CN1148382C - 组织蛋白酶o2蛋白酶 - Google Patents

组织蛋白酶o2蛋白酶 Download PDF

Info

Publication number
CN1148382C
CN1148382C CNB951968416A CN95196841A CN1148382C CN 1148382 C CN1148382 C CN 1148382C CN B951968416 A CNB951968416 A CN B951968416A CN 95196841 A CN95196841 A CN 95196841A CN 1148382 C CN1148382 C CN 1148382C
Authority
CN
China
Prior art keywords
cathepsin
gly
ser
leu
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB951968416A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1170415A (zh
Inventor
ض�
迪特尔·布罗米
���¿�Ī��
凯瑟琳·奥凯莫特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Axys Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Arris Pharmaceutical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26987129&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1148382(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/330,121 external-priority patent/US5736357A/en
Application filed by Arris Pharmaceutical Corp filed Critical Arris Pharmaceutical Corp
Publication of CN1170415A publication Critical patent/CN1170415A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1148382C publication Critical patent/CN1148382C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及组织蛋白酶O2蛋白、核酸和抗体。

Description

组织蛋白酶O2蛋白酶
本发明涉及组织蛋白酶O2蛋白质、核酸和抗体。
组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族。半胱氨酸或巯基蛋白酶在负责蛋白酶解活性的位点有一个半胱氨酸残基，以及一个组氨酸和一个天冬酰胺。这个超家族在其氧阴离子洞还有一个谷氨酰胺。
最近的工作涉及到与DNA结合的半胱氨酸蛋白酶，其具有推断的转录因子活性(Xu等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)269(33)：21177-21183(1994))，以及作为一种长期的免疫抑制物(Hamjima等，“寄生物免疫学”(Parasite Immunology)16：261(1994))。
到目前为止，已从许多动物中对很多种组织蛋白酶进行了鉴定和测序。例如，已从大鼠(Petanceska等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)267：26038-20643(1992))、牛(Wiederanders等，“欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)286：189-192(1991))和人(Wideranders等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)267：13708-13713(1992)；和Shi等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)267：7258-7262(1992))中克隆了组织蛋白酶S。从人、大鼠、小鼠和鸡中克隆了组织蛋白酶L(Gal等，“生物化学杂志”(Biochem.J.)253：303-306(1988)；Ishidoh等，“欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)223：69-73(1987)；Joseph等，“临床研究杂志”(J.Clin.Invest.)81：1621-1629(1988)；Ritonja等，“欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)283：329-331(1991))。组织蛋白酶H从人和大鼠中得到了克隆(Fuchs等，“Hoppe-Seyler生物化学”(Biol.Chem.Hoppe-Seyler)369-375(1988)；Fuchs等，“核酸研究”(Nucleic Acid Res.)17：9471(1989)；Whittier等，“核酸研究”(Nucleic Acid Res.)15：2515-2535(1987))。从人和小鼠中已克隆了组织蛋白酶B(Ferrara等，“欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)273：195-199(1990))；Chan等，“美国国家科学院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：7721-7725(1986))。
最近从兔破骨细胞克隆了半胱氨酸蛋白酶，它与组织蛋白酶L和S结构上相关(Tezuka等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)269(2)：1106(1994))。
组织蛋白酶天然地存在于各类组织中。例如，组织蛋白酶L存在于心、脑、胎盘、肺、骨胳肌、肾、肝、睾丸和胰腺组织中。组织蛋白酶S存在于肺、肝、脾和骨胳肌中。
组织蛋白酶与许多疾病状况相关。例如，从肿瘤中释放出与组织蛋白酶B和L相似的酶，它们可能与肿瘤的转移有关。组织蛋白酶L出现在病人滑液和转化的组织中。同样地，在损伤和炎症部位观察到来自多形核粒细胞和巨噬细胞的组织蛋白酶B和其他溶酶体蛋白酶的释放。组织蛋白酶牵涉到关节炎，此外还发现在几种肿瘤细胞系中组织蛋白酶的含量异常高。
半胱氨酸蛋白酶还被认为与骨的重建有关。骨重建是骨形成和骨吸收相结合的一个过程，是骨生长的一部分。骨吸收包括胞外基质蛋白的脱矿化和降解(Delaisse等，“生物化学杂志”(Biochem.J.)279：167-174(1991))。I型胶原构成了有机基质的95％(Krane等，在“科学的美国医学”(ScientificAmerican Medicine)，Rubensttein，E.和Federman，D.D.编，Vol.3，“XI骨形成和吸收·15·风湿病”(15 Rheumatism，XI Bone Formation and Resorption)，PP.1-26，Scientific American，Inc.New York)。除了中间胶原酶，溶酶体半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶B和L也被认为与破骨细胞的骨吸收有关(Delaisse等，1991，同上)。这两种酶都存在于溶酶体和酸化的破骨细胞的胞外吸收腔隙中(Goto等“组织化学”(Histochemistry)99，411-414(1993))，并且两种蛋白酶在体外酸性pH下都表现出降解I型胶原的能力(Maciewicz等，“胶原相关研究”(Collagen Rel.Res.)7，295-304(1987)，Delaisse等(1991)，同上)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如E-64和亮抑蛋白酶肽显示出能防止破骨细胞的骨吸收(Delaisse等“骨”(Bone)8，305-313(1987)，Everts等“钙化组织研究”43，172-178(1988))。组织蛋白酶L被认为是骨中与胶原降解相关的一种主要的蛋白酶(Maciewiecz等“生物化学杂志”(Biochem.J.)256，433-440(1988)；Kakegawa等”欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)321，247-250(1993))。
骨质的坚硬是由于羟基磷灰石和其他的磷酸钙骨盐在生理pH下的低溶解度造成的，但在酸性pH下骨会降解。
破骨细胞是在骨吸收中起关键作用的多核细胞。破骨细胞附着在骨表面，在特殊的破骨细胞界膜和骨基质紧密围成的关节内产生一个酸性微环境，因而可产生骨基质的局部溶解。这又加速了脱矿化的骨胶原的蛋白酶解。
半胱氨酸蛋白酶的胶原溶解作用被认为优先产生于pH3.5-4.5左右、靠近皱缘的骨吸收腔隙的酸性最强部分，而含Zn胶原酶在位于脱矿化和矿化基质之间界面的中性环境中较为活跃(Delaisse等，同上，(1991))。除了组织蛋白酶L和B之外，在胶原溶解性骨降解中还有许多组织蛋白酶L和B类似的作用参加。Page等(“生物化学和生物物理学报”(Biochim.Biophys.Acta)1116，57-66(1992))从破骨细胞瘤中分离到组织蛋白酶B的多种形式，它们最适pH为酸性，并能降解可溶的和不可溶的I型胶原。Delaisse等，1991(同上)。鉴定了骨组织中一种70KDa的巯基依赖的蛋白酶，它也能降解I型胶原。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂已被证实可通过抑制胶原纤维的降解而抑制破骨细胞的骨吸收。组织蛋白酶B、L、N和S能在酸性pH条件下降解I型胶原。已从小鼠颅盖中分离到三种组织蛋白酶型的蛋白酶：推断的组织蛋白酶B和L，以及一种类组织蛋白酶L蛋白酶(Delaisse等，“生物化学杂志”(Biochem.J.)279：167(1991))。但至于破骨细胞实际产生的是什么样的半胱氨酸蛋白酶仍不清楚。
最近有几个研究小组独立克隆了编码一种新的人半胱氨酸蛋白酶的cDNA(Shi等“欧洲生物化学联合会快报”(FEBS Lett.)357，129-134(1995)，Inaoka等“生物化学与生物物理研究通讯”(Biochem.Biophys.Res.Commun.)206，89-96(1995)；Bromme和Okamoto，“Hoppe-Seyler生物化学”376，379-384(1995))，并且分别命名为组织蛋白酶O、组织蛋白酶K和组织蛋白酶O2。
本发明的一个目的是提供一类新的重组组织蛋白酶——组织蛋白酶O2和其变体，以及用重组DNA技术产生有用量的组织蛋白酶O2蛋白质。
本发明的再一个目的是提供编码组织蛋白酶O2蛋白的重组核酸，以及含有编码这种组织蛋白酶O2蛋白的核酸的表达载体和宿主细胞。
本发明的另一个目的是为组织蛋白酶O2存在的检测和与组织蛋白酶O2相关疾病的诊断，提供多克隆抗体和单克隆抗体。
本发明进一步的目的是提供生产组织蛋白酶O2蛋白的方法。
根据前述目的，本发明提供了重组的组织蛋白酶O2蛋白，以及编码本发明组织蛋白酶O2蛋白质的分离的或重组的核酸。本发明还提供了包括编码组织蛋白酶O2蛋白质的DNA的表达载体和含有这些表达载体的宿主细胞，其中所述编码组织蛋白酶O2蛋白质的DNA可操作地连接到转录和翻译调节DNA上。
本发明的其他方面提供了生产组织蛋白酶O2蛋白质的方法，其中包括培养用一种表达载体转化过的宿主细胞，使编码这一组织蛋白酶O2蛋白质的核酸进行表达，以产生重组的组织蛋白酶O2蛋白质。
本发明还有一个方面是提供组织蛋白酶O2蛋白质的多克隆抗体和单克隆抗体。
图1A和1B示人组织蛋白酶O2 cDNA的核苷酸序列(序列1)和推断的氨基酸序列(序列2)。氨基酸序列(序列2)以单个字母密码列于核苷酸序列(序列1)下面。活性位点的残基(C25，H159和N175；以木瓜蛋白酶编号)用黑体表示，潜在的N-糖基化位点下划线一次。箭头指示的是位于前信号(presignal)和原区域(proregion)之间以及位于原区域和成熟酶之间的推定的翻译后切割位点。通过蛋白质测序验证位于原区域和成熟蛋白之间的切割(双划线)。
图2A和2B示人的组织蛋白酶O2(序列2)同人组织蛋白酶S(序列4)和L(序列5)和兔0C2(序列3)的多个氨基酸序列比较。*为活性位点残基；黑体打印的为木瓜蛋白酶家族中所有已知半胱氨酸蛋白酶中保守的残基。在所有6种蛋白酶中相同的氨基酸用大写字母在共有序列中指出，而6种蛋白酶中有5种相同的氨基酸用小写字母表示。空缺处以连字符表示。数字指每一行中最后一个氨基酸的位置，箭头示推断的翻译后的酶切位点。
图3示原组织蛋白酶O2与胃蛋白酶一起的成熟。将含原组织蛋白酶O2的小份培养物上清液同胃蛋白酶(0.4mg/ml)一起在40℃下温育于pH4.0的100mM乙酸钠缓冲液中。加入样品缓冲液以终止温育，消化时间如图所示，分子量标准(KDa)示于左侧。
图4示纯化的重组人组织蛋白酶O2的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。泳道1，粗提的Sf9组份；泳道2，经过n-丁基快速流；泳道3，经MonoS，分子量标准示于右侧泳道。
图5示重组人组织蛋白酶O2的pH活性曲线。Kcat/Km值是通过测定Z-FR-MCA水解的起始速度，并除以酶和底物的浓度而获得。
图6示用组织蛋白酶O2、S、L和B水解Z-X-R-MCA的Kcat/Km值(使标准化至最佳底物＝1)。组织蛋白酶O2(Z-LR-MCA)257,900M-1s-1；组织蛋白酶S(Z-LR-MCA)243,000 M-1s-1；组织蛋白酶L(Z-FR-MCA)5,111,000 M-1s-1；组织蛋白酶B(Z-FR-MCA)460,000 M-1s-1(组织蛋白酶S，L和B的资料来自Bromme等，1994)。
图7示重组的人组织蛋白酶O2的弹性蛋白水解活性在pH4.5、5.5和7.0下与组织蛋白酶S和L以及胰弹性蛋白酶相比较。底物为3H标记的不溶性弹性蛋白。
图8示在破骨细胞瘤制剂中人组织蛋白酶O2、L和S的Northern印迹分析。泳道1，患者(纤维性和细胞组织)；泳道2，患者2(细胞组织)；泳道3，患者2(纤维性组织)。用32P标记的人组织蛋白酶O2、L和S的探针进行硝酸纤维素杂交。
图9A和9B示用重组的人组织蛋白酶O2、L和牛胰蛋白酶消化的I型胶原(可溶性小牛皮胶原)的SDS-PAGE。图9A：胶原酶活性：用人的组织蛋白酶O2，S和L(各50nM)在28℃，pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0下消化可溶性小牛皮胶原12小时。加入10μM的E-64终止反应。未经处理的可溶性胶原作为标准(S)。图9B：明胶酶活性：用人组织蛋白酶O2(0.1nM)、组织蛋白酶L(0.2nM)和人组织蛋白酶S(1nM)在28℃，pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0下消化变性(70℃下加热10分钟)的可溶性小牛皮胶原。分子量标准如左侧泳道所示。
图10示人组织蛋白酶O2原初部分纯化的SDS-PAGE。
图11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K和11L示人体组织中人组织蛋白酶O2的免疫组织化学染色。(A)破骨细胞瘤，(B)肺巨噬细胞，(C)细支气管，(D)子宫内膜，(E)胃，(F)结肠，(G)肾，(H)胎盘，(I)肝，(J)卵巢，(K)肾上腺，(L)睾丸。
本发明提供了新的人组织蛋白酶O2蛋白和核酸。
本发明的人组织蛋白酶O2蛋白可通过几种方法鉴定。组织蛋白酶O2核酸或组织蛋白酶O2蛋白质最初是以核酸和/或氨基酸序列与图1所示序列的大致同源性来确定的，这一同源性可依照总的核酸序列或氨基酸序列。
本发明的组织蛋白酶O2蛋白质与其他组织蛋白酶相比同源性有限。例如，成熟的人组织蛋白酶O2与成熟的人组织蛋白酶L之间同源性约为59％，与成熟的人组织蛋白酶S的同源性为58％，与成熟的人组织蛋白酶B的同源性为26％，与成熟的人组织蛋白酶H的同源性为47％。此外，人组织蛋白酶O2的原初部分与人组织蛋白酶L原始部分的同源性为38％，与人组织蛋白酶S原始部分的同源性为51％，与人组织蛋白酶B原初部分的同源性为13％，与人组织蛋白酶H原初部分的同源性为23％。另外，人组织蛋白酶O2蛋白与兔破骨细胞蛋白质的同源性大约为90％。
在此，如果一种蛋白质的序列与图1所示的氨基酸序列相比总的同源性优选大于90％，更优选地大于95％，和最优选地大于98％时，这种蛋白质即为“组织蛋白酶O2蛋白质”。这一同源性将用本领域所知的标准技术进行测定，如按Devereux等在“核酸研究”(Nucl.Acid Res.)12：387-395(1984)中所述的“最适”(Best Fit)测序方案。序列的比较包括在所要比较的序列中引入空缺。此外，对于含有比图1所示蛋白质多或少的氨基酸的序列，同源性百分比被理解为同源性氨基酸数目相对于氨基酸总数的百分比。因此，例如对于以下讨论的短于图1所示序列的同源性，将根据较短一段序列的数目确定。
在一个优选的实施例中，本发明的组织蛋白酶O2蛋白质为人的组织蛋白酶O2蛋白质。
本发明的组织蛋白酶O2蛋白质可短于图1所示的氨基酸序列。如实施例2所示，人组织蛋白酶O2蛋白可经过与组织蛋白酶B和S及木瓜蛋白酶相似的翻译后加工(Bromme等“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)268：4832-4838(1993)；Vemat等“生物化学杂志”(J.Biol.Chem)266：21451-21457(1991)；和Rowan等“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)267：15993-15999(1992))。组织蛋白酶O2蛋白以早期原蛋白形式生成，含有一段常有的前序列，一段原序列或“原初部分”和成熟序列。这些包括前、原和成熟的编码序列的人组织蛋白酶O2示于图1。前序列包括图1中所示的序列中头15个氨基酸，原始部分为第16氨基酸至第114氨基酸(98个氨基酸)，而成熟蛋白则从115位至329位(215个氨基酸)。原序列或原初部分被假定作为该酶的抑制剂，直至该酶被激活，很可能是由于pH值变化的结果。对木瓜蛋白酶(Vernet等，同上)、组织蛋白酶S和组织蛋白酶L来说原初部分的蛋白酶解过程是自我蛋白酶解。组织蛋白酶O2的定义包括前原组织蛋白酶O2、原组织蛋白酶O2、成熟组织蛋白酶O2和独立于成熟组织蛋白酶O2的原初部分。
在一个优选的实施例中，图1所示序列的部分或片段也包括在组织蛋白酶O2蛋白的定义范围内。在一个实施例中片段的长度范围为40-200个氨基酸，优选的片段是与Tezuka等在同上文献中所述的兔破骨细胞蛋白质不一致，而与人组织蛋白酶O2蛋白至少有95-98％同源性。在优选的实施例中，当组织蛋白酶O2蛋白用于产生抗体，如用于诊断目的抗体时，组织蛋白酶O2蛋白必须与图1所示的原初部分或成熟蛋白至少有一个共同表位或决定簇。“表位”或“决定簇”在此指一个蛋白质的一个部分，它能产生和结合一个抗体。因此，在多数情况下，对应于一个较小的组织蛋白酶O2蛋白质产生的抗体能够结合到全长的蛋白质上。在一个优选的实施例中，抗体是对应于一个独特的表位而产生，即该抗体对其他的蛋白质，如其他的组织蛋白酶蛋白质或其他生物的组织蛋白酶不表现交叉反应或交叉反应很弱。
对于核酸，核酸序列总的同源性与氨基酸同源性相当，但要考虑遗传密码的简并和不同生物的密码子偏倚。因此核酸序列的同源性可能会低于或高于蛋白质序列的同源性。因此与图1核酸序列相比，核酸序列的同源性优选为大于65％，更优选为大于75％，最优选为大于85％。在一些实施例中同源性能高达约95％至98％或99％。
在一个实施例中，核酸的同源性是通过杂交试验而测定的。例如，与图1核酸序列在高度严紧条件下杂交的核酸被认为是组织蛋白酶O2基因。高度严紧的条件通常是0.1×SSC，37～65℃。
在另一个实施例中应用了不甚严紧的杂交条件，例如减弱的严紧条件通常为2×SSC和0.1％SDS。
本发明组织蛋白酶O2蛋白和核酸优选为重组体。在此使用的“核酸”可指DNA或RNA，或者同时含有脱氧-和核糖核苷酸的分子。核酸包括基因组DNA、cDNA和寡核苷酸，包含有义和反义核酸。特别是反义核酸包括在核酸的定义内。反义核酸会同图1所示核酸序列的相应的非编码链杂交，但可能会含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。通常反义核酸有防止mRNA表达的功能，这样使组织蛋白酶O2蛋白不能产生。核酸可以是双链、单链，或含有部分双链或单链的序列。
“重组核酸”在此指用内切核酸酶。通过核酸操作在体外最初形成的核酸，这在自然界中是一种不常见的形式。因此，一个分离的线性的组织蛋白酶O2蛋白基因，或者通过连接正常情况下不结合在一起的DNA分子而在体外形成的表达载体，这两者都被认为是用于本发明目的重组体。人们了解，一旦构建了重组的核酸并且再被导入宿主细胞或生物体，它将非重组地复制，即利用缩主细胞体内的细胞结构而非体外操作。但是这些核酸尽管随后是非重组复制，但曾经是以重组产生而来，因而仍然认为是用于本发明目的的重组体。
同样地，“重组蛋白”是用重组技术产生的一种蛋白质，即按上面所示方法通过重组核酸的表达而产生。重组蛋白质至少在一个或多个特征上区别于天然产生的蛋白质。例如，蛋白质可从与该蛋白正常相关联的其野生型宿主中的蛋白质和化合物中的一部分或全部中分离出来。因此，例如那些大致或部分纯化的或者没有细胞时存在的组织蛋白酶O2蛋白被认为是重组体。这一定义包括从一种不同生物或宿主细胞中所含的一种生物中产生组织蛋白酶O2蛋白质。或者通过采用可诱导启动子或高表达启动子可以产生显著高于通常所见到浓度的蛋白质，这样生成的蛋白质浓度增加。或者蛋白质会成为自然界中不常见的一种形式，因为增加了表位标记或者是氨基酸替代、***和缺失。
组织蛋白酶O2蛋白的范围还包括其他生物的组织蛋白酶O2蛋白，其克隆和表达概括如下。
关于反义核酸，其定义为与图1所示的相应的非编码序列全部或部分杂交的核酸。通常用于测定反义杂交的杂交条件是高度严紧的条件，如在0.1×SSC，65℃下。
一旦确定了组织蛋白酶O2蛋白的核酸，就可对其克隆，并且必要时可将其组成部分进行重组而形成整个组织蛋白酶O2蛋白的核酸。一旦从天然来源分离到，如包含在一个质粒中或其他载体中，或者以线性核酸片段的形式从载体中切下来，那么这一重组的组织蛋白酶O2蛋白的核酸可进一步作为探针，鉴定和分离其他组织蛋白酶O2蛋白的核酸。也可将其作为“前体”核酸，以产生经修饰的或异体的组织蛋白酶O2蛋白的核酸和蛋白质。
用编码组织蛋白酶O2蛋白的本发明的核酸，构建了各种不同的表达载体。这些表达载体既可以是自我复制的染色体外的载体，也可以是整合到宿主基因组的载体。通常这些表达载体包括转录和翻译的调节核酸，这些核酸可操作地连接编码组织蛋白酶O2蛋白的核酸。“可操作地连接”在上下文中指转录和翻译调节DNA，相对于组织蛋白酶O2蛋白所处的位置使转录处于起始。通常，这意味着启动子和转录起始或起始序列位于组织蛋白酶O2蛋白编码区的5′端。转录和翻译调节核酸通常对用于表达组织蛋白酶O2蛋白的宿主细胞是合适的，例如，芽孢杆菌属(Bacillus)的转录和翻译调节核酸序列可用于在芽孢杆菌中表达组织蛋白酶O2蛋白。很多类型合适的表达载体和适当的调节序列为本领域所知，可用于各种宿主细胞。
一般地，转录和翻译调节序列可包括，但不限于启动子序列、前导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。在一个优选的实施例中，调节的序列包括一个启动子和转录起始和终止序列。
启动子序列编码组成型或诱导型启动子。启动子既可以是自然出现的启动子，也可以是杂合启动子。结合多于一种启动子因子的杂合启动子，也为本领域所知，也可用于本发明。
此外，表达载体可含有其他因子。例如，表达载体可有两个复制***，因而可使其维持在两个生物体中。例如在哺乳动物或昆虫细胞中表达，而在原核宿主中克隆和扩增。而且，对于整合性表达载体，这种表达载体至少含有一个与宿主细胞基因组同源的序列，优选为两个同源序列位于表达结构的旁侧。这种整合载体可以通过为载体中内含物选择适当的同源序列而使整合载体引导到宿主细胞中特定位点。用于整合载体的结构为本领域所熟知。
此外，在一个优选的实施例中，表达载体含一个可选择的标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选。选择基因为本领域所熟知，并随所用的宿主细胞的不同而变化。
本发明的组织蛋白酶O2蛋白的产生，是通过培养用含有编码组织蛋白酶O2蛋白的核酸的一种表达载体转化的宿主细胞而实现的，培养是在能诱导或导致组织蛋白酶O2蛋白的表达的适当条件下进行。适合于组织蛋白酶O2蛋白表达的条件将随表达载体和宿主细胞选择的不同而不同，很容易为本领域熟练技术人员通过常规的实验而确定。例如，在表达载体中用组成型启动子需要使宿主细胞的生长和增殖最优化，而采用一种诱导型的启动子则需要适合于诱导的生长条件。此外，在一些实施例中，收获的时间是重要的。例如，在昆虫细胞表达中所用的杆状病毒***是裂解性病毒，因而收获时间的选择对产物的得率是关键性的。
合适的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞。使人特别感兴趣的是黑腹果蝇(Drosophila melangaster)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其他酵母、大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、链孢霉属(Neurospora)、BHK、CHO、COS、HeLa细胞和永生化的哺乳动物骨髓和淋巴细胞系。
在一个优选的实施例中，组织蛋白酶O2蛋白质在细菌***中表达，细菌的表达***为本领域所熟知。
合适的细菌启动子是能够结合细菌RNA聚合酶，并能将组织蛋白酶O2蛋白的编码序列在下游(3’)起始转录成mRNA的任意核酸序列。细菌启动子通常在位于接近编码序列5′端有一个转录起始区。这一转录起始区典型的包括一个RNA聚合酶结合位点和一个转录起始位点。编码代谢途径酶的序列提供特别有用的启动子序列。例子包括来源于糖代谢酶的启动子序列，如半乳糖、乳糖和麦芽糖，以及来自生物合成酶的序列，如色氨酸。来源于噬菌体的启动子也可以应用，并且为本领域所知。此外，合成的启动子和杂合启动子也是有用的，例如tac启动子是trp和lac启动子序列的杂合体。而且，一种细菌启动子能包括自然产生的非细菌来源的启动子，这些启动子能结合细菌RNA聚合酶并起始转录。
除了具功能的启动子序列，还需要一个有效的核糖体结合位点。在大肠杆菌(E.coli)中，核糖体的结合位点称为Shine-Delgarno(SD)序列，它包括一个起始密码子和一段位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列。
表达载体也可以包括一段信号肽序列，该序列能使组织蛋白酶O2蛋白在细菌中分泌。这一信号序列典型地编码一段由疏水氨基酸组成的信号肽，该信号肽引导蛋白质从细胞中分泌，这一点为本技术领域所熟知。蛋白质或者分泌到生长的培养基中(***)，或者分泌到位于细胞内膜和外膜之间的壁膜间隙中(革兰氏阴性细菌)。
细菌的表达载体也可以包括一个选择标记基因，以便于选择经过转化的细菌菌株。合适的选择基因包括使细菌对药物，如氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素、四环素产生抗性的基因。选择标记也包括生物合成基因，如组氨酸、色氨酸、和亮氨酸生物合成途径中的基因。
这些组成部分被装配到表达载体中。用于细菌的表达载体为本领域所熟知，包括用于枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(E.coli)、奶油色链球菌(Streptococcus cremoris)、变铅青链球菌(Streptococcus lividans)和其他的一些载体。
细菌的表达载体被转化入细菌宿主细胞是采用本技术领域所熟知的技术，如氯化钙处理、电穿孔法及其他方法。
在一个实施例中，组织蛋白酶O2蛋白生成于昆虫细胞中。用于昆虫细胞转化的表达载体，特别是基于杆状病毒的表达载体是本领域所熟知的。简要地说，杆状病毒是一种能大量产生其外壳蛋白的很大的DNA病毒。由于杆状病毒基因组大小的原因，外源基因必须通过重组置于病毒基因组中。因此，这一表达***的组成包括：一个转移载体，它通常是细菌质粒，同时含有杆状病毒基因组的一个片段和一个用于***组织蛋白酶O2蛋白质的方便的限制性酶切位点；一种野生型的杆状病毒，它带有一段与转移载体中杆状病毒特异性片段同源的序列(这使得异源基因能同源重组到杆状病毒基因组中)；以及合适的昆虫宿主细胞和生长培养基。
哺乳动物表达***也为本领域所知，并且应用于一个实施例中。哺乳动物启动子是能够结合哺乳动物RNA聚合酶，并能将组织蛋白酶O2蛋白的编码序列在下游(3′)起始转录成mRNA的任意DNA序列。启动子将含有一个通常位于靠近编码序列5′端的转录起始区，和位于转录起始位点上游25-30bp处的一个TATA框。TATA框被认为是引导RNA聚合酶II在正确的位点开始RNA合成。一个哺乳动物启动子也含有一个上游启动子因子，通常位于TATA框上游100-200bp之内的部分。上游启动子因子决定转录起始的速率，它能以任意方向起作用。作为哺乳动物启动子特别有用的是来源于哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因常常为高表达的，并且宿主范围广。实施例中包括了SV40早期启动子、小鼠***肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要后期启动子和单纯疱疹病毒启动子。
通常，被哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3′端的调节区，因而这些序列连同启动子因子一起位于编码序列的旁侧。成熟mRNA的3′末端是通过位点特异性翻译后切割和聚腺苷酸化而形成的。转录终止子和聚腺苷酸化信号的例子包括那些源于SV40的终止子和信号。
将外源核酸引入哺乳动物宿主和其他宿主的方法，为本领域所熟知，并且会随所用宿主细胞不同而不同。这些技术包括：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene(1，5二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导的转染、原生质体融合、电穿孔法、脂质体中多核苷酸胶囊化和将DNA直接显微注射入核。
在一个优选的实施例中，组织蛋白酶O2蛋白生成于酵母细胞内。酵母的表达***在本领域内是熟知的，包括用于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白色念球菌(Candida albicans)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳克鲁维氏酵母(K.lactis)、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowia lipolytica的表达载体。用于在酵母中表达的优选启动子序列包括诱导型的GAL1，10启动子、来自醇脱氢酶、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶和酸性磷酸酶基因的启动子。酵母选择标记包括ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和能产生衣霉素抗性的ALG7；能产生抗G418的G418抗性基因；能使酵母生长在有铜离子环境中的CUP1基因。
一种重组的组织蛋白酶O2蛋白质可在细胞内表达或分泌。组织蛋白酶O2蛋白质也可以用本领域所熟知的技术制成融合蛋白。因此，假如所需的表位很小时，可将组织蛋白酶O2蛋白质与一个载体蛋白融合而形成一个免疫原。或者将组织蛋白酶O2蛋白制成融合蛋白以增加表达或者为其他的原因。
包括在本发明的组织蛋白酶O2蛋白限定范围内的还有氨基酸序列的变体。这些变体属于三类中的一种或多种：取代、***或缺失的变体。这些变体通常是在编码组织蛋白酶O2蛋白的DNA中，通过位点特异性核苷酸诱变而制得的，是采用本领域熟知的盒式诱变或其他技术产生编码变体的DNA，随后如上面所概述的在重组细胞培养物中表达DNA。但含有多至约100-150个残基的变异的组织蛋白酶O2蛋白片段，可采用已建立的技术在体外合成而制得。氨基酸序列变体的特点是变体的预定性质，这一特点使它们与组织蛋白酶O2蛋白氨基酸序列自然产生的等位变异或种间变异区分开来。变体通常表现出与自然产生类似物有相同性质的生物学活性，尽管变体也是可以选择的，它们具有修饰过的特性。这一点以下将作更全面的概述。
虽然引入氨基酸序列变异的一个位点或区域是预定的，但突变本身则无需预定。例如，为了优化在某一特定位点突变的性能，在一个靶密码子或靶区域进行随机诱变，并筛选表达的组织蛋白酶O2蛋白变体，作为所需活性的最优化结合。在已知序列的DNA中预定位点产生取代突变的技术是熟知的，例如M13引物诱变。筛选突变体是采用组织蛋白酶O2蛋白活性的测定来进行的；例如可将纯化的或部分纯化的组织蛋白酶O2用于如实施例中所述的动力学试验，以测定氨基酸取代、***或缺失的影响。或者如此文所揭示的，将突变的组织蛋白酶O2基因置于组织蛋白酶O2缺失株中，并测定组织蛋白酶O2活性。对于某一基因序列的缺失株的产生，是本技术领域所知的。
氨基酸的取代典型的为单个残基；***通常在大约1～20个氨基酸，尽管也可以是相当大的***。缺失的范围约为1～30个残基，虽然在有些情况下也允许更大的缺失，例如当组织蛋白酶O2蛋白的原序列或成熟部分缺失时。此外，如上所述，用组织蛋白酶O2蛋白很小的片段产生抗体是可能的。
取代、缺失、***或它们任意的结合可用于获得一个最终的衍生物。通常这种变化出现在几个氨基酸上，以尽量减少分子的改变。但在某些情况下较大的变化是可以允许的。
当需要对组织蛋白酶O2蛋白的特性作小的改变时，通常按下列图表进行取代：
                        图表1
              原始残基           示例性取代基
              Ala                Ser
              Arg                Lys
              Asn                Gln，His
              Asp                Glu
              Cys                Ser
              Gln                Asn
              Glu                Asp
              Gly                Pro
              His                Asn，Gln
              Ile                Leu，Val
              Leu                Ile，Val
              Lys                Arg，Gln，Glu
              Met                Leu，Ile
              Phe                       Met，Leu，Tyr
              Ser                       Thr
              Thr                       Ser
              Trp                       Tyr
              Tyr                       Trp，Phe
              Val                       Ile，Leu
功能上或免疫学特性的重大变化是通过选择比图I所示的取代基保守性较小的取代基而实现的。例如，可以进行取代使其更显著地影响：改变区域的多肽骨架结构，如α-螺旋或β-折叠结构；靶位点分子的电荷或疏水性；或者侧链的体积。通常对多肽性质会产生最大变化的是这样一些取代：(a)亲水性残基，如由丝氨酰或苏氨酰取代了疏水性残基，如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰(或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代了任何其他的残基(或被其取代)；(c)带正电荷侧链的残基，如赖氨酰、精氨酰或组氨酰取代了带负电荷的残基，如谷氨酰或天冬氨酰(或被其取代)；或者(d)含有一个大的侧链的残基，如苯丙氨酸，取代了不带侧链的残基，如甘氨酸(或被其取代)。
虽然变体也是被选择来按所需修饰多肽的特性，但变体通常表现出同样性质的生物学活性，并且同天然形成的类似物一样会引起相同的免疫反应。或者，可以设计变体使其组织蛋白酶O2蛋白的生物学活性发生改变。例如，组织蛋白酶O2蛋白的蛋白酶解活性可以通过取代催化三联体的氨基酸而改变。由第25位的半胱氨酸、第162位的组氨酸和第182位的天冬酰胺组成的催化三联体可以单个地或同时改变，以降低或失去蛋白酶解的活性。这一方法可以降低组织蛋白酶O2服用的毒性。同样地，位于原序列和成熟序列之间的切割位点也可以进行改变，例如，以消除蛋白酶解加工。
在一个优选的实施例中，组织蛋白酶O2蛋白在表达后纯化或分离。组织蛋白酶O2蛋白可以按各种不同的、为本领域熟练的技术人员所知的方法进行分离或纯化，这些方法取决于样品中存在的其他组分。标准的纯化方法包括电泳、分子、免疫学和层析技术，层析技术包括离子交换、疏水、亲和和反相HPLC层析，以及层析聚焦。例如，组织蛋白酶O2蛋白可用一个标准的抗-组织蛋白酶O2抗体柱进行纯化。也可用超滤和渗滤技术，结合蛋白质浓缩。对于恰当的纯化技术的一般性指导，见Scopes.R.的“蛋白质纯化”(Protein Purification)，Springer-Verlag，NY(1982)出版。必需的纯化程度因组织蛋白酶O2蛋白的应用而不同。在某些情况下没有必要进行纯化。
在一些实施例中，组织蛋白酶O2酶被表达为酶原。如实施例中所示，酶原可以按本技术领域所知的方法，用外源的蛋白酶处理而将该酶转变成成熟的具活性形式。合适的外源蛋白酶包括，但不局限于胃蛋白酶和组织蛋白酶D。
一旦需要表达和纯化了组织蛋白酶O2蛋白，它们就可应用于许多方面。
例如，按实施例5所示，本发明的组织蛋白酶O2蛋白具有胶原酶活性。因而组织蛋白酶O2蛋白可用作胶原酶，既可以在体外，也可以在体内使用。例如，组织蛋白酶O2可用于处理那些含有能引起干扰的或产生问题的量的胶原分析样品。
同样地，组织蛋白酶O2蛋白也可用于降解体内过量的胶原。有很多疾病与过量胶原相关。例如，脊椎盘疾病如严重的椎盘发炎和突出的一种治疗涉及到注射胶原酶和糜木瓜蛋白酶以降解盘胶原(Leonardo等，Ann.ChirmGyneacol.82：141-148(1993)；Gogan等“脊椎”(Spine)17：388-94(1992)；Stula，Nerochirurgia 33：169-172(1990)；和Boccanera等，Chir.Organi.Mov.75：25-32(1990))。或者，在治疗粘连，如骨盆粘连、手术后粘连、肺粘连、腹部粘连等等也可以用组织蛋白酶O2进行处理或溶解。同样地，瘢痕和瘢痕瘤也可以用组织蛋白酶O2治疗，以除去或减少出现的过量胶原。此外，子宫内膜异位是另一种临床上重要的疾病，它涉及过量的胶原和其他物质在子宫和周围组织中的沉积；某些形成的子宫内膜异位也可以用本发明的组织蛋白酶O2治疗。
在另一个实施例中，组织蛋白酶O2可以用于溶解肿瘤周围的基质。一般情况下肿瘤pH值低于生理pH，而且如实施例所述，组织蛋白酶O2在酸性pH下具活性，因而，组织蛋白酶O2适用于溶解通常包围肿瘤的基于胶原的基质。
在一个实施例中，本发明的组织蛋白酶O2蛋白也可以治疗固缩骨发育障碍——一种类似于骨硬化病的骨病。这一疾病看来是由破骨细胞半胱氨酸蛋白酶活性不足引起的。在一些实施例中，可通过基因治疗给予组织蛋白酶O2。
此外，由于组织蛋白酶O2在酸性pH下起作用，组织蛋白酶O2可与骨的脱矿化化合物，如酸结合施用，以降解骨组织。因而可治疗骨的异常生长或过量生长。
本发明的组织蛋白酶O2也可用于筛选组织蛋白酶O2蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂有各种不同用途，将为本技术领域所意识到，这其中包括通过与亲和层析柱结合以纯化半胱氨酸蛋白酶，以及同已知的半胱氨酸蛋白酶抑制剂相似的抑制半胱氨酸蛋白酶的作用。另外，半胱氨酸蛋白酶抑制剂可能有治疗作用，因为有许多不同的生理疾病与半胱氨酸蛋白酶量的增加有关，其中包括关节炎、炎症、骨质疏松、肌肉萎缩、肿瘤侵入、多发性骨髓瘤和肾小球性肾炎，这些为本领域所知。
在一个优选的实施例中，组织蛋白酶O2的原初部分可用作组织蛋白酶O2的特异性抑制剂。这样，例如可以将原初部分分开来表达，即不带成熟序列，并将原初部分作为组织蛋白酶O2的一个高度特异的紧密结合抑制物，这一点如实施例3所示。因此，原初部分可以以治疗方式加入含有过量组织蛋白酶O2的样品或组织中；例如按以下所述用于治疗骨的疾病或肿瘤。
在一个实施例中，标记组织蛋白酶O2，并将其用于诊断、定量或确定样品或组织中组织蛋白酶O2的存在。
此外，组织蛋白酶O2蛋白可用于产生针对组织蛋白酶O2蛋白的多克隆和单克隆抗体，它们的作用见以下描述。同样地，组织蛋白酶O2蛋白可以用标准的技术结合到亲和层析柱上。这些柱然后可用于纯化组织蛋白酶O2的抗体。
在一个优选的实施例中，采用本技术领域熟知的技术可产生针对组织蛋白酶O2蛋白的单克隆抗体。如上所述，这种抗体可针对组织蛋白酶O2蛋白的全长产生，或者是针对组织蛋白酶O2蛋白的部分。
在一个优选的实施例中，抗体的产生是针对人组织蛋白酶O2蛋白独特的表位；就是说，这些抗体与针对其他生物的组织蛋白酶O2蛋白所产生的抗体没有交叉反应或反应很弱，这些生物的组织蛋白酶例如来源于兔或大鼠的组织蛋白酶。
这些抗体有很多用途。在一个优选的实施例中，这些抗体被用于诊断在样品或患者存在的组织蛋白酶O2。例如，过量的组织蛋白酶O2蛋白，会存在于破骨细胞相关的疾病和骨病以及肿瘤中，可用这些抗体进行诊断。
同样地，组织蛋白酶O2的高含量与某些卵巢或宫颈瘤有关，其证据为HeLa细胞中组织蛋白酶O2含量高。因而这些类型的肿瘤可以用本发明的抗体进行检测或诊断。
检测组织蛋白酶O2可用本领域熟知的技术；例如，血液或组织样品可从患者获得，用标记的组织蛋白酶O2抗体测定反应性，例如采用象RIA和ELISA那样的标准技术。
在一个实施例中，抗体可以直接或间接标记。“标记的”此处指一个化合物至少含有一个元素、同位素或相连的一个化合物，使得能对该化合物进行检测。通常标记有三类：a)同位素标记，可以是放射性的或重同位素；b)免疫标记，可以是抗体标记或抗原标记；和c)着色染料或荧光染料。标记可掺入化合物的任何位置。这样，例如可以标记组织蛋白酶O2蛋白的抗体用于检测，或者可以制备和标记针对组织蛋白酶O2蛋白抗体的第二抗体。
在一个实施例中，针对本发明组织蛋白酶O2蛋白的抗体用于从一个样品中纯化或分离组织蛋白酶O2蛋白。例如，可以用标准技术将针对组织蛋白酶O2蛋白所产生的抗体与亲和层析柱相结合。这些层析柱可用于从组织样品中提取组织蛋白酶O2蛋白。
最近的工作显示半胱氨酸蛋白酶可用作DNA结合转录因子(Xu等，同上)。在一些实施例中，本发明的组织蛋白酶O2蛋白可用作转录因子。
寄生虫卫并殖吸虫(Paragonimus westermani)最近显示出能表达与半胱氨酸蛋白酶同源的免疫抑制剂(Hamajima等，同上)。事实上，它与本发明的组织蛋白酶O2蛋白的同源性大约为4O％，因而在一个实施例中，组织蛋白酶O2蛋白可用作免疫抑制剂。
在一个优选的实施例中，当组织蛋白酶O2蛋白用于人体时，这种组织蛋白酶O2蛋白为人的组织蛋白酶O2蛋白。这是治疗上的需要，以保证对于使用组织蛋白酶O2的不良免疫反应减小至最低程度。
使用本发明组织蛋白酶O2蛋白可以通过多种方式，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、穿皮、腹膜内、肌内、肺内、***、直肠或眼内方式。
本发明的药物组合物包含一种组织蛋白酶O2蛋白，它以一种适合于给患者使用的形式存在。这一药物组合物可含有以下物质中一种或多种：载体蛋白，如血清白蛋白；缓冲液；填料，如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；结合剂；甜味剂和其他调味剂；着色剂；和聚乙二醇。添加剂是本领域所熟知的，可以按各种不同配方使用。
本发明的药物组合物通常以治疗上有效的剂量来使用，这一剂量可按常规由本领域技术人员确定。
人们认为本发明的人组织蛋白酶O2蛋白有一些特性，它在用于治疗时使人的蛋白比来自其他种的组织蛋白酶O2蛋白更能被接受。特别是来源于其他种的组织蛋白酶O2蛋白的抗原性，在人体中使这些蛋白作为治疗组合物不易被接受；即，来自其他种的组织蛋白酶会在人体中引发不良的免疫反应。
下列实施例用于更全面地描述应用上述发明的方式，以及阐述了实施本发明各方面所预计的最佳模式。人们懂得这些实施例并不用于限定本发明的真正范围，而是作为示例的目的而提出。本文所引用的参考文献被收作本发明的参考。
                           实施例
                           实施例1
                     人组织蛋白酶O2的克隆
除非有其他说明，所有一般性的重组DNA技术按Sambrook等的方法进行(“分子克隆-实验室手册”(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，1989)。
根据已发表的兔破骨素基因序列(Tezuko等，1994)设计2个PCR简并引物：
5′-GGA-TAC-GTT-ACN-CCN-GT-3′(序列8)
5′-GC-CAT-GAG-G/ATA-NCC-3′(序列9)
这些引物用于筛选人脾“快速克隆”的cDNA制备物(Clontech)。分离和纯化一段扩增的450bp片段，并用作cDNA探针用于筛选人脾cDNA文库(Clontech中的gt10)。采用在滤膜上直接重新形成噬斑的技术(Woo，“酶学方法”(Methods Enzymol.)68：389-395(1979))在20张滤膜上对600,000克隆进行筛选。这一技术使得只允许较短处理时间的阳性噬斑的信号放大，因而减弱了背景和假阳性的显现。洗膜采用中等严紧条件：室温下2×SSC，0.1％SDS中洗10分钟，一次，再在68℃下2×SSC，0.1％SDS中洗20分钟，一次。
从两个阳性噬斑中分离噬菌体，并克隆到pBluescript SK+载体(Stratagene)的EcoRI位点。
在ABI 373A型测序仪上对一个阳性克隆进行完全测序；其序列(序列1)示于图1。人组织蛋白酶O2(序列2)、人组织蛋白酶S(序列4)和人组织蛋白酶L(序列5)的序列比较如图2所示。
                         实施例2
                   人组织蛋白酶O2的表达
用标准方法将人组织蛋白酶O2的cDNA克隆到杆状病毒转移载体的多角体蛋白基因中。将编码早期酶原的完全开放读框的cDNA***pVL 1392转移载体(Phar Mingen)的BglII和BamH1位点。重组杆状病毒的产生是将杆状病毒转移载体和线性化的AcNPV基因组DNA(PharMingen)共转染到Sf9细胞中，然后通过同源重组产生重组杆状病毒。在荧光测定底物分析中，按终点稀释测定组织蛋白酶O2的表达，概述如下。
通过噬斑纯化获得病毒(AcNPVCO2)。在Sf900II培养基(Gibco BRL，Grand Island，NY)上培养Sf9细胞至浓度2×106细胞/ml，并在最大氧吸入为1时感染。每隔24小时测定总细胞数和组织蛋白酶O2的细胞活性及分泌活性。3.5天后收获细胞。
发现多数分子量约43KDa的免疫反应性物质在感染细胞内。与培养基中43KDa的单一产物相对照，在细胞提取物中检测到一条额外的44KDa的浅带。推断较大分子量的这条带代表未经加工的早期原组织蛋白酶O2，而43KDa的蛋白质推断是酶原。在刚刚进行细胞裂解后，和自体活化条件下，用Z-RF-MCA合成底物在pH7.5下观察不到活性。自体活化的条件为40℃、pH4.0～4.5之间、二硫苏糖醇的存在条件下。可被E-64抑制的活性在自体活化条件下的增加和pH5.5下进行测定，是由于内源Sf9半胱氨酸蛋白酶的原因(未发表结果)。将人组织蛋白酶B在37℃下，pH4.0和5.5下温育2小时观察不到组织蛋白酶O2前体的加工(资料未显示)。
重组人组织蛋白酶O2的活化、纯化和N-末端测序
细胞内组织蛋白酶O2以无活性的前体形式产生手Sf9细胞内。这种酶在细胞裂解液中如下的还原和酸性条件下被活化。Sf9细胞通过在2000×g下离心从生产培养基中收获，并且在Dounce匀浆器中裂解。将含有无活性的人组织蛋白酶O2前体的细胞裂解液用100mM乙酸钠缓冲液、pH3.75配制成100ml液体，该缓冲液中含有0.5％triton X-100、5mM二硫苏糖醇和2.5mM的Na2EDTA，并将pH调至4.0。通过用胃蛋白酶处理使前体转变成有活性的酶。加入猪胃蛋白酶(Sigma，St.Louis，MO)至终浓度为0.4mg/ml后，将活化混合物在200rpm振荡器中40℃下保温90分钟。活化作用的测定采用Z-FR-MCA(10μM)作为产荧光底物，在pH7.5、100mM Tris/Hcl缓冲液中测定。
组织蛋白酶O2前体通过用胃蛋白酶在pH4.0下处理能有效地转化成成熟具活性的酶。细胞粗提物或浓缩的培养物的培养基上清液的消化，出现了前体随时间的消失和经过36KD中间产物的成熟酶(29KD)的生成(图3)。相应于这一加工过程，观察到在pH7.5下测定的能被E-64抑制的活性增加。
在pH4.5下加入纯化的具活性的组织蛋白酶O2而没有观察到前体的活化作用(数据未显示)，表明了在溶酶体内不可能有组织蛋白酶O2顺式或反式的自体活化作用。这与相关的半胱氨酸蛋白酶，如木瓜蛋白酶和组织蛋白酶S形成了对比。这些酶有一条潜在的自体催化活化途径(Vernet等“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)265：1661-1666(1990)，Bromme等，“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)268：4832-4838(1993))。破骨细胞内组织蛋白酶O2的自然的活化酶可以是天冬氨酰蛋白酶的组织蛋白酶D，它出现于破骨细胞溶酶体中，但少量分泌到吸收腔隙中(Goto等，1993)。
活化的裂解液用2M的Tris碱调至pH7.0，通过在10000×g下离心澄清，上清液用2.5M硫酸氨调至pH5.5。经过16,000×g下离心，澄清的上清液通过超滤(YM10 Amicon)浓缩至50ml，再经10000×g离心，澄清的上清液装在丁基Sepharose 4 Fast Flow(Pharmacia，Sweden)柱上，并用硫酸氨梯度(25mM乙酸缓冲液中2.5M至0M，pH5.5)洗柱。在0M硫酸氨下洗脱活性。然后将收集并且浓缩的部分上FPLC.Mono S柱(Pharmacia，Sweden)，并且在pH5.5、20mM乙酸钠中以线性Nacl梯度(0-2M)洗脱。
电泳中同源的组织蛋白酶O2在1.4M Nacl中洗脱。
1L Sf9细胞培养物(约2×109细胞)的平均产量是大约1mg纯化的酶(表1)
               表1  重组人组织蛋白酶O2a的纯化
    测    定   总蛋白(mg)     总活性(μMol/分钟)    比活性(μMol/mg/分钟)   纯化系数   产率(％)
粗提物b     800     1,753     2.2   1   100
2.5M(NH4)2SO4可溶性部分     276     1,412     5.1   2.3   81
丁基Sepharose 4     2.9     1,143     394   179   65
Mono S     1.1     512     465   211   29
a获自1L Sf9培养物
b经胃蛋白酶活化
纯化的酶为一个单链酶，并且在4-20％Tris/甘氨酸SDS凝胶中还原条件下的表现分子量为29 KDa。用内切糖苷酶H和F以及N-糖苷酶F处理不产生分子量的改变，这表明这一蛋白酶是非糖基化的(数据未显示)。人组织蛋白酶O2在其成熟序列中有两个潜在的糖基化位点。但是，两个位点都有一个脯氨酸残基紧邻着天冬酰胺或苏氨酸，因而它们的利用是不可能的。组织蛋白酶O2还在原初部分含有一个推断的糖基化位点，该位点靠近位于成熟酶和原初部分之间的那个加工位点。同样，经过用内切糖苷酶H和F以及N-糖苷酶F处理，没有观察到酶原的分子量变化。
采用自动化Edman降解法进行NH2-末端测序。成熟蛋白酶的N末端测序揭示了在木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的天然加工位点有一个脯氨酸靠着N末端的丙氨酸(NH2-APDSVDYRKKGYVTPVKN)(序列10)。相比之下，自体催化激活的半胱氨酸蛋白酶常常在加工位点有一段来源于原初部分的3-6个氨基酸的延伸片段(Bromme等，1993)。所计算的成熟的组织蛋白酶O2的分子量为23,495，这似乎是该酶实际的分子量。在相似条件下测定时，胰蛋白酶(24KDa)也表现出同样的表观分子量29KDa。
重组人组织蛋白酶S用杆状病毒表达***进行表达，并按别处所述方法纯化(Bromme和McGraph，未发表结果)。重组人组织蛋白酶L由Dr.Mort惠赠(Shriner残废儿童医院(Shriner′s Hospital for Crippled Children)，Montreal，Quebec)。所有应用的组织蛋白酶为电泳上同源性的，它们的体积克分子浓度按Barrett和Kirschke(1981)的方法用E-64通过活性位点滴定进行测定。
荧光测定酶试验
人组织蛋白酶O2的测定用产荧光的底物Z-FR-MCA(MCA，甲基香豆酰胺)在100mM乙酸钠缓冲液中进行，其中含有2.5mM的二硫苏糖醇和2.5mM EDTA。MCA底物的初始水解速率在1cm的小比色杯中25℃下，以380nm的激发波长和450nm的发射波长进行测定。Z-FR-MCA的浓度是低于标准条件的5μM。
动力学常数Vmax和Km用Enzfitter程序(Leatherbarrow，Enzfitter，ElsevierBiosoft，Cambridge，UK(1987))通过非线性回归分析而获得。
组织蛋白酶O2的抑制试验是在恒定的底物浓度(5μMZ-FR-MCA)和酶浓度(1nM)下，底物试验缓冲液中不同浓度抑制剂存在下进行的。组织蛋白酶O2用抑制剂预保温10分钟，并开始用底物进行反应。测定残基活性并由未抑制速率计算抑制百分比。
                    实施例3
        组织蛋白酶O2的原初部分的克隆和表达
人组织蛋白O2的原初部分用下列引物按标准技术进行PCR扩增：
5′-CTG GAT CCC TGT ACC CTG AGG AGA TAC TG-3′(序列 11)
5′-CTA AGC TTC TAT CTA CCT TCC CAT TCT GGG ATA-3′(序列2)
前区域在pTrc His载体(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)中表达，它包含一串6个组氨酸残基，它们在翻译后蛋白中作为一个金属结合域。这一金属结合域用于在包含于Xpress***蛋白表达盒中Invitrogen′sProBond树脂上进行组织蛋白酶O2的原初部分的纯化。一块纯化的原初部分的凝胶如图10所示。
纯化的原初部分抑制亲化酶，其Ki值为0.1nM。
                       实施例4
          人组织蛋白酶O2的抗体和免疫组织化学。
在新西兰白兔中制备针对人组织蛋白酶O2的酶原。用Pfu DNA聚合酶(Promega)由早期酶原序列的制备物通过PCR扩增编码酶原的cDNA。所用的引物是根据带有Nhe I位点的酶原的5′端和带有Bam HI位点的3′端而合成。人组织蛋白酶O2在大肠杆菌(BL 21(DE3))中含有来自Novagen的pET11C载体中克隆和表达。用0.4mM IPTG在OD 600＝0.6下诱导表达，在诱导后2小时收获细胞。收获后，表达的蛋白质在Novex 12％Tris-甘氨酸SDS凝胶上电泳，然后进行考马斯染色并脱色。将经N-末端测序证实的组织蛋白酶O2的酶原带切割下来。将蛋白质从凝胶条上电洗脱下来，并在用1×的洗脱缓冲液预处理过的Centricon 10上浓缩。将抗原用1×PBS加至1ml，用于免疫接种(EL Labs，Soguel，CA)。
抗体用丙酮制粉从全血清中纯化出来，制成经诱导的培养物BL21(DE3)，并通过亲和结合将抗原洗脱至硝酸纤维素上。纯化的抗体对于人组织蛋白酶O2酶原、原初部分和成熟酶具特异性，而在1∶2000稀释后Western印迹分析中与人组织蛋白酶S、L和B不存在交叉反应。
用现有方法(Cattoretti等，1992)制备***固定和石蜡包埋的人组织切片(Biogenex，San Ramon，CA)，并按照Str AviGen检测***(Biogenex)用对照兔IgG或亲和纯化的抗组织蛋白酶O2抗体染色。切片用Mayer氏苏木精复染。
破骨细胞的免疫染色显示了多核破骨细胞强的特异性染色，而基质细胞不显反应(图11)。也观察到出生前人骨中破骨细胞浓的免疫组织化学染色(资料未显示)。在肺部，有两个部位能检测到组织蛋白酶O2；第一个是肺泡的巨噬细胞(11)第二个是在支气管上皮细胞。组织蛋白酶O2还发现于胃腺的上皮细胞、结肠中的肠腺、肾的邻近小管和远侧小管以及子宫内膜中子宫腺体的上皮。而且，肝脏中的枯否细胞以及睾丸中的生***表现出对组织蛋白酶O2深的染色。在肾上腺皮质、卵巢和胎盘中观察到较为一致的染色(图11)。
同样地，抗电泳上同源的人组织蛋白酶O2的原初部分的多克隆抗体也在新西兰白兔中制备。用标准技术制备针对原初部分、组织蛋白酶O2酶原和成熟组织蛋白酶O2的单克隆抗体。
                    实施例5
              人组织蛋白酶O2的特性
下列实验用部分纯化的实施例2的人组织蛋白酶O2进行。
重组人组织蛋白酶O2的pH活性曲线和pH稳定性。
组织蛋白酶O2的pH稳定性测定是通过将具活性的蛋白酶温育于25℃、不同pH值下，在5mM二硫苏糖醇和5mM EDTA存在下进行。残基的活性测定采用上述荧光测定底物试验法在不同时间间隔进行。
底物水解的起始速率如上述方法进行测定。人组织蛋白酶O2的pH活性曲线是在1μM底物(Z-FR-MCA)浓度([S]＜＜Km，其中起始速率Vo直接与Kcat/Km值成正比)下得到的。下列缓冲液用于pH活性曲线测定：100mM柠檬酸钠(pH2.8-5.6)和100mM磷酸钠(pH5.8-8.0)。所有缓冲液含有1mM EDTA和0.4M Nacl，以减小离子强度的变化。三质子化模型(Khouri等“生物化学”(Biochem.)30：8929-8936(1991))用于pH活性数据的最小二次回归分析。数据附合下列等式。
(Kcat/Km)obs＝(Kcat/Km)/([H+]/K1+1+K2/[H+])
组织蛋白酶O2、S、L的pH稳定性在三个不同的pH值下进行研究。重组的人组织蛋白酶O2、S和L温育于37℃下pH5.5的100mM乙酸钠缓冲液、pH6.5的100mM磷酸钾缓冲液、pH7.5的100mM Tris/Hcl，含5mM二硫苏糖醇和2.5mM EDTA。温育0.5、1、2和4小时后，用5μM的Z-FR-MCA测定组织蛋白酶O2(100mM磷酸钾缓冲液，pH6.5)和组织蛋白酶L(100mM乙酸钠缓冲液，pH5.5)剩余的活性，用5μM的Z-VVR-MCA测定组织蛋白酶S(100mM磷酸钾缓冲液，pH6.5)的剩余活性。
pH活性曲线是酶功能和结构统一性的敏感量度。比较不同的但相关的蛋白酶的pH曲线显示在这些蛋白酶的内在活性和稳定性方面有差异。人组织蛋白酶O2显示出铃状的pH曲线，两侧的pK值为4.0和8.13(表2；图5)。
                          表2
重组人组织蛋白酶O2 pH活性曲线的pK值与所述的组织蛋白酶S、L
和木瓜蛋白酶的pK值比较
    蛋白酶     PK1’     PK1     PK2   最适pH
人组织蛋白酶O2   3.43±0.05  4.00±0.02  8.13±0.01     6.1
人组织蛋白酶Sb  4.49±0.03  7.82±0.03     6.1
人组织蛋白酶Lb   3.33±0.14  4.22±0.28  6.95±0.09     5.6
木瓜蛋白酶c   3.58±0.29  4.54±0.29  8.45±0.02     6.5
a从(PK1+PK2)/2计算而来
b来自Bromme等，1993，同上
c来自Khouri等，1991，同上.
人组织蛋白酶O2的最适pH值在6.0-6.5之间，与所观察到的组织蛋白酶S的值相近(Bromme等，同上，1993)。反映离子对稳定性的pH曲线的宽度(Menard等，“生物化学”(Biochem.)30：5531-5538(1991))在组织蛋白酶O2是4.15，而在组织蛋白酶S为3.35(Bromme等，1993，同上)。人组织蛋白酶O2的这一参数更接近于所观察到的非常稳定的木瓜蛋白酶的值，后者曲线宽度为3.91(Khouri等，同上，1991)。
人组织蛋白酶O2在微酸性至中性pH值下比组织蛋白酶L稳定，但不如组织蛋白酶S稳定(表3)。
                        表3
37℃下重组人组织蛋白酶O2与重组人组织蛋白酶S和L的pH稳定性比较
    蛋白酶 保温时间(hr)          残余活性(％)pH5.5                   pH6.5        pH7.5
组织蛋白酶O2     0.5124     91887052     85492215     11000
组织蛋白酶S     0.5124     100959283     1001009471     91726160
组织蛋白酶L     0.5124     87787151     12300     0000
组织蛋白酶O2在37℃pH6.5下经过1小时剩余活性约为50％，而在相同条件下基本上观察不到组织蛋白酶L活性。
但是必须考虑到测定pH稳定性时没有底物保护，底物保护通常会增加pH稳定性。在用组织蛋白酶O2进行3H弹性蛋白降解试验中，在pH7.0下经过2小时仍能观察到溶液化的3H片段的增加。
重组人组织蛋白酶O2的抑制物曲线
在荧光测定酶试验(见前面描述)中向纯化的酶中加入抑制剂，以测定蛋白酶类特异性抑制剂对组织蛋白酶O2的抑制效果。
人组织蛋白酶O2表现出半胱氨酸蛋白酶典型的抑制物曲线。它受半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制，并受半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶两者的抑制剂所抑制(表4)。在0.1μM以上浓度，肽醛、重氮甲烷、E-64和鸡半胱氨酸肽酶抑制物完全抑制酶活性。另一方面，特异性的丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶抑制剂不影响酶活性。没有观察到4mM浓度的EDTA对组织蛋白酶O2活性的影响。浓度较高(＞5mM)时观察到部分非特异性抑制。
           表4重组人组织蛋白酶O2的抑制剂特性
  抑制剂 抑制剂浓度 抑制作用(％)
丝氨酸蛋白酶抑制剂   PMSFBefablockDCl   1mM0.2mM0.1mM     000
丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂   亮肽素抑糜酶素Calpeptin   0.05μM0.05μM0.1μM     8564100
天冬氨酸蛋白酶抑制剂   胃蛋白酶抑制剂   0.1μM     0
金属蛋白酶抑制剂   EDTA   4mM     0
半胱氨酸蛋白酶抑制剂   乙酸碘Z-FF-CHN2Z-FA-CHN2E-64鸡半胱氨酸   50μM0.1μM0.1μM0.1μM0.1μM     6090100100100
组织蛋白酶O2活性只被半胱氨酸蛋白酶的特异性抑制剂抑制。
重组人组织蛋白酶O2的底物特异性
用前面所述的底物试验测定针对合成底物的底物特异性。
用Z-X-R-MCA类型的合成底物确定人组织蛋白酶O2的S2P2特异性，其中的X等同于F、L、V或R。半胱氨酸蛋白酶的S2亚位点小域在结构上明确，并且决定了这一类蛋白酶的主要特异性。例如，组织蛋白酶B在S2亚位点小域的底部有一个谷氨酸(E245)残基，它有利于结合象精氨酸那样的碱性残基。这一谷氨酸残基在所有其他已知的人组织蛋白酶中被中性残基所替代，导致Z-R-R-MCA底物非常低的水解率。组织蛋白酶O2的第205位含有一个亮氨酸残基，使Z-R-R-MCA成为一个很不好的底物(图6)。组织蛋白酶O2对P2残基的特异性与组织蛋白酶S的相似。这两种酶在这一位置相对于苯丙氨酸优选为亮氨酸，而组织蛋白酶的特征为反向特异性(表5，图6)。P2位置的缬氨酸能被组织蛋白酶O2相对较好地接受，而在P2中出现的带β-支链的这种残基使之成为不适于组织蛋白酶L、S和B的底物。
                                 表5
        重组人组织蛋白酶O2催化的Z-X-R-MCA水解的动力学参数
    底物    Kcat(S-1)   Km(μM)    KcatKm(M-1S-1)
Z-FR-MCA    0.90±0.20   7.5±3.4     120,000
Z-LR-MCA    0.98±0.39   3.8±0.8     257,900
Z-VR-MCA    1.06±0.16   13.1±5.6     80,900
Z-RR-MCA    0.0005±0.0002   23±4     22
Z-VVR-MCA    0.01±0.004   18.5±1.5     540
Z-LLR-MCA    0.02±0.008   0.4±0.1     50,000
为计算动力学参数Kcat和Km，通常在9-11个不同的底物浓度下获得起始速率，使结果符合公式(I)。通过用E-64滴定活性位点以测定酶浓度(Kinder等，“生物化学杂志”(Biochem.J.)201：367-372(1982))。
V = K cat × EO × [ s ] ( K m + [ s ] ) 公式(I)
组织蛋白酶O2对二肽底物的催化效率(Kcat/Km)与组织蛋白酶S和B的值相近，但比组织蛋白酶L的值小大约1个数量级。有趣的是组织蛋白酶O2的Km值与所测的组织蛋白酶L的值相近。Km值在一定程度上反映出底物与蛋白酶的亲和性。这一趋势对三肽底物Z-LLR-MCA甚至更为明显，其Km值低至4×10-7M(表5)。但是与组织蛋白酶S和L形成对照的是组织蛋白酶O2的Kcat值几乎要小两个数量级，这可能反映了它的无效结合。
重组的人组织蛋白酶O2对细胞外基质蛋白的活性
如所述方法(Banda等“酶学方法”(Methods Enzymol.)144，288-305(1987))制备[3H]弹性蛋白，其比活性为113,000cpm/mg蛋白。将弹性蛋白(2mg)温育于含有2.5mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05％Triton X-100的1ml缓冲液中，以进行组织蛋白酶O2、S和L的测定。经10、20、30、50、90、120和180分钟取小份样品，在14,000×g下离心1分钟，并用液体闪烁计数仪(1450 Microbeta Plus，Wallac/Pharmacia)在含有闪烁液的24孔板中计数。在弹性蛋白降解试验中人组织蛋白酶O2、S和L和牛弹性蛋白酶的浓度分别为65nM、28nM、80nM和80nM。为了测定pH对蛋白酶活性的影响，在pH4.5和5.5(乙酸钠100mM、二硫苏糖醇和EDTA各2.5mM。Triton X-100 0.05％)，以及pH 7.0(Tris/HCl 100mM，二硫苏糖醇和EDTA各2.5mM、Triton X-100 0.05％)下进行消化。除了在温育混合物中不加二硫苏糖醇和EDTA而其他条件相同情况下，测定牛胰弹性蛋白酶(Boehringer，Mannheim，IN)。
在pH5.5下观察到最大活性。组织蛋白酶O2在pH4.5-7.0之间有一个高于组织蛋白酶S1.7-3.5倍的弹性蛋白酶解活性。这一弹性蛋白酶解活性在组织蛋白酶L的最适pH(pH5.5)和中性pH下，与组织蛋白酶L和胰弹性蛋白酶相比活性大约分别高9倍和2.4倍(图7)。测定的组织蛋白酶L和S的值与已发表资料(Kirschke等，“蛋白酶解和蛋白质周转”(Proteolysis and ProteinTurnover(Bond，J.S.和Barrett，A.J.编)pp.33-37，Portland出版社，London和Chapel Hill(1993)，Kirschke和Wiederanders，“酶学方法”(Methods Enzymol.)244，500-511(1994))十分吻合。
将可溶性小牛皮I型胶原以0.4mg/ml稀释于含2mM二硫苏糖醇/2mMEDTA的100mM乙酸钠，pH4.5、5.0、5.5，100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0、6.5，和100mM Tris/HCl，pH7.0中。人组织蛋白酶O2、S、L和牛胰蛋白酶(Sigma)保温于28℃100nM的酶浓度下10小时。为测定组织蛋白酶O2和S的胶原活性，在用蛋白酶温育之前将I型胶原在70℃下加热10分钟。反应混合物在含有1nM蛋白酶下28℃温育30分钟。样品用4-20％的Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)进行SDS聚丙烯酰胺电泳。
组织蛋白酶O2在28℃、pH5.0和6.0之间能充分降解I型胶原，而在pH4.5和pH7.0其降解作用显著减弱(图9a)。主要的酶切似乎发生于端肽区域，因为从β和γ组分中释放的α单体要稍小一些。在α单体内也可能发生其他的酶切。还不清楚酶切是在完整的螺旋区还是在松散的α单体中。经组织蛋白酶O2作用后观察到的I型胶原的主要片段大小为70-80KDa。组织蛋白酶L也酶切端肽区，但实际上未检测到小分子量的片段。组织蛋白酶L的胶原酶解活性的有效pH范围，与组织蛋白酶O2(pH4.0和5.5之间)相比更偏酸性。组织蛋白酶S似乎只显示非常弱的胶原酶解活性。与之对照，组织胶原酶将α单体酶切成3/4和1/4片段(Gross和Nagai，“美国国家科学院院报”(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)54，1197-1204(1965))。胰蛋白酶与组织蛋白酶O2相比在相等酶浓度下没有观察到I型胶原的降解，这表明胶原的三重螺旋的完整性没有受到破坏(资料未显示)。
除了组织蛋白酶O2的胶原酶活性，它还显示出很强的明胶酶活性。在0.1nM的酶浓度下，变性的胶原在pH5.0至7.0范围内30分钟内完全降解。相反，组织蛋白酶L只在pH范围4.5-5.5之间表现出明胶酶活性(图6b)。组织蛋白酶S在pH4.0-7.0之间有活性，但比组织蛋白酶O2和L的活性明显要弱。
组织蛋白酶的相对弹性蛋白酶解活性与牛胰弹性蛋白酶的比较
    蛋白酶     pH4.5mg/min/μmol酶     pH5.5mg/min/μmol酶     pH7.0mg/min/μmol酶
组织蛋白酶O2     245     286     170
组织蛋白酶L     18     32     0
组织蛋白酶S     146     102     55
胰弹性蛋白酶     8     18     79
人组织蛋白酶O2信息含量的组织分布
通过Northern印迹，用适当的人体酶的cDNA探针测定人组织蛋白酶O2、L和S信息含量的组织分布。探针长约450bp，包括了编码活性位点半胱氨酸-25残基(按木瓜蛋白酶编号)和天冬氨酸-175之间残基的一段区域。图8示人组织蛋白酶O2的Northern印迹。如图8所示，人破骨细胞瘤制备物中信息含量表明：与组织蛋白酶L相比，组织蛋白酶O2的表达要高很多倍。
人组织蛋白酶O2mRRNA的组织分布表明它与组织蛋白酶L有一些相似，但前者的组织浓度在多数器官(心脏、胎盘、肺、胰腺和肾)中似乎明显要低。另一方面，人组织蛋白酶O2在人体组织和细胞系中分布与人组织蛋白酶L和S相比，表现出显著差异。组织蛋白酶O2在卵巢、小肠和结肠中有很高的转录含量，但在肝中没有信息，而肝中富含组织蛋白酶L。组织蛋白酶O2也见于HeLa细胞中。
        组织和细胞系分布(Northern印迹)
组织    HCATO     HCATL   HCATS
心     xx     xxxx     -
脑     -     x     -
胎盘     xx     xxxx     xx
肺     xx     xxx     xxx
肝     -     xxxx     xx
骨胳肌     xx     xx     -
肾     x     xxxx     -
胰腺     x     xx     -
脾     x     -     x
胸腺     x     x     -
***     x     x     -
睾丸     x     xx     -
卵巢     xxx     x     -
小肠     xx     -     -
结肠     xxx     x     -
白细胞     -     -     xxx
早幼粒细胞，白血病HL-60     -     -     x
HeLa S3     xx     x     x
成淋巴细胞，白血病MOLT-4     -     xx     x
Burkitt淋巴瘤Raji     -     -     x
colect.腺癌     -     x     -
肺癌A549     -     xxxx     x
黑素瘤G361     -     xxxxx     -
                                     序列表
(1)一般资料：
    (i)申请人：Khepri制药公司(Khepri Pharmaceuticals，Inc.)
    (ii)发明名称：组织蛋白酶O2蛋白酶
    (iii)序列数目：12
    (iv)通讯地址：
        (A)收件人：Flehr，Hohbach，Test，Albritton & Herbert
        (B)街道：Four Embarcadero Center Suite 3400
        (C)城市：旧金山
        (D)州：加利福尼亚
        (E)国家：美国
        (F)邮编：94111-4187
(v)计算机可读形式：
        (A)媒介类型：软盘
        (B)计算机：IBM PC兼容
        (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
        (D)软件：Patent In Release # 1.0，版本 # 1.30
(vi)当前申请资料：
        (A)申请号：PCT/US95
        (B)申请日：26-10-1995
        (C)分类：
(vii)优先权申请资料：
        (A)申请号：US未知
        (B)申请日：02-10-1995
(vii)优先权申请资料：
        (A)申请号：US 08/330,121
        (B)申请日：27-10-1994
(viii)律师/代理人资料：
        (A)姓名：Silva，Robin M.
        (B)注册号：38，304
    (C)文献/档案号：FP-60261-1-PC/DJB/RMS
(ix)通讯资料：
    (A)电话：(415)781-1989
    (B)传真：(415)398-3249
    (C)电传：910-277299
(2)序列1资料：
(i)序列特征：
    (A)长度1482碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(ix)特点：
    (A)名称/要点：CDS
    (B)位置：142..1128
(xi)序列描述：序列1：
GCGCACTCAC AGTCGCAACC TTTCCCCTTC CTGACTTCCC GCTGACTTCC GCAATCCCGA       60
TGGAATAAAT CTAGCACCCC TGATGGTGTG CCCACACTTT GCTGCCGAAA CGAAGCCAGA       120
CAACAGATTT CCATCAGCAG C ATG TGG GGG CTC AAG GTT CTG CTG CTA CCT         171
                        Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro
                          1               5                  10
GTG GTG AGC TTT GCT CTG TAC CCT GAG GAG ATA CTG GAC ACC CAC TGG         219
Val Val Ser Phe Ala Leu Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp
                 15                  20                  25
GAG CTA TGG AAG AAG ACC CAC AGG AAG CAA TAT AAC AAC AAG GTG GAT         267
Glu Leu Trp Lys Lys Thr His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp
             30                  35                  40
GAA ATC TCT CGG CGT TTA ATT TGG GAA AAA AAC CTG AAG TAT ATT TCC         315
Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser
         45                  50                  55
ATC CAT AAC CTT GAG GCT TCT CTT GGT GTC CAT ACA TAT GAA CTG GCT         363
Ile His Asn Leu Glu Ala Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala
     60                  65                  70
ATG AAC CAC CTG GGG GAC ATG ACC AGT GAA GAG GTG GTT CAG AAG ATG         411
Met Asn His Leu Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met
 75                  80                  85                  90
ACT GGA CTC AAA GTA CCC CTG TCT CAT TCC CGC AGT AAT GAC ACC CTT         459
Thr Gly Leu Lys Val Pro Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr Leu
                 95                 100                 105
TAT ATC CCA GAA TGG GAA GGT AGA GCC CCA GAC TCT GTC GAC TAT CGA         507
Tyr Ile Pro Glu Trp Glu Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg
            110                 115                 120
AAG AAA GGA TAT GTT ACT CCT GTC AAA AAT CAG GGT CAG TGT GGT TCC        555
Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser
        125                 130                 135
TGT TGG GCT TTT AGC TCT GTG GGT GCC CTG GAG GGC CAA CTC AAG AAG        603
Cys Trp Ala Phe Ser Ser Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys
    140                 145                 150
AAA ACT GGC AAA CTC TTA AAT CTG AGT CCC CAG AAC CTA GTG GAT TGT        651
Lys Thr Gly Lys Leu Leu Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys
155                 160                 165                 170
GTG TCT GAG AAT GAT GGC TGT GGA GGG GGC TAC ATG ACC AAT GCC TTC        699
Val Ser Glu Asn Asp Gly Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe
                175                 180                 185
CAA TAT GTG CAG AAG AAC CGG GGT ATT GAC TCT GAA GAT GCC TAC CCA        747
Gln Tyr Val Gln Lys Asn Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro
            190                 195                 200
TAT GTG GGA CAG GAA GAG AGT TGT ATG TAC AAC CCA ACA GGC AAG GCA        795
Tyr Val Gly Gln Glu Glu Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala
        205                 210                 215
GCT AAA TGC AGA GGG TAC AGA GAG ATC CCC GAG GGG AAT GAG AAA GCC        843
Ala Lys Cys Arg Gly Tyr Arg Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala
    220                 225                 230
CTG AAG AGG GCA GTG GCC CGA GTG GGA CCT GTC TCT GTG GCC ATT GAT        891
Leu Lys Arg Ala Val Ala Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp
235                 240                 245                 250
GCA AGC CTG ACC TCC TTC CAG TTT TAC AGC AAA GGT GTG TAT TAT GAT        939
Ala Ser Leu Thr Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp
                255                 260                 265
GAA AGC TGC AAT AGC GAT AAT CTG AAC CAT GCG GTT TTG GCA GTG GGA        987
Glu Ser Cys Asn Ser Asp Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly
            270                 275                 280
TAT GGA ATC CAG AAG GGA AAC AAG CAC TGG ATA ATT AAA AAC AGC TGG        1035
Tyr Gly Ile Gln Lys Gly Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp
        285                 290                 295
GGA GAA AAC TGG GGA AAC AAA GGA TAT ATC CTC ATG GCT CGA AAT AAG        1083
Gly Glu Asn Trp Gly Asn Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys
    300                 305                 310
AAC AAC GCC TGT GGC ATT GCC AAC CTG GCC AGC TTC CCC AAG ATG            1128
Asn Asn Ala Cys Gly Ile Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met
315                 320                 325
TGACTCCAGC CAGCCAAATC CATCCTGCTC TTCCATTTCT TCCACGATGG TGCAGTGTAA      1188
CGATGCACTT TGGAAGGGAG TTGGTGTGCT ATTTTTGAAG CAGATGTGGT GATACTGAGA      1248
TTGTCTGTTC AGTTTCCCCA TTTGTTTGTG CTTCAAATGA TCCTTCCTAC TTTGCTTCTC      1308
TCCACCCATG ACCTTTTTCA CTGTGGCCAT CAGGACTTTC CCTGACAGCT GTGTACTCTT      1368
AGGCTAAGAG ATGTGACTAC AGCCTGCCCC TGACTGTGTT GTCCCAGGGC TGATGCTGTA      1428
CAGGTACAGG CTGGAGATTT TCACATAGGT TAGATTCTCA TTCACGGGAC CCGG            1482
(2)序列2资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：329氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列2
Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu
  1               5                  10                 15
Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr
             20                  25                  30
His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu
         35                  40                  45
Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala
     50                  55                  60
Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp
 65                  70                  75                  80
Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro
                 85                  90                  95
Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu
            100                 105                 110
Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr
        115                 120                 125
Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser
    130                 135                 140
Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn
            180                 185                 190
Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu
        195                 200                 205
Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr
    210                 215                 220
Arg Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala
225                 230                 235                 240
Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe
                245                 250                 255
Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Ser Asp
            260                 265                 270
Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly
        275                 280                 285
Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asn
    290                 295                 300
Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile
305                 310                 315                 320
Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met
                325
(2)序列3资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：329氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列3
Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu
1               5                   10                  15
His Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr Gln Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr
            20                  25                  30
Tyr Ser Lys Gln Tyr Asn Ser Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu
        35                  40                  45
Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys His Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala
    50                  55                  60
Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp
65                  70                  75                  80
Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro
                85                  90                  95
Pro Ser Arg Ser His Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Asp Trp Glu
            100                 105                 110
Gly Arg Thr Pro Asp Ser Ile Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr
        115                 120                 125
Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser
    130                 135                 140
Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Tyr Gly
                165                 170                 175
Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Arg Asn
            180                 185                 190
Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Asp Glu
        195                 200                 205
Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr
    210                 215                 220
Arg Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala
225                 230                 235                 240
Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala ser Leu Thr Ser Phe
                245                 250                 255
Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Asn Cys Ser Ser Asp
            260                 265                 270
Asn Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly
        275                 280                 285
Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Ser Trp Gly Asn
    290                 295                 300
Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile
305                 310                 315                 320
Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met
                325
(2)序列4资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：331氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：序列4
Met Lys Arg Leu Val Cys Val Leu Leu Val Cys Ser Ser Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Gln Leu His Lys Asp Pro Thr Leu Asp His His Trp His Leu Trp Lys
            20                  25                  30
Lys Thr Tyr Gly Lys Gln Tyr Lys Glu Lys Asn Glu Glu Ala Val Arg
        35                  40                  45
Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Phe Val Met Leu His Asn Leu
    50                  55                  60
Glu His Ser Met Gly Met His Ser Tyr Asp Leu Gly Met Asn His Leu
65                  70                  75                  80
Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Met Ser Leu Met Ser Ser Leu Arg
                85                  90                  95
Val Pro Ser Gln Trp Gln Ar9 Asn Ile Thr Tyr Lys Ser Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Arg Ile Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Cys Val Thr
        115                 120                 125
Glu Val Lys Tyr Gln Gly Ser Cys Gly Ala Cys Trp Ala Phe Ser Ala
    130                 135                 140
Val Gly Ala Leu Glu Ala Gln Leu Lys Leu Lys Thr Gly Lys Leu Val
145                 150                 155                 160
Ser Leu Ser Ala Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Thr Glu Lys Tyr Gly
                165                 170                 175
Asn Lys Gly Cys Asn Gly Gly Phe Met Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Ile
            180                 185                 190
Ile Asp Asn Lys Gly Ile Asp Ser Asp Ala Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala
        195                 200                 205
Met Asp Gln Lys Cys Gln Tyr Asp Ser Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Cys
    210                 215                 220
Ser Lys Tyr Thr Glu Leu Pro Tyr Gly Arg Glu Val Asp Leu Lys Glu
225                 230                 235                 240
Ala Val Ala Asn Lys Gly Pro Val Ser Val Gly Val Asp Ala Arg His
                245                 250                 255
Pro Ser Phe Phe Leu Tyr Arg Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Ser Cys
            260                 265                 270
Thr Gln Asn Val Asn His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Asp Leu
        275                 280                 285
Asn Gly Lys Glu Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly His Asn Phe
    290                 295                 300
Gly Glu Glu Gly Tyr Ile Arg Met Ala Arg Asn Lys Gly Asn His Cys
305                 310                 315                 320
Gly Ile Ala Ser Phe Pro Ser Tyr Pro Glu Ile
                325                 330
(2)序列5资料：
   (i)序列特征：
      (A)长度：333氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：未知
      (D)拓扑结构：未知
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：序列5
Met Asn Pro Thr Leu Ile Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala Gln Trp Thr Lys Trp
            20                  25                  30
Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn Glu Glu Gly Trp Arg
        35                  40                  45
Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gln
    50                  55                  60
Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe
65                  70                  75                  80
Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln
                85                  90                  95
Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe Tyr
            100                 105                 110
Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro
        115                 120                 125
Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr
    130                 135                 140
Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu
                165                 170                 175
Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp
            180                 185                 190
Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu
        195                 200                 205
Glu Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly
    210                 215                 220
Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala
225                 230                 235                 240
Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu
            260                 265                  270
Asp Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr
        275                 280                 285
Glu Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu
    290                 295                 300
Glu Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn
305                 310                 315                 320
His Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val
                325                 330
(2)序列6资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：335氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：序列6
Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ala Trp Leu Leu Cys
1               5                   10                  15
Val Pro Val Cys Gly Ala Ala Glu Leu Cys Val Asn Ser Leu Glu Lys
            20                  25                  30
Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys Thr Tyr Ser Thr
        35                  40                  45
Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gln Thr Phe Ala Ser Asn Trp Arg Lys
    50                  55                  60
Ile Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys Met Ala Leu Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu Ile Lys His Lys Tyr Leu Trp
                85                  90                  95
Ser Glu Pro Gln Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Leu Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Asn Phe
        115                 120                 125
Val Ser Pro Val Lys Asn Gln Gly Ala Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe
    130                 135                 140
Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala Ile Ala Ile Ala Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Met Leu Ser Leu Ala Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys Ala Gln Asp Phe
                165                 170                 175
Asn Asn Tyr Gly Cys Gln Gly Gly Leu Pro Ser Gln Ala Phe Glu Tyr
            180                 185                 190
Ile Leu Tyr Asn Lys Gly Ile Met Gly Glu Asp Thr Tyr Pro Tyr Gln
        195                 200                 205
Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gln Pro Gly Lys Ala Ile Gly Phe
    210                 215                 220
Val Lys Asp Val Ala Asn Ile Thr Ile Tyr Asp Glu Glu Ala Met Val
225                 230                 235                 240
Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala Phe Glu Val Thr
                245                 250                 255
Gln Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly Ile TyT ser ser Thr ser Cys
            260                 265                 270
His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr
        275                 280                 285
Gly Glu Lys Asn Gly Ile Pro Tyr Trp Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly
        290                 295                 300
Pro Gln Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu Ile Glu Arg Gly Lys Asn
305                 310                 315                 320
Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala ser Tyr Pro Ile Pro Leu Val
                325                 330                 335
(2)序列7资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：339氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：序列7
Met Trp Gln Leu Trp Ala Ser Leu Cys Cys Leu Leu Val Leu Ala Asn
1               5                   10                  15
Ala Arg Ser Arg Pro Ser Phe His Pro Val Ser Asp Glu Leu Val Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Asn Lys Arg Asn Thr Thr Trp Gln Ala Gly His Asn Phe Tyr
        35                  40                  45
Asn Val Asp Met Ser Tyr Leu Lys Arg Leu Cys Gly Thr Phe Leu Gly
    50                  55                  60
Gly Pro Lys Pro Pro Gln Arg Val Met Phe Thr Glu Asp Leu Lys Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Ser Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Pro Gln Cys Pro Thr Ile
                85                  90                  95
Lys Glu Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Gly
            100                 105                 110
Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Ile Cys Ile His Thr Asn Ala His
        115                 120                 125
Val ser Val Glu Val ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly Ser
    130                 135                 140
Met Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala Glu Ala Trp Asn
145                 150                 155                 160
Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Glu Ser His
                165                 170                 175
Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu His His Val Asn
            180                 185                 190
Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys Ser
        195                 200                 205
Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys Gln Asp Lys His
    210                 215                 220
Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu Lys Asp Ile Met
225                 230                 235                 240
Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Ser Val Tyr
                245                 250                 255
Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln His Val Thr Gly
            260                 265                 270
Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu
        275                 280                 285
Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Thr Asp Trp
    290                 295                 300
Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Gly Gly Gln Asp His Cys Gly
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr Trp
                325                 330                 335
Glu Lys Ile
(2)序列8资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：17碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：序列8
GGATACGTTA CNCCNGT                                        17
(2)序列9资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：14碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：未知
        (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：序列9
GCCATGAGRT ANCC                                                       14
(2)序列10资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：18氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：序列10
Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val
1               5                   10                  15
Lys Asn
(2)序列11资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：29碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：序列11
CTGGATCCCT GTACCCTGAG GAGATACTG                                       29
(2)序列12资料：
    (i)序列特征：
       (A)长度：33碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：未知
       (D)拓扑结构：未知
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：序列12
CTAAGCTTCT ATCTACCTTC CCATTCTGGG ATA                                    33

Claims (8)

1.一种重组组织蛋白酶蛋白，其具有由图1所示氨基酸序列的16-329位氨基酸组成的多肽序列，或在图1的16-329位所示氨基酸序列中包含取代、***和/或缺失所形成的多肽序列，其中所述重组组织蛋白酶蛋白具有潜在的半胱氨酸蛋白酶活性。
2.一种重组组织蛋白酶蛋白，其具有由图1所示氨基酸序列的115-329位氨基酸组成的多肽序列，或在图1的115-329位所示氨基酸序列中包含取代、***和/或缺失所形成的多肽序列，其中所述重组组织蛋白酶蛋白具有半胱氨酸蛋白酶活性。
3.一种重组组织蛋白酶蛋白，其由图1所示核苷酸序列的484-1128位核苷酸编码，其中所述重组组织蛋白酶蛋白具有半胱氨酸蛋白酶活性。
4.一种重组蛋白，它具有由图1所示氨基酸序列中第16-114位氨基酸所组成的多肽序列。
5.权利要求1-3任一项的重组组织蛋白酶蛋白，其中所述半胱氨酸蛋白酶活性是水解Z-FR-MCA的活性。
6.权利要求1-3任一项的重组组织蛋白酶蛋白，其中所述半胱氨酸蛋白酶活性是水解Z-LR-MCA的活性。
7.权利要求1-3任一项的重组组织蛋白酶蛋白，其中所述半胱氨酸蛋白酶活性是水解Z-VR-MCA的活性。
8.权利要求1-3任一项的重组组织蛋白酶蛋白，其中所述半胱氨酸蛋白酶活性是水解Z-LLR-MCA的活性。
CNB951968416A 1994-10-27 1995-10-26 组织蛋白酶o2蛋白酶 Expired - Fee Related CN1148382C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/330,121 1994-10-27
US08/330,121 US5736357A (en) 1994-10-27 1994-10-27 Cathespin O protease
US08/536,861 US6544767B1 (en) 1994-10-27 1995-10-02 Cathespin O2 protease
US08/536,861 1995-10-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1170415A CN1170415A (zh) 1998-01-14
CN1148382C true CN1148382C (zh) 2004-05-05

Family

ID=26987129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB951968416A Expired - Fee Related CN1148382C (zh) 1994-10-27 1995-10-26 组织蛋白酶o2蛋白酶

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6544767B1 (zh)
EP (1) EP0783527B1 (zh)
JP (1) JP3670666B2 (zh)
KR (1) KR100473219B1 (zh)
CN (1) CN1148382C (zh)
AT (1) ATE317441T1 (zh)
AU (1) AU711810B2 (zh)
CA (1) CA2203765C (zh)
DE (1) DE69534778T2 (zh)
ES (1) ES2256849T3 (zh)
FI (1) FI971777A (zh)
HU (1) HU220960B1 (zh)
NO (1) NO971875L (zh)
NZ (1) NZ296003A (zh)
WO (1) WO1996013523A1 (zh)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6403304B1 (en) 1993-04-06 2002-06-11 Forsyth Dental Infirmary For Children Human osteoclast-specific and -related DNA sequences
US5501969A (en) 1994-03-08 1996-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Human osteoclast-derived cathepsin
CZ132798A3 (cs) * 1995-10-30 1999-02-17 Smithkline Beecham Corporation Inhibitory proteázy
CZ206097A3 (cs) 1995-10-30 1999-02-17 Smithkline Beecham Corporation Způsob inhibice kathepsinu K
US6586466B2 (en) 1995-10-30 2003-07-01 Smithkline Beecham Corporation Carbohydrazide-protease inhibitors
EP0812916A3 (en) * 1996-06-14 1998-12-09 Smithkline Beecham Corporation Cathepsin k gene
WO1998000716A1 (en) * 1996-07-03 1998-01-08 Novadx, Inc. Method for detecting degenerative bone disease
GB9701888D0 (en) * 1997-01-30 1997-03-19 Ciba Geigy Ag Novel methods
US5948669A (en) * 1997-02-26 1999-09-07 Smithkline Beecham Corporation Rat cathepsin K polynucleotide and polypeptide sequence
US20030144175A1 (en) 1998-12-23 2003-07-31 Smithkline Beecham Corporation Protease inhibitors
US6346373B1 (en) * 1999-05-05 2002-02-12 Merck Frosst Canada & Co., Whole cell assay for cathepsin K activity
WO2001000798A2 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Hybritech Incorporated Cloning and expressing of human cathepsin k in mammalian cells
WO2001034599A1 (en) 1999-11-10 2001-05-17 Smithkline Beecham Corporation Protease inhibitors
JP2003513924A (ja) 1999-11-10 2003-04-15 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション プロテア−ゼ阻害剤
US6583137B1 (en) 1999-11-10 2003-06-24 Smithkline Beecham Corporation Protease inhibitors
EP1252162B1 (en) 2000-01-20 2012-07-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Alpha v integrin receptor antagonists
CN1416346A (zh) 2000-03-21 2003-05-07 史密丝克莱恩比彻姆公司 蛋白酶抑制剂
CA2425829A1 (en) * 2000-10-18 2002-05-16 Incyte Genomics, Inc. Proteases
CN100408681C (zh) * 2002-06-17 2008-08-06 株式会社日冷 来源于粉红色虾的新型组织蛋白酶l样半胱氨酸蛋白酶
WO2004000838A1 (en) * 2002-06-24 2003-12-31 Axys Pharmaceuticals, Inc. Peptidic compounds as cysteine protease inhibitors
JP2006528151A (ja) * 2003-07-21 2006-12-14 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 骨転移、腫瘍増殖および腫瘍誘発骨量減少の処置におけるカテプシンｋ阻害剤およびビスホスホネートの組み合わせ
CA2535359A1 (en) 2003-08-21 2005-03-03 Merck Frosst Canada Ltd. Cathepsin cysteine protease inhibitors
WO2005029080A1 (en) * 2003-09-23 2005-03-31 Merck Frosst Canada Ltd. Whole cell assay for inhibitors of cathepsin k
WO2005093421A1 (de) * 2004-03-10 2005-10-06 Biovendor Laboratory Medicine, Inc. Enzymimmunoassay zur bestimmung von cathepsin k
US7029902B2 (en) * 2004-03-26 2006-04-18 Applera Corporation Isolated monkey cathepsin S proteins, nucleic acid molecules encoding monkey cathepsin S proteins, and uses thereof
UA87854C2 (en) 2004-06-07 2009-08-25 Мерк Энд Ко., Инк. N-(2-benzyl)-2-phenylbutanamides as androgen receptor modulators
TWI395593B (zh) * 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
AU2013202011C1 (en) * 2008-03-06 2015-10-01 Halozyme, Inc. In vivo temporal control of activatable matrix-degrading enzymes
US8901144B2 (en) 2013-02-07 2014-12-02 Scifluor Life Sciences, Llc Fluorinated 3-(2-oxo-3-(3-arylpropyl)imidazolidin-1-yl)-3-arylpropanoic acid derivatives
PT2953948T (pt) 2013-02-07 2017-12-12 Scifluor Life Sciences Inc Antagonistas de integrina fluorada
EP3148587B1 (en) 2014-05-30 2021-02-24 Pfizer Inc Carbonitrile derivatives as selective androgen receptor modulators
JP2018510139A (ja) 2015-02-19 2018-04-12 サイフルーア ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド フッ化テトラヒドロナフチリジニルノナン酸誘導体およびその使用法
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5501969A (en) 1994-03-08 1996-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Human osteoclast-derived cathepsin
AU6333296A (en) 1996-06-14 1998-01-07 Human Genome Sciences, Inc. Cathepsin k gene

Also Published As

Publication number Publication date
ES2256849T3 (es) 2006-07-16
EP0783527A1 (en) 1997-07-16
KR970707153A (ko) 1997-12-01
JP3670666B2 (ja) 2005-07-13
US20030175937A1 (en) 2003-09-18
FI971777A0 (fi) 1997-04-25
JPH10512740A (ja) 1998-12-08
EP0783527B1 (en) 2006-02-08
EP0783527A4 (en) 1998-12-02
AU3968895A (en) 1996-05-23
DE69534778D1 (en) 2006-04-20
NO971875D0 (no) 1997-04-23
ATE317441T1 (de) 2006-02-15
FI971777A (fi) 1997-04-25
NZ296003A (en) 1999-10-28
NO971875L (no) 1997-06-12
KR100473219B1 (ko) 2005-05-16
DE69534778T2 (de) 2006-08-17
WO1996013523A1 (en) 1996-05-09
CN1170415A (zh) 1998-01-14
CA2203765A1 (en) 1996-05-09
HU220960B1 (hu) 2002-07-29
US6544767B1 (en) 2003-04-08
CA2203765C (en) 2002-04-23
AU711810B2 (en) 1999-10-21
HUT77049A (hu) 1998-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1148382C (zh) 组织蛋白酶o2蛋白酶
CN1268741C (zh) 半乳糖苷酶a缺乏症的治疗
CN1253574C (zh) 来自米曲霉的areA基因和其中areA基因已被修饰的真菌
CN1192109C (zh) 锚定于细胞膜的抗凝血融合蛋白
CN1280613A (zh) 编码哺乳动物内切葡糖醛酸糖苷酶的分离的核酸分子及其应用
CN1739788A (zh) Trip－br功能的调节和治疗增殖性紊乱的方法
CN1226174A (zh) 应用蛋白酶抑制剂预防或降低骨的吸收
CN1545553A (zh) 生产重组胰蛋白酶的方法
CN1216988C (zh) 分泌型Kex衍生物的制造方法
CN1701117A (zh) 针对von willebrand 因子切割酶的抗体及利用所述抗体的分析***
CN1592793A (zh) 肝细胞癌－相关基因和多肽,以及检测肝细胞癌的方法
CN1161468C (zh) Mpl配体类似物
CN1154727C (zh) 人甲状旁腺素的重组表达载体
CN1761747A (zh) 生产含有gla残基的丝氨酸蛋白酶的方法
CN1241940C (zh) 新型胶原蛋白样蛋白clac、其前体和它们的编码基因
CN1795209A (zh) 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白
CN1390256A (zh) 新型蛋白质及其dna
CN1948339A (zh) 端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化
CN1158639A (zh) 编码与白介素-1β转换酶相关的人Tx和Ty蛋白的DNA序列
CN1795205A (zh) Spex组合物和使用方法
CN1207387C (zh) 新型多肽及其编码基因
CN1302006C (zh) 重组牛凝血酶
CN1112127A (zh) 新的蛋白质p140多肽及编码该多肽的DNA
CN1761746A (zh) 融合构建体及其用来生产Fc受体结合亲和性和效应子功能提高的抗体的用途
CN1100957A (zh) 重组产品

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Applicant after: Arris Pharmaceutical Corp.

Applicant before: Aris Pharmaceuticals, Inc.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: ARIS PHARMACEUTICALS, INC. TO: AXIS PHARMACEUTICALS, INC.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee