CN114836328B

CN114836328B - 歧皱青霉菌菌株ra51及其应用

Info

Publication number: CN114836328B
Application number: CN202210502808.4A
Authority: CN
Inventors: 王玲; 胡培松; 唐绍清; 胡时开; 圣忠华; 焦桂爱; 魏祥进; 邵高能; 谢黎虹
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2042-05-10
Also published as: CN114836328A

Abstract

歧皱青霉菌菌株RA51及其应用，属于微生物技术领域。本发明的歧皱青霉(Penicillium steckii)菌株RA51，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23852。所述歧皱青霉发酵产物能够对生物材料中的伏马毒素进行高效降解。本发明还提供了以歧皱青霉为活性成分制备的液体菌剂或固体菌剂，用于生物降解去除生物质材料中的伏马毒素。本发明的歧皱青霉解毒活性高，特异性强，作用效果温和，不存在二次污染，可以提高农产品的质量，确保人畜的食用安全，适用于农产品、饲料工业、食品加工中伏马毒素的去除。

Description

歧皱青霉菌菌株RA51及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及歧皱青霉菌菌株RA51及其应用。

背景技术

据***粮农组织(FAO)评估，全世界每年约有25％的农作物受霉菌及霉菌毒素的污染，约有2％的粮食因霉变污染而不能食用。伏马毒素主要是层出镰刀菌、拟轮枝镰刀菌和花腐镰刀菌等产生的次级代谢产物，是粮食及其制品中常见的一类真菌毒素，其可污染多种农作物和经济作物。伏马毒素的存在不仅危害作物的产量和品质，而且对人畜健康造成严重威胁。该毒素可引发马脑白质软化症、猪肺水肿、婴儿神经管缺陷等症状。流行病学研究证实，人类食管癌的高发病率与食入被伏马毒素污染的谷物有直接关系。现已报道的伏马毒素，按其结构特征被划分为FA、FB、FC和FP四组。其中，以FB1的毒性最强、含量最高，国际癌症研究机构将FB1定义为2B类致癌物。

鉴于伏马毒素普遍存在且污染造成巨大危害，许多国家都限制了食品和饲料中伏马毒素的最高含量，并出台了相关法律标准监控其在食品和饲料内的污染情况。为了保障我国农产品、食品和饲料的质量安全，迫切需要研制高效安全的伏马毒素脱毒技术。目前，降低或去除伏马毒素的方法主要集中在物理、化学和生物方式。物理方法主要有辐照法、萃取法和加热法等，化学处理方法包括氨化法、碱化法、氧化法等。但物理和化学方法的主要缺点在于：反应条件过于激烈、脱毒效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产。生物脱毒法是利用微生物或其分泌的代谢产物破坏毒素，具有较高的专一性、较强的亲和性、不破坏营养成分、环境友好等优点，表现出良好的开发和应用前景。

为对伏马毒素进行有效的消减脱毒，有必要分离筛选高效降解伏马毒素的微生物，研究其生物学特性并制成脱毒剂，用于粮食加工、饲料工业、食品工业等方面，以减少原料的污染和浪费。目前，已报道的具有降解伏马毒素能力的微生物主要有丛毛单胞菌、肠膜明串珠菌、棘状外瓶霉、鞘氨醇单胞菌和酵母菌等。但是有些微生物的脱毒机理属于物理吸附，并非实质性的生物降解，吸附在菌体细胞壁的毒素，可能会发生解吸附作用。针对这些问题，本发明提供了一株可降解伏马毒素的歧皱青霉，开发了歧皱青霉在伏马毒素污染控制方面的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供歧皱青霉菌菌株RA51及其应用的技术方案。

为了实现上述技术效果，本发明公开提供以下技术方案：

本发明公开第一方面，本发明提供了一株降解伏马毒素的歧皱青霉菌株RA51，分类命名为Penicillium steckii。该菌株已于2021年11月16日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为：CGMCC No.23852。

本发明采集浙江舟山海滩的土壤，将土壤样品制备成菌悬浮液，以伏马毒素为唯一碳源进行筛选培养，得到一株高效降解伏马毒素的菌株RA51。经形态学鉴定和分子生物学鉴定，确定该菌株为歧皱青霉(Penicillium steckii)。

本发明公开第二方面，本发明提供了歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51在降解伏马毒素中的应用。

本发明公开第三方面，本发明提供了歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51的发酵产物在降解伏马毒素中的应用。

进一步，上述发酵产物通过以下步骤得到：

1)将歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养5d，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液；

2)将歧皱青霉的菌悬液按1％接种量接种于种子培养基中，28℃，150r/min，培养5d，获得种子液；

3)将种子液按5～8％接种量接种于发酵培养基中，25～30℃，120～160r/min，溶氧量为60～65％，通气量5～10％，培养5～7d，发酵结束后分生孢子数量至少达到10⁸个/mL，获得发酵产物。

进一步，所述步骤2)中的种子培养基由如下组分组成：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L；所述步骤3)中发酵培养基由如下组分组成：NaNO₃ 2g，蔗糖30g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，用蒸馏水定容至1L，pH6.0～8.0。

本发明公开第四方面，本发明提供了以歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51为活性成分的菌剂。

进一步，该菌剂含有歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51菌体和/或其发酵产物。

本发明公开第五方面，本发明提供了以歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51为活性成分的菌剂的制备方法，其包括如下步骤：

3)将种子液按5～8％接种量接种于发酵培养基中，25～30℃，120～160r/min，溶氧量为60～65％，通气量5～10％，培养5～7d，发酵结束后分生孢子数量至少达到10⁸个/mL，获得发酵产物；

4)在发酵产物中按体积比15～20％加入活性剂，均匀混合，得到液体菌剂；

5)将液体菌剂与吸附剂按1：4的重量比吸附，形成固体菌剂。

进一步，所述步骤2)中的种子培养基由如下组分组成：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L；所述步骤3)中发酵培养基由如下组分组成：NaNO₃ 2g，蔗糖30g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，用蒸馏水定容至1L，pH6.0～8.0；所述步骤4)中活性剂按质量份计，包括以下组成：水溶性淀粉8％、海藻酸钠1.5％、壳聚糖2％、吐温20 0.25％，溶剂为无菌水；所述步骤5)中吸附剂为硅藻土、粘土、草炭、泥炭或活性炭的一种或几种。

本发明公开第六方面，本发明提供了以歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51为活性成分的菌剂在降解伏马毒素中的应用。

本发明还提供了以歧皱青霉菌(Penicillium steckii)菌株RA51为活性成分的菌剂的使用方法，按1％重量比，将以歧皱青霉为活性成分的液体菌剂喷施到含有伏马毒素的生物质材料中；按5％重量比，将以歧皱青霉为活性成分的固体菌剂添加到含有伏马毒素的生物质材料中。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明设计开发了一种以歧皱青霉为活性成分的菌剂，其以活性剂或吸附剂为载体，有利于将歧皱青霉的活性成分递送到生物质材料的目标部位，便于提高活性成分的效价，大幅度增加伏马毒素的降解率，提高歧皱青霉对不利因素的耐受性。

(2)本发明公开的歧皱青霉菌菌株RA51，可以高效降解伏马毒素，具有作用专一、环境友好、操作简单、不破坏原料营养成分的优点，适用于谷物、饲料、食品中伏马毒素的去除，能够解决农产品、饲料加工、食品工业中伏马毒素的污染问题，提高原料利用率，保证农作物的生产安全和人畜的食品安全。

附图说明

图1为歧皱青霉菌株RA51在PDA培养基中的菌落形态。A为菌落形态，B为分生孢子形态。

图2为歧皱青霉发酵上清产物对伏马毒素FB1的降解作用。A为反应12h后发酵上清液中FB1含量测定的HPLC图谱，B为反应72h后发酵上清液中FB1含量测定的HPLC图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行详细说明。需要理解的是，以下实施例的给出仅是为了阐述本发明，并不是为了限制本发明的范围。本发明的实施例可作为本技术领域普通技术人员进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

本发明实施例中提供的歧皱青霉(Penicillium steckii)菌株RA51，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2021年11月16日，保藏编号为CGMCCNo.23852。

本发明实施例中所述的产生伏马毒素的层出镰刀菌菌株Fp9，记载于“孙磊，王玲，刘连盟，侯雨萱，黎起秦，黄世文.水稻穗腐病菌强致病力且高产伏马菌素菌株筛选.中国水稻科学,2018,32(6):610～616.”一文。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例涉及的培养基和试剂组分包括：

初筛液体培养基(g/L)：(NH₄)₂·SO₄ 5g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，NaH₂PO₄·12H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，1％孟加拉水溶液3mL，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.8。121℃，20min，高压灭菌。使用时每100mL培养基中加1％链霉素液0.3mL。

初筛固体培养基(g/L)：(NH₄)₂·SO₄ 5g，KH₂PO₄1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，NaH₂PO₄·12H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，1％孟加拉水溶液3mL，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值为6.8。121℃，20min，高压灭菌。使用时每100mL培养基中加1％链霉素液0.3mL。

马铃薯葡萄糖(PDB)培养基(g/L)：葡萄糖20g，马铃薯200g，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L)：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂20g/L，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

种子培养基(g/L)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

发酵培养基(g/L)：NaNO₃ 2g，蔗糖30g，K₂HPO₄·3H₂O1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，pH为6.0～8.0，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

稻谷产毒培养基：50g水稻谷粒置于250mL三角瓶中，加入10mL蒸馏水浸泡过夜。121℃，20min，高压灭菌。

玉米产毒培养基：50g玉米谷粒置于250mL三角瓶中，加入10mL蒸馏水浸泡过夜。121℃，20min，高压灭菌。

小麦产毒培养基：50g小麦谷粒置于250mL三角瓶中，加入10mL蒸馏水浸泡过夜。121℃，20min，高压灭菌。

大麦产毒培养基：50g大麦谷粒置于250mL三角瓶中，加入10mL蒸馏水浸泡过夜。121℃，20min，高压灭菌。

高粱产毒培养基：50g高粱谷粒置于250mL三角瓶中，加入10mL蒸馏水浸泡过夜。121℃，20min，高压灭菌。

实施例1：歧皱青霉菌株RA51的获得

一、歧皱青霉菌株RA51的分离

从浙江舟山海滩采集土壤样本，称取土样5g，置于30mL灭菌生理盐水中，搅拌混匀，使土壤中的微生物悬浮于水中，静置1h。按1‰的接种量，取土壤悬浮液接种于含FB1初筛液体培养基中，使FB1终浓度为500ppb。在初筛培养基中加入孟加拉红和链霉素以抑制放线菌和细菌的生长。在30℃、160r/min条件下，摇瓶培养48h后，再按1‰的接种量转接到初筛液体培养基上，继续培养48h，连续转接三次。最后，将上清液稀释至10^-3，加入到PDA培养基平板上进行涂布处理。在30℃培养，直至长出真菌菌丝。将可见的不同形态的真菌挑出，接种于含FB1终浓度为500ppb的初筛固体培养基中，连续培养三代，挑选出一株稳定生长的真菌，菌株编号为RA51。

二、歧皱青霉菌株RA51的鉴定

(1)形态学鉴定

将纯化后的菌株RA51接种至PDA培养基中，在28℃下培养5d。观察该菌株的菌落整体较为扁平，菌落中间有明显的突起小环，菌落呈地毯式蔓延生长。菌落的边缘呈白色绒毛状，中间呈青绿色，中央呈淡黄色，如图1。菌落反面呈淡黄色，周边无明显色素产生。菌株RA51的菌丝生长后期表面为密毡状，产生大量分生孢子，且分生孢子极易飞扬。分生孢子梗有横隔，顶端无膨大的顶囊，具有帚状枝小梗；分生孢子着生于孢子梗，链状生长，球形、单孢，大小(2.2～2.6)μm×(1.6～2.1)μm，表面光滑。

根据菌株RA51在PDA上生长的菌落形态和分生孢子形态，参照《中国真菌志》(孔华忠，中国真菌志—青霉属及其相关有性形属[M].第35卷.北京：科学出版社，2004)和《真菌鉴定手册》(魏景超，真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979)，菌株RA51符合青霉属的生长特性，初步确认该菌株隶属于青霉属真菌(Penicillium spp.)

(2)分子生物学鉴定

将菌株RA51接种于PDB培养基上，28℃，150r/min，培养5d，收集菌丝体，提取菌株RA51的基因组DNA，通过真菌的ITS基因序列、钙调蛋白基因序列和β-tubulin基因序列对菌株RA51进行种属鉴定。

ITS基因扩增所用的引物序列为：

ITS1：5’-GAAGTAAAAGTCGTAACAAG-3’(SEQ ID No.1)

ITS4：5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID No.2)

钙调蛋白基因扩增所用的引物序列为：

CL1：5'-GA(GA)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC-3’(SEQ ID No.3)

CL2A：5'-TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3’(SEQ ID No.4)

β-tubulin基因扩增所用的引物序列为：

T1：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’(SEQ ID No.5)

T22：5’-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3’(SEQ ID No.6)

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序。经测序可知，菌株RA51的ITS基因序列、钙调蛋白基因序列和β-tubulin基因序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。将菌株RA51的三个基因序列与NCBI中GenBank数据库进行BLAST比对，菌株RA51的ITS基因序列、钙调蛋白基因序列和β-tubulin基因序列与歧皱青霉的ITS基因序列(GenBank:MN187973)；钙调蛋白基因序列(GenBank:EU644075)、β-tubulin基因序列(GenBank:MN882780)的相似性分别为99.11％、100％和100％。

综合上述形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，最终将菌株RA51确定为歧皱青霉，分类命名为Penicillium steckii。

三、歧皱青霉菌株RA51的保藏

本发明的歧皱青霉菌株RA51，已于2021年11月16日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.23852。

实施例2：歧皱青霉菌株RA51对伏马毒素脱毒物质的初步确定

微生物去除伏马毒素主要通过两种方式，一是吸附结合，二是降解转化。吸附结合是细胞壁或者细胞壁主要成分如多糖、肽聚糖等物质对毒素的吸附，是一个可逆的生物学过程。降解转化是微生物通过酶促反应降解或转化毒素形成无毒或者低毒产物，是一种化学反应过程。因此，降解转化和吸附结合的区分是了解歧皱青霉降解伏马毒素机制的前提。

一、歧皱青霉菌株RA51的培养

将初筛得到的歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基上，28℃，150r/min，培养5d，过滤菌丝，收集分生孢子，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。取1mL菌悬液接种于100mL的种子培养基中，28℃、150r/min培养5d，获得种子液。按5％的接种量(V/V)，将种子液接种于发酵培养基中，28℃、150r/min培养6d，获得发酵液。

二、歧皱青霉菌株RA51降解伏马毒素FB1的活性成分

将歧皱青霉菌株RA51的发酵液进行离心，收集菌体细胞和发酵上清液。将沉淀的菌体细胞用pH7.0的磷酸盐缓冲液，连续冲洗两次，用超声细胞破碎仪破碎，工作3s，间隔3s，共5min，再用磷酸盐缓冲液溶解菌体，即为菌体细胞溶液。将发酵上清液用0.22μm大小孔径的滤膜过滤。在菌体细胞溶液与发酵上清液中分别加入FB1，使FB1终浓度为500ppb。28℃、160r/min共同孵育后，进行FB1的提取与检测。

FB1检测方法为高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)法。具体如下：

将样品用甲醇－水－乙酸(74：25：1)提取后，收集净化液，移入SAX固相萃取小柱，收集洗脱液，50℃氮气吹至近干，加入含0.1％乙酸的30％乙腈，过0.22μm有机滤膜，用HPLC-MS法测定FB1浓度。液相色谱分离条件：ZORBAX Extend-C18反相色谱柱；流动相：A为0.1％乙酸水溶液，B为乙腈；二元梯度洗脱程序：0～1min，70％A；1～6min，70％～20％A；6～9min，20％A；9～9.01min，20％～70％A；9.01～15min，70％A；流速为0.2mL/min。柱温：30℃。电喷雾离子源，正离子采集模式，选择反应监测；喷雾电压3200V；辅助气(N2)压力为34.48kPa，鞘气(N2)压力为206.89kPa；毛细管温度为350℃；离子源温度350℃。

计算歧皱青霉对FB1的降解率，计算方法为：

FB1降解率(％)＝(初始FB1浓度—处理后FB1浓度)/初始FB1浓度×100％。

由表1可知，歧皱青霉的菌体细胞溶液和发酵上清液对FB1有不同程度的降解作用，发酵上清液对FB1的降解率明显高于菌体细胞。在反应96h后，发酵上清液对FB1的降解率达到95.3％，而菌体细胞对FB1的降解率仅为6.8％。这表明歧皱青霉降解FB1是菌株胞外活性代谢产物主导的生物降解作用，而不是菌体细胞壁的吸附作用。而且随着反应时间的延长，歧皱青霉的发酵上清液对FB1的降解率总体呈上升趋势。如图2所示，发酵上清液对FB1的降解率在反应12h时为14.3％，在反应72h时为87.2％。

选择高温、蛋白酶K和SDS分别处理72h的歧皱青霉发酵上清液。结果发现，蛋白酶K和SDS处理后的发酵上清液对FB1的降解作用有明显降低，分别为15.2％和32.5％，高温使得发酵上清液完全失去了对FB1的转化能力。

以上说明降解FB1的活性物质存在于歧皱青霉的发酵上清液中，可能是一种生物活性酶，对FB1的降解过程实质上是活性酶的酶促反应。

表1歧皱青霉菌株RA51发酵培养产物对FB1的降解作用

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实施例3：发酵条件对歧皱青霉菌株RA51降解伏马毒素FB1能力的影响

一、不同培养温度下发酵产物对FB1的降解效果

将歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养7d后，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。在确定最适的培养条件下，将菌悬液按体积比5％接种于发酵培养基中，培养温度分别设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。160r/min、培养6d，得到发酵产物。在发酵产物中加入FB1，使其终浓度为500ppb，充分混匀。在28℃、160r/min下共同孵育72h，用HPLC-MS法检测歧皱青霉发酵产物中FB1浓度，计算不同培养温度下收集的发酵产物对FB1的降解率，计算公式为：

由表2可知，不同培养温度下收集的歧皱青霉发酵产物对FB1的降解有着显著的影响。当温度为25℃和30℃时，发酵产物对FB1的降解率相对较高，分别为84.5％和79.5％。当温度超过45℃，发酵产物对FB1的降解率明显下降，可能由于温度过高导致菌体生长代谢及胞外酶活力受到抑制。故选择25～30℃作为发酵的培养温度。

表2不同培养温度的歧皱青霉发酵产物对FB1的降解作用

培养温度(℃)	20	25	30	35	40	45
							处理后FB1浓度(ppb)	236	67.5	102.5	127.5	162.5	358
降解率(％)	52.8	86.5	79.5	74.5	67.5	28.4

二、不同接种量下发酵产物对FB1的降解效果

将歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养7d后，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。在确定最适的培养条件下，将菌悬液按体积比1％、3％、5％、8％、12％、15％分别接种于发酵培养基中。28℃、160r/min培养6d，得到发酵产物。在发酵产物中加入FB1，使其终浓度为500ppb，充分混匀。在28℃、160r/min下共同孵育72h，用HPLC-MS法检测歧皱青霉发酵产物中FB1浓度，计算不同接种量收集的发酵产物对FB1的降解率，计算公式为：

由表3可知，随着接种量的增加，歧皱青霉的发酵产物对FB1的降解率总体呈上升趋势。接种量过小时，菌体生长过慢，发酵目的产物的合成量过低，对FB1的降解率偏低。当接种量在5～15％时，歧皱青霉的发酵产物对FB1的降解率相对较高。但接种量超过12％，歧皱青霉的菌体生长过于迅速，营养物多用于细胞生长，易造成发酵液粘稠。故将5～8％选为发酵的接种量。

表3不同接种量的歧皱青霉发酵产物对FB1的降解作用

接种量(％)	1	3	5	8	12	15
							处理后FB1浓度(ppb)	408.5	322	131.5	76	98.5	137.5
降解率(％)	18.3	35.6	73.7	84.8	80.3	72.5

三、不同培养时间下发酵产物对FB1的降解效果

将歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养7d后，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。在确定最适的培养条件下，将菌悬液按体积比5％接种于发酵培养基中。28℃、160r/min，摇瓶培养，在培养后的第3d、4d、5d、7d、9d、11d，分别收集发酵产物。在发酵产物中加入FB1，使其终浓度为500ppb，充分混匀。在28℃、160r/min下共同孵育72h，用HPLC-MS法检测歧皱青霉发酵产物中FB1浓度，计算不同培养时间的发酵产物对FB1的降解率，计算公式为：

由表4可知，当培养时间5～7d时，歧皱青霉发酵产物对FB1有较好的降解性能，降解率达到75.2～89.3％。培养时间过长或过短，发酵产物对FB1的降解率均相对偏低。当发酵培养9d后，歧皱青霉的发酵液变得粘稠，引起营养物质大量消耗，易造成目的产物合成阶段物质供应不足，对FB1的降解率显著下降。故将发酵培养时间设为5～7d。

表4不同培养时间的歧皱青霉发酵产物对FB1的降解作用

培养时间(d)	3	4	5	7	9	11
							处理后FB1浓度(ppb)	434	353	124	53.5	239.5	362.5
降解率(％)	13.2	29.4	75.2	89.3	52.1	27.5

四、不同初始pH值下发酵产物对FB1的降解效果

将歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养7d后，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。在确定最适的培养条件下，将菌悬液按体积比5％接种于发酵培养基中，初始发酵pH值分别设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。28℃、160r/min，培养6d，得到发酵产物。在发酵产物中加入FB1，使其终浓度为500ppb，充分混匀。在28℃、160r/min下共同孵育72h，用HPLC-MS法检测歧皱青霉发酵产物中FB1浓度，计算不同pH值下收集的发酵产物对FB1的降解率，计算公式为：

由表5可知，发酵培养的初始pH值对歧皱青霉发酵产物对FB1的降解有着明显影响。当初始pH为4.0时，发酵产物对FB1无降解能力。随着pH升高，歧皱青霉对FB1的降解率也逐渐升高。当初始pH在6.0～8.0范围时，发酵产物对FB1保持较高的降解活性，降解率在73.7％～83.2％。当初始pH为7.0时，发酵产物对FB1降解率最高，达83.2％。故将发酵初始pH设为6.0～8.0。

表5不同初始pH值的歧皱青霉发酵产物对FB1的降解作用

初始pH值	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0
							处理后FB1浓度(ppb)	500	353	121	84	181.5	307.5
降解率(％)	0	29.4	75.8	83.2	73.7	38.5

实施例4：歧皱青霉菌剂的制备

一、菌种活化

将歧皱青霉菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养5d，加入无菌水稀释得到分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液。所述PDB培养基由如下组分组成：葡萄糖20g，马铃薯200g，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

二、种子培养液制备

按1％的接种量(V/V)，将歧皱青霉的菌悬液接种于种子培养基中，28℃，150r/min，培养5d，得到种子液。所述种子培养基由如下组分组成：酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L。121℃，20min，高压灭菌。

三、发酵产物制备

按5～8％的接种量(V/V)，将歧皱青霉的种子液接种于发酵培养基中。25～30℃，120～160r/min，溶氧量为60～65％，通气量5～10％，培养5～7d，发酵结束后分生孢子数量至少达到10⁸个/mL，即为发酵产物。所述发酵培养基由如下组分组成：NaNO₃ 2g，蔗糖30g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，用蒸馏水定容至1L，pH为6.0～8.0。121℃，20min，高压灭菌。

四、液体菌剂制备

在歧皱青霉的发酵产物中按体积比15～20％加入活性剂，均匀混合，得到液体菌剂。所述活性剂按质量份计，包括以下组成：水溶性淀粉10％、海藻酸钠1.5％、壳聚糖2％、吐温20 0.25％，溶剂为灭菌水。

五、固体菌剂制备

将所述的液体菌剂与吸附剂按1：4的重量比吸附，形成固体菌剂。所述吸附剂为硅藻土、粘土、草炭、泥炭或活性炭的一种或几种。

实施例5：歧皱青霉液体菌剂对稻谷中伏马毒素的降解能力

取不含伏马毒素的稻谷经研磨后分为6组，121℃，20min，高压灭菌。每组稻谷中分别添加伏马毒素FB1，使其终浓度为500μg/kg、2000μg/kg、8000μg/kg、16000μg/kg、32000μg/kg、64000μg/kg，将FB1与稻谷混合均匀。处理组按1％重量比添加实施例4的以歧皱青霉为活性成分的液体菌剂，以加无菌水作为对照组。在30℃、160r/min，连续反应72h，测定稻谷中FB1含量，计算歧皱青霉液体菌剂对FB1的降解率，计算公式为：

由表6可知，歧皱青霉液体菌剂对稻谷中FB1的降解率，随着FB1浓度的升高呈下降趋势。当稻谷中FB1浓度为500μg/kg时，歧皱青霉液体菌剂对FB1的降解率为100％；当FB1浓度在500～16000μg/kg范围，歧皱青霉液体菌剂对FB1的降解率均高于80％；歧皱青霉液体菌剂对高浓度的FB1降解效果有所减弱，对浓度64000μg/kg的FB1降解率为58.3％。

表6歧皱青霉液体菌剂对不同浓度FB1降解效果

FB1初始浓度(μg/kg)	500	2000	8000	16000	32000	64000
							处理后FB1浓度(μg/kg)	0	72	504	2688	8608	26688
降解率(％)	100	96.4	93.7	83.2	73.1	58.3

实施例6：歧皱青霉液体菌剂对层出镰刀菌污染农作物中伏马毒素的抑制效果

所述的产生伏马毒素的层出镰刀菌菌株Fp9，记载于“孙磊，王玲，刘连盟，侯雨萱，黎起秦，黄世文.水稻穗腐病菌强致病力且高产伏马菌素菌株筛选.中国水稻科学,2018,32(6):610～616.”一文。

将层出镰刀菌菌株Fp9接种于PDA固体培养基上，在28℃下培养5d，用无菌水洗取获得分生孢子浓度为10⁵个/mL的菌悬液。取1mL菌悬液，加入到灭菌处理后的稻谷、玉米、小麦、大麦、高粱为基质的产毒培养基中，充分摇动，使菌株Fp9的分生孢子均匀黏附在不同营养基质的表面。28℃培养15d，得到含有伏马毒素的稻谷、玉米、小麦、大麦、高粱。

在上述含有伏马毒素的稻谷、玉米、小麦、大麦、高粱中，按1％重量比，喷洒实施例4的以歧皱青霉为活性成分的液体菌剂。30℃、160r/min，连续反应72h，测定不同谷物中FB1含量，计算在不同基质上歧皱青霉液体菌剂对层出镰刀菌的产毒抑制率，计算公式为：

产毒抑制率(％)＝(初始FB1浓度—处理后FB1浓度)/初始FB1浓度×100％。由表7可知，以大麦为培养基质，歧皱青霉液体菌剂对层出镰刀菌的产毒抑制率最明显，高达88.0％；其次，以稻谷为基质，液体菌剂的产毒抑制率为74.1％；以玉米和小麦为基质，液体菌剂的产毒抑制率分别为62.7％和68.8％；以高粱为基质，液体菌剂的产毒抑制率最低，为43.4％。结果表明，以歧皱青霉为活性成分的液体菌剂能够有效降解层出镰刀菌在不同谷物上形成的FB1毒素。

表7在不同基质上歧皱青霉液体菌剂对FB1的降解效果

基质	初始FB1浓度(μg/kg)	处理后FB1浓度(μg/kg)	产毒抑制率(％)
				稻谷	48736.2	12622.7	74.1
玉米	56893.1	21221.1	62.7
				小麦	36342.8	11338.9	68.8
大麦	27891.4	3346.9	88.0
				高粱	15321.6	8672.0	43.4

实施例7：歧皱青霉固体菌剂对玉米饲料中伏马毒素的降解能力

样品为伏马毒素FB1超标的玉米饲料，121℃，20min，高压灭菌。经过灭菌处理后，将实施例4的以歧皱青霉为活性成分的固体菌剂，按5％重量比加入到含FB1的玉米饲料中，混合均匀。30℃、160r/min，连续反应72h，测定玉米饲料中FB1含量，计算歧皱青霉固体菌剂对FB1的降解率，计算公式为：

结果表明，伏马毒素污染的玉米饲料的初始FB1浓度为95372.5μg/kg，加入歧皱青霉固体菌剂处理72h后，FB1浓度降低至27831.6μg/kg。歧皱青霉固体菌剂对伏马毒素FB1的降解率可达70.8％。由此可见，以歧皱青霉为活性成分的固体菌剂可以显著降解玉米样品中的伏马毒素FB1含量。

实施例8：歧皱青霉菌株RA51发酵上清液对动物的安全性

将歧皱青霉菌株RA51接种于100mL PDB培养基中，在28℃、160r/min，培养6d，收集菌株RA51的发酵液。12000r/min、离心10min去除菌体。将发酵上清液过0.22μm的滤膜，冷冻干燥，用超纯水将冻干粉稀释成0.25g/mL。

选择40只小鼠，体重18～20g，雌雄各半，随机分成2组，每组20只。小鼠适应3d后，禁食不禁水12h。通过灌胃方式向小鼠施用歧皱青霉的发酵上清液，按10mL/kg小鼠体重灌胃1次。灌胃后正常饲喂小鼠约15d，观察小鼠的临床表现。对照组对小鼠经口灌胃蒸馏水。

实验结束时，观察灌服小鼠与对照相比没有明显不同。临床表现包括每日进食、饮水、毛色、粪便、体重、死亡率。根据解剖结果发现，所有的试验小鼠中没有可见的异常组织，未出现任何明显的炎症或中毒现象。小鼠的组织观察和生理生化指标测定结果表明，歧皱青霉发酵液对小鼠并无明显的急性毒副作用。因此，可以认为采用的歧皱青霉发酵上清在生物安全性方面无须担心。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作若干变形或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实例所作的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 歧皱青霉菌菌株RA51及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagtaaaag tcgtaacaag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctccgctta ttgatatgc 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagatatcaa ggaggccttc tc 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttttgcatc atgagttgga c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacatgcgtg agattgtaag t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctggatgtt gttgggaatc c 21

<210> 7

<211> 563

<212> DNA

<213> 歧皱青霉菌(Penicillium steckii)

<400> 7

tcctttacct gatccgaggt cacctgagaa aaaataaaag gttgggggtc ggctggcgcc 60

ggccgggcct acaagagcgg gtgacgaagc cccatacgct cgaggaccgg acgcggtgcc 120

gccgctgcct ttcgggcccg tccccccccg gagcgggggg gacggggccc aacacacaag 180

ccgtgcttga gggcagcaat gacgctcgga caggcatgcc ctccggaata ccagagggcg 240

caatgtgcgt tcaaagactc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt agttatcgca 300

tttcgctgcg ttcttcatcg atgccggaac caagagatcc gttgttgaaa gttttaacta 360

atttagctag ttgtctcaga ctgcaacttc agacagcgtt cagagggggg cttcggcggg 420

cgcggacccg ggggcggatg ccccccggcg gcctggcggc gggcccgccg aagcaacaca 480

ggttcgtgca acacgggtgg gaggttggac ccagagggcc ctcactcggt aatgatcctt 540

ccgcaggttc acctttacgg aag 563

<210> 8

<211> 570

<212> DNA

<213> 歧皱青霉菌(Penicillium steckii)

<400> 8

aaaggccttc tccctttttg tgagtgattc gatcccgaat tgatgtttgt gggtgtgcga 60

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gacatgatta acgaggttga cgccgataac aatggcacca ttgatttccc cggtacgaat 360

ttcaaacccc caattttcac atgccgaata cccttatgat catgtcattg gtgaaaataa 420

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attctgagga ggagatccgg gaggcattca aggtctttga ccgtgacaac aacggtttca 540

tctccgctgc cgaactgcgc cacgttatcc 570

<210> 9

<211> 499

<212> DNA

<213> 歧皱青霉菌(Penicillium steckii)

<400> 9

tggtaacccc aaacggtgct gctttctggt acgtgctgca aatcctgaat gatcaattgt 60

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ttttccgccc cgacaacttc gttttcggtc agtctggtgc tggtaacaac tgggccaagg 480

gtcactccct gggagggta 499

Claims

1.歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51，其保藏编号为CGMCC No.23852。

2.如权利要求1所述的歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51在降解伏马毒素中的应用。

3.如权利要求1所述的歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51的发酵产物在降解伏马毒素中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵产物通过以下步骤得到：

1）将歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51接种于PDB培养基中，28℃，150r/min，培养5d，获得分生孢子浓度为10⁶个/mL的菌悬液；

2）将歧皱青霉的菌悬液按1%接种量接种于种子培养基中，28℃，150r/min，培养5d，获得种子液；

3）将种子液按5～8%接种量接种于发酵培养基中，25～30℃，120～160r/min，溶氧量为60～65%，通气量5～10%，培养5～7d，发酵结束后分生孢子数量至少达到10⁸个/mL，获得发酵产物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤2）中的种子培养基由如下组分组成：酵母提取物5g，蛋白胨 10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1 L；

所述步骤3）中发酵培养基由如下组分组成：NaNO₃ 2g，蔗糖 30g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，用蒸馏水定容至1 L，pH 6.0～8.0。

6.以权利要求1所述的歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51为活性成分的菌剂。

7.如权利要求6所述的菌剂，其特征在于含有歧皱青霉菌（Penicillium steckii）菌株RA51菌体和其发酵产物。

8.如权利要求6或7所述的菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

3）将种子液按5～8%接种量接种于发酵培养基中，25～30℃，120～160r/min，溶氧量为60～65%，通气量5～10%，培养5～7d，发酵结束后分生孢子数量至少达到10⁸个/mL，获得发酵产物；

4）在发酵产物中按体积比15～20%加入活性剂，均匀混合，得到液体菌剂；

5）将液体菌剂与吸附剂按1：4的重量比吸附，形成固体菌剂。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的种子培养基由如下组分组成：酵母提取物5g，蛋白胨 10g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1 L；

所述步骤3）中发酵培养基由如下组分组成：NaNO₃ 2g，蔗糖 30g，K₂HPO₄·3H₂O 1g，KCl0.5 g，MgSO₄0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，用蒸馏水定容至1 L，pH 6.0～8.0；

所述步骤4）中活性剂按质量份计，包括以下组成：水溶性淀粉8%、海藻酸钠1.5%、壳聚糖2%、吐温20 0.25%，溶剂为无菌水；

所述步骤5）中吸附剂为硅藻土、粘土、草炭、泥炭或活性炭的一种或几种。

10.如权利要求6或7所述的菌剂在降解伏马毒素中的应用。