CN114853919A - 一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，主要涉及生物技术领域。包括以下步骤：S1.对原料进行超微粉碎处理；S2.进行酶解；S3.对多糖进行提取；S4.加入硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，静置盐析过夜；S5.离心，取上层清液；S6.重复S4和S5操作，分级盐析去除黑木耳超微粉多糖溶液中的蛋白；S7.脱色并醇沉；S8.透析去离子水中去除小分子杂质；S9.真空浓缩后冷冻干燥；S10.得到黑木耳超微粉多糖干燥制品。本发明的有益效果在于：优化了黑木耳超微粉多糖提取工艺，多糖得率更高，提高黑木耳的利用率，食用更安全可靠，且通过实验数据能清楚、全面的证明该制备方法所得多糖的效果与阿司匹林相近，预防和抑制血栓的效果较好。

Description

一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法。
背景技术
黑木耳中含有30％-35％的活性多糖，具有降血脂、抗血凝、防治血栓、抗肿瘤、提高免疫力等功能。黑木耳多糖常见提取方法有热水浸提法、酸碱提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法、超微粉碎辅助提取法、强电场提取法等。其中传统酶法辅助主要采用纤维素酶和果胶酶复合酶。提取得到的多糖为酸性杂多糖和β-葡聚糖，其单糖由木糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和葡糖醛酸组成。
传统提取方法的黑木耳多糖得率不等，以15％-20％居多，使得黑木耳中还有大量的多糖没有提取出来，黑木耳的消耗量大大增加，造成了一定的浪费，也提高了提取成本，且传统提取方法还需对多糖进行脱脂处理，传统脱脂方法多采用石油醚为萃取剂，即使后期脱除也存在不安全因素。
且现有技术中多为动物实验证明黑木耳多糖能延长实验动物的凝血酶原时间(PT)、凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)，从而证明抗血凝效果较好，具有预防和抑制血栓形成功能，但缺乏与市售保健食品或药品预防和抑制血栓的效果对比，缺少一定的说服力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，它采用碱酶结合法优化了黑木耳超微粉多糖提取工艺，使得多糖得率更高，提高黑木耳的生物利用率，去除了传统方法中采用石油醚脱脂的步骤，食用更安全可靠，且实验数据能清楚、全面的证明该制备方法所得多糖的效果与阿司匹林相近，从而更具有说服力，预防和抑制血栓的效果较好。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，包括以下步骤：
S1.取黑木耳原料，清理表面杂质，迅速冲洗后干燥，并进行粗粉碎和超微粉碎，然后将黑木耳超微粉置于干燥箱中干燥至恒重后置于真空袋中保存；
S2.取步骤S1中的所述黑木耳超微粉加蒸馏水混合分散，并向黑木耳超微粉溶水溶液中加入蜗牛酶进行酶解，使细胞壁温和破裂；
S3.利用响应曲面法优化碱提取条件，对步骤S2溶液中的黑木耳超微粉多糖进行提取，得到黑木耳超微粉多糖提取液；
S4.取步骤S3中的黑木耳超微粉多糖提取液加入烧杯中，在冰浴的条件下缓慢加入硫酸铵，搅拌溶液直至硫酸铵溶解，静置过夜；
S5.对经过步骤S4处理的溶液进行离心，取上层清液；
S6.重复步骤S4和S5的操作，使溶液中硫酸铵浓度分别达到40％、60％、80％，分级盐析除去黑木耳超微粉多糖溶液中的蛋白；
S7.对步骤S6中去除蛋白后的多糖溶液脱色并醇沉过夜、离心；
S8.将经过步骤S7处理后的溶液装入透析袋里，并放入去离子水中透析去除小分子杂质；
S9.对经过步骤S8处理的溶液进行真空浓缩后冷冻干燥；
S10.得到黑木耳超微粉多糖干燥制品。
进一步的，所述步骤S2在酶解时，蜗牛酶的用量为每g黑木耳超微粉加入13mg，酶解时间2.5h，酶解温度为55℃，pH为6.8。
进一步的，所述步骤S3中的最佳提取条件为：提取时间3.6h、提取温度96℃、pH值为12。
进一步的，所述步骤S9中真空浓缩到含水率低于30％时进行冷冻干燥。
进一步的，所述黑木耳超微粉的粒度低于100μm，且平均粒径在10-25μm。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明根据黑木耳细胞壁结构和组成成分，选用超微粉碎法结合蜗牛酶酶解法进行细胞壁破壁，随后进行碱提、盐析法脱蛋白、活性白土脱色、透析脱除小分子物质、醇沉等操作，得到纯化多糖，无需采用石油醚脱脂，提取方法安全高效，且多糖得率明显高于传统提取方法，使得同等数量的多糖提取能更加节省黑木耳的消耗，提高材料生物利用率，降低成本；
本发明采用动物实验研究比较了黑木耳超微粉原料、阿司匹林组和不同剂量纯化后超微粉多糖的抗血栓、抗血凝活性，实验指标为凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血粘度和血流变指标等，证明提取黑木耳超微粉多糖的必要性，以及证明该制备方法所得多糖的效果与阿司匹林相近，是传统制备方法所得多糖达不到的，从而更具有说服力，预防和抑制血栓的效果更好。
附图说明
附图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
实施例1：一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.取黑木耳原料，清理表面杂质，迅速冲洗后干燥，并进行粗粉碎和超微粉碎，超微粉碎后的粒度低于100μm，且平均粒径在10-25μm，然后将黑木耳超微粉置于干燥箱中80-90℃干燥至恒重后，置于真空袋中保存；
S2.取步骤S1中的所述黑木耳超微粉，按料液比1：100加蒸馏水混合分散，并向黑木耳超微粉溶水溶液中按每g黑木耳超微粉加入13mg用量的蜗牛酶进行酶解，酶解时间2.5h，酶解温度为55℃，pH为6.8，使细胞壁温和破裂；
S3.利用响应曲面法优化碱提取条件，对步骤S2溶液中的黑木耳超微粉多糖进行提取，得到黑木耳超微粉多糖提取液；
S4.取步骤S3中的黑木耳超微粉多糖提取液200ml加入500ml的烧杯中，在冰浴的条件下缓慢加入硫酸铵，搅拌溶液直至硫酸铵溶解，溶液中硫酸铵浓度为20％，静置过夜；
S5.利用冷冻干燥离心机12000r/min对经过步骤S4处理的溶液进行离心15min，取上层清液；
S6.重复步骤S4和S5的操作，使溶液中硫酸铵浓度分别达到40％、60％、80％，分级盐析黑木耳超微粉多糖溶液中的蛋白；
S7.对步骤S6中去除蛋白后的多糖溶液加白土搅拌脱色并醇沉过夜，离心；
S8.将经过步骤S7处理后的溶液装入分子量为8000-14000的透析袋里，两头扎紧，并放入去离子水中透析去除小分子杂质；
S9.利用旋转蒸发仪配水循环真空泵对经过步骤S8处理的溶液进行真空浓缩，含水率低于30％时进行冷冻干燥；
S10.得到黑木耳超微粉多糖干燥制品。
优选的，所述步骤S3中的最佳提取条件为：提取时间3.6h、提取温度96℃、pH值为12，此条件下的多糖得率为32.73％，大大提高了多糖得率，提高了黑木耳原料的利用率，pH和提取温度交互作用显著。
本发明根据黑木耳细胞壁结构和组成成分，选用超微粉碎法结合蜗牛酶酶解法进行细胞壁破壁，随后进行碱提、盐析法脱蛋白、活性白土脱色、透析脱除小分子物质、醇沉等操作，得到纯化多糖，因黑木耳中脂肪含量微乎其微，只有1％左右，无需采用石油醚脱脂，提取方法安全高效，选用的试剂均食品级别，食用更安全可靠，且多糖得率明显高于传统提取方法，使得同等数量的多糖提取能更加节省黑木耳的消耗，提高材料利用率，降低成本。
实施例2：本发明黑木耳超微粉多糖预防和抑制血栓形成实验流程如下：
(实验动物：雄性wistar大鼠公84只，体重160±20g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK黑2013-001，健康情况良好。)
实验分组(阴性对照组、模型组、阿司匹林阳性组、低中高剂量黑木耳超微粉多糖组)→模型建立(角叉菜胶模型→检测溶液配制→采血→APTT、TT、FIB和PT检测→数据处理)
1)实验分组
wistar大鼠饲养要求：每只大鼠需用苦味酸明确标号，分组时按照体重将56只大鼠随机分为7组。适应性喂养一周，动物环境均为清洁级，昼夜自然交替，自由饮水进食。
阿司匹林溶液的配制：取十片阿司匹林，100mg/片，压碎后加水溶解，倒入50ml容量瓶中定容，配成20mg/mL阿司匹林溶液，备用。
wistar大鼠分组：实验一个月，其中空白组和模型组在实验过程中只定时喂鼠粮和清水，其他组除了正常定时喂鼠粮和清水外，还需要每天定时灌胃一次。大鼠每日灌胃的药品根据顾嘉林实验分为阳性组，按照20mg/(kg·d)灌胃阿司匹林溶液；高浓度组，按照黑木耳超微粉多糖浓度为200mg/kg灌胃；中浓度组，按照黑木耳超微粉多糖浓度为100mg/kg灌胃；低浓度组，按照黑木耳超微粉多糖浓度为50mg/kg灌胃；黑木耳超微粉中含有35％多糖，由上述提取超微粉多糖结果已知，黑木耳超微粉多糖得率为32.73％，通过计算，按照黑木耳超微粉0.62g/kg灌胃，每组8只。
2)模型建立
大鼠分组后定时定量喂食水及药品，灌胃一个月后。除空白组外，在检测前提前1天建模，以生理盐水配成2mg/mL浓度角叉菜胶溶液，根据大鼠的重量，按20mg/kg剂量在大鼠腹腔注射角叉菜胶溶液，诱导大鼠形成血栓模型，空白组注射生理盐水。大鼠在18℃左右饲养，每隔三小时观察大鼠造模情况，12h时观察大鼠尾部出现黑色阴影，形成血栓。
3)检测
溶液的配制
(1)Actin测定试剂(液体)，每瓶10mL(200人份)，开封试剂2-8℃保存不超过7天。
(2)氯化钙溶液(液体)，每瓶15mL，开封试剂2-8℃保存不超过7天。
(3)Dade Citrol质控血浆。用1mL蒸镏水溶解，轻轻混匀，放置15min，用前再次轻轻混匀，才能使用或分装。分装瓶水浴复溶15min后，室温保存2h，2-8℃4h。
(4)PT测定试剂，干粉试剂+4mL水轻轻转动容器，保证干粉完全溶解。复溶后水浴放置30min方可使用，开瓶稳定性15-25℃，不超过2天。
(5)凝血酶试剂，每瓶加1mL蒸镏水溶解(20人份)，复溶试剂2-8℃保存不超过5天。
(6)Owren′s巴比妥绥冲液(pH7.35±0.1)用于标本的稀释，2-8℃贮存到说明书上有效期。
采血与检测
大鼠尾部出现黑色阴影，血栓形成。采血应避免溶血和脂血，大鼠禁食至少8h后可以采血。用4％水合氯醛麻醉大鼠，眼底静脉取血1.5mL，取两次，加入到含(1：9)的枸橼酸钠溶液抗凝真空试管中，并轻轻颠倒5-8次使之充分混匀与抗凝，不得有凝块，并在试管上做好标识。混匀后3000r/min离心10min，分离血浆，通过血液凝固分析仪测定APTT、TT、FIB和PT，采用凝固法检测PT、APTT、TT，采用CLAUSS法检测FIB。之后腹主动脉取血4mL，加入到肝素钠溶液抗凝真空试管中，并轻轻颠倒5-8次使之充分混匀与抗凝，不得有凝块，并在试管上做好标识。混匀后3000r/min离心10min，分离血浆，通过血液流变仪测量血浆粘度、全血粘度等血流变。检测完成后记录相关检测数据。
4)统计学处理
实验数据均以
Figure BDA0003669365040000071
表示，用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用T检验方法来确定各组之间的差异。
5)实验结果
(1)对凝血酶原时间的影响
建立大鼠尾部血栓模型，利用仪器进行测量，对比各组大鼠PT，结果由表1可知。
表1对凝血酶原时间(PT)的影响
Figure BDA0003669365040000081
注：“**”和“*”分别表示与模型组比较极显著(p<0.01)和显著(p<0.05)。
由表1可知，与模型组比较，空白组的凝血酶原时间影响显著(p<0.05)，证明建模有效果；其中黑木耳超微粉组、中浓度组和低浓度组的凝血酶原时间变化影响不显著；阳性药组与高浓度组的凝血酶原时间变化影响极显著(p<0.01)。阳性药及不同浓度多糖均可延长活化部分凝血活酶时间，防止血栓形成。
(2)对活化部分凝血活酶时间的影响
对比各组大鼠APTT，结果由下表2可知。
表2对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响
Figure BDA0003669365040000082
注：“**”和“*”分别表示与模型组比较极显著(p<0.01)和显著(p<0.05)。
由表2可知，与模型组比较，阳性组和高浓度组的活化部分凝血活酶时间影响极显著(p<0.01)，其他组有显著性。阳性药及不同浓度多糖均可延长活化部分凝血活酶时间，防止血栓形成。
(3)对凝血酶时间的影响
对比各组大鼠TT的结果，结果由下表3可知。
表3对凝血酶时间(TT)的影响
Figure BDA0003669365040000091
注：“**”和“*”分别表示与模型组比较极显著(p<0.01)和显著(p<0.05)。
由表3可知，与模型组比较，阳性组和高浓度组对凝血酶时间影响极显著(p<0.01)，其他组有显著性。阳性药及不同浓度多糖均可延长凝血酶时间，起到抗血栓的效果。
(4)对纤维蛋白原的影响
对比各组大鼠FIB，结果由下表4可知。
表4对纤维蛋白原(FIB)的影响
Figure BDA0003669365040000092
Figure BDA0003669365040000101
注：“**”和“*”分别表示与模型组比较极显著(p<0.01)和显著(p<0.05)。
由表4可知，与模型组比较，空白组的纤维蛋白原影响极显著(p<0.01)；阳性药组与中浓度组的纤维蛋白原变化影响显著(p<0.05)；高浓度组的纤维蛋白原变化影响极显著(p<0.01)，纤维蛋白原含量越少，对防止纤维蛋白原形成纤维蛋白，从而形成血栓有明显作用。
本发明的实验增加了黑木耳超微粉多糖200mg/Kg剂量组，而且增加20mg/Kg剂量的阿司匹林对照组，通过制造角叉菜胶血栓模型，采用动物实验研究比较了阴性对照组、阿司匹林阳性组和不同剂量纯化后超微粉多糖的抗血栓、抗血凝活性，实验指标为凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血粘度和血流变指标等，证明提取黑木耳超微粉多糖的必要性，也证明该制备方法所得多糖的效果与阿司匹林相近，是传统制备方法所得多糖达不到的，从而更具有说服力，预防和抑制血栓的效果较好。可为黑木耳超微粉多糖的抗血栓功能研究提供依据，也可为开发新型食品提供指导。

Claims (5)

1.一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.取黑木耳原料，清理表面杂质，迅速冲洗后干燥，并进行粗粉碎和超微粉碎，然后将黑木耳超微粉置于干燥箱中干燥至恒重后置于真空袋中保存；
S2.取步骤S1中的所述黑木耳超微粉加蒸馏水混合分散，并向黑木耳超微粉溶水溶液中加入蜗牛酶进行酶解，使细胞壁温和破裂；
S3.利用响应曲面法优化碱提取条件，对步骤S2溶液中的黑木耳超微粉多糖进行提取，得到黑木耳超微粉多糖提取液；
S4.取步骤S3中的黑木耳超微粉多糖提取液加入烧杯中，在冰浴的条件下缓慢加入硫酸铵，搅拌溶液直至硫酸铵溶解，静置过夜；
S5.对经过步骤S4处理的溶液进行离心，取上层清液；
S6.重复步骤S4和S5的操作，使溶液中硫酸铵浓度分别达到40％、60％、80％，分级盐析除去黑木耳超微粉多糖溶液中的蛋白；
S7.对步骤S6中去除蛋白后的多糖溶液脱色并醇沉过夜、离心；
S8.将经过步骤S7处理后的溶液装入透析袋里，并放入去离子水中透析去除小分子杂质；
S9.对经过步骤S8处理的溶液进行真空浓缩后冷冻干燥；
S10.得到黑木耳超微粉多糖干燥制品。
2.根据权利要求1所述一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：所述步骤S2在酶解时，蜗牛酶的用量为每g黑木耳超微粉加入13mg，酶解时间2.5h，酶解温度为55℃，pH为6.8。
3.根据权利要求1所述一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的最佳提取条件为：提取时间3.6h、提取温度96℃、pH值为12。
4.根据权利要求1所述一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：所述步骤S9中真空浓缩到含水率低于30％时进行冷冻干燥。
5.根据权利要求1所述一种能预防和抑制血栓的黑木耳超微粉多糖制备方法，其特征在于：所述黑木耳超微粉的粒度低于100μm，且平均粒径在10-25μm。
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CN115404252A (zh) * 2022-08-31 2022-11-29 北京北清博育信息技术研究有限公司 一种黑木耳多糖及其应用和制备方法

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