3Kd分子量的超滤膜除去一部分色素和蛋白，并经1%活性炭保温脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为500g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，在75%的乙醇中重结晶，纯度为98.8%。产品收率60.5%。
本发明B组：
（1）、将菌种接入种子罐中，在以下条件下进行培养：培养温度36℃，pH7.0，溶氧控制在25%以上，移种时OD600值为15，得到成熟的菌种；
种子罐培养基配方：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1 g/L，VB1 10mg/L，VH 0.5mg/L，硫酸亚铁20mg/L，硫酸锰20mg/L，消泡剂0.4ml/L，余量为水。
（2）、将成熟的菌种接入发酵罐中，在以下条件下进行培养：通过液体深层通风发酵，发酵5h向发酵培养基中一次性流加IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）0.2mmol/L。发酵过程温度分段控制，发酵前期控制温度在36℃，待加入诱导剂后，调整温度30℃培养，底糖耗完后，流加40%甘油进行发酵；21h下罐、菌体最高OD600值为70。
发酵罐罐配方：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁2g/L，VB1 10mg/L，VH 2mg/L，硫酸亚铁50mg/L，硫酸锰50mg/L，玉米浆10mL，柠檬酸钠1g/L，消泡剂0.5ml/L，余量为水。
（3）、发酵完成后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并加入磷酸盐缓冲液洗涤，对菌体进行预处理。使用磷酸盐缓冲液为缓冲体系，加入 加入a-酮戊二酸 30g/L、异亮氨酸26g/L、硫酸亚铁 3g/L、硫酸镁0.5g/L 、抗坏血酸0.05 g/L，强制通风催化，维持pH 6.5，催化温度为30度。4h内底物反应完毕，转化率达95.6%；
（4）、催化液经过陶瓷膜除菌，再过3Kd分子量的超滤膜除去一部分色素和蛋白，并经1%活性炭保温脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，上732阳离子交换树脂吸附并用1%氨水洗脱，蒸发浓缩（蒸发浓缩终浓度为600g/L）得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，在75%的乙醇中重结晶，纯度为98.6%。产品收率62.4%。
对比实验结果如下：
对比试验结果表明，本发明方法可使转化率高达95.4%以上，且产品纯度可达98%以上，显著提高了L-4-羟基异亮氨酸的生产能力及效率，具有较好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1875
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgggaacgta ttcaccgtgg cattctgatc cacattacta gcgattccga cttcatggag 120
tcgagttgca gactccaatc cggactacga cgcactttat gaggtccgct tgctctcgcg 180
aggtcgcttc tctttgtatg cgccattgta gcacgtgtgt agccctgtcg taagggccat 240
gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc agtttatcac tggcagtctc ctttgagttc 300
ccggccggac cgctggcaac aaaggataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac 360
atttcacaac acgagctgac gacagccatg cagcacctgt ctcacggttc ccgaaggcac 420
attctcatct ctgaaaactt ccgtggatgt caagaccagg taaggttctt cgcgttgcat 480
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ttgaaggagc ctttagaaac tttagtattt ggacaaaagg tcttccatgc cgtaacgcca 1800
cttggaacag aatgtagtac ggaggctttt cgtgatattt tattagtaac attttcttat 1860
aaagaaacca aataa 1875
Claims (7)
1.一种微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、将可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有种子罐培养基的种子罐中，在温度33℃-37℃，pH6.5-7.5，溶氧控制在25%以上的条件下培养至菌液的OD600值为12-16：得到成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
所述可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌的构建方法为，克隆出其基因序列如SEQ ID NO.1所示的基因；将该基因构建入质粒pET28a，得到重组质粒，将重组质粒后导入大肠杆菌BL21，即得到可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌；
（2）、将成熟的可诱导生产L-4-羟基异亮氨酸的大肠杆菌重组菌接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，进行液体深层通风发酵培养；培养过程中，培养5h时向发酵培养基中一次性投入终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG进行诱导，溶氧控制在30-50%，pH6.5-7.0，底糖耗尽后，流加质量浓度为10-80%的甘油水溶液做为碳源，发酵过程温度两阶控制，加入IPTG诱导前控制温度在34-36℃，待进行诱导表达后，调整温度到30-32℃进行培养；
（3）、发酵结束后，通过蝶式离心机低温收集菌体，并使用磷酸盐缓冲液对菌体进行洗涤，除去菌体表面杂质，然后以纯水配制催化体系：a-酮戊二酸 30-35g/L、异亮氨酸 26-30g/L、硫酸亚铁0.5-4g/L、硫酸镁0.1-1g/L 、抗坏血酸0.01-0.2g/L，向催化体系内加入洗涤后的菌体，强制通风催化，维持pH为6.0-6.5，催化温度为28-32℃，得到催化液；所述菌体的加入量为：每100ml催化体系加入0.3g菌体；
（4）、催化液先经过陶瓷膜过滤除菌，再过2-4Kd分子量的超滤膜，并经活性炭脱色，采用122弱酸性阳离子交换树脂除盐后，流出液上732阳离子交换树脂吸附并用氨水洗脱，蒸发浓缩得到L-4-羟基异亮氨酸粗品，然后重结晶得到L-4-羟基异亮氨酸。
2.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述种子罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-20g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，维生素B 10-20mg/L，维生素H 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
3.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述发酵罐培养基的配方为：葡萄糖0.5-10g/L，酵母粉0.5-10g/L，蛋白胨0.5-5g/L，硫酸铵0.5-10g/L，磷酸二氢钾0.5-3g/L，硫酸镁0.5-3g/L，VB1 0.5-20mg/L，VH 0.5-10mg/L，硫酸亚铁0.5-50mg/L，硫酸锰0.5-50mg/L，玉米浆0.5-10mL，柠檬酸钠0.5-2g/L和消泡剂0-0.5ml/L，其余为水。
4.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中催化液在经过陶瓷膜过滤除菌前先加热至60-80℃，并保持10-40min。
5.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中活性炭脱色时加炭量为料液体积的0.1-5%，保温时间为30-60min。
6.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：所述步骤（4）中洗脱用的氨水质量浓度为1-3%，洗脱流速为1-1.5BV/h。
7.如权利要求1所述微生物酶转化法生产L-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：步骤（4）中所述蒸发浓缩，蒸发浓缩后 4-羟基异亮氨酸粗品的终浓度为500-600g/L。
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Shuai Inventor after: Zhang Chenglin Inventor after: Xu Qingyang Inventor after: Li Jing Inventor after: Yue Guilong Inventor after: Zhang Mengtao Inventor before: Cao Huajie Inventor before: Liu Shuai Inventor before: Li Jing Inventor before: Yue Guilong Inventor before: Zhang Mengtao |
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