CN114835831B - 一种百合多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种百合多糖的提取方法,通过利用超声处理+机械破壁提相结合的方法,有效的对长白山甜百合进行百合多糖提取,获得较高的提取率和保持高效的多糖活性。并且对提取的多糖进行了抗氧化活性分析,证明本发明方法所得的百合多糖的活性成分明显高于与普通高温水提所得的百合多糖。本发明的方法一方面有效解决了百合多糖提取中存在的有机溶剂用量复杂、料液比大、提取效率低、耗能高、耗时长、多糖活性低等问题,另一方面此方法工艺稳定性高,非常适用于企业工厂化大规模生产。对百合多糖真正应用于食品生产方面、医疗医用方面提供了重要保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖化合物,尤其涉及一种百合多糖的提取方法。
背景技术
全国百合具有47个种,36个特有种,长白山具有11种,其中长白山野生甜百合,学名大花卷丹(Lilium leichtlinii var. maximowiczii (Regel) Baker),是多年生药食同源草本植物,在长白山区海拔300-900m广泛分布。其白色球形鳞茎高3-5cm,茎直立、叶散生成披针形,株高在0.5-2.5m,下部有紫色斑点,与卷丹不同之处在于腋间没有珠芽,植株高于卷丹,花红色带紫色斑点且花期早于卷丹,是长白山区百合株型最高大的品种。
大花卷丹具有较高的食用价值,药用价值和观赏价值,属药食同源。其具有鳞茎大、产量高、口感好的特点,淀粉、蛋白质、糖类、果胶质、维生素含量大,并含有钙、磷、锌、铁、硒等多种微量元素和 18 种氨基酸。除一般性成分外,还含有许多具有生理功能的成份,如磷脂、百合皂甙、百合多糖、秋水仙碱等。对比目前市场主流百合种植品种,在11项指标中,9项居国家前列。其功效是不言而喻的,具有润肺止咳、宁心安神、美容养颜、防癌抗癌、抗肿瘤、提高免疫力、改善睡眠、延缓衰老、健胃、清热解毒等多项功效,是目前新开发的食用百合品种,具有很强的市场前景和竞争优势。
大花卷丹中含有丰富的百合多糖,其结构是由吡喃糖苷键结合半乳糖、D-葡萄糖及D-甘露糖构成的天然高分子化合物,具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抑菌、增强吞噬细胞、B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞的活力等多种生理药理功能。在食品方面,多糖类常用作膳食补充剂、营养补充剂用于调节人体免疫功能,对人体健康有着重要意义。
随着对百合多糖生理活性、药理活性的不断研究, 百合多糖被证明具有较好的研究意义和开发利用前景。但由于多糖的结构十分复杂, 其提取方法的温度、时间、纯度、有机溶剂用量及多糖含量等诸多因素直接影响着百合多糖的活性, 因此多糖的提取、分离纯化及结构分析对后续研究来说至关重要。
目前,如何对百合多糖进行绿色高效、无污染提取成为食品加工领域的研究热点。常用的百合多糖的提取方法主要有微波辅助提取法、酶解辅助提取法、高温高压水提取等。但是这些方法普遍存在提取效率低、耗能高、耗时长、多糖活性低、使用复杂的有机溶剂对所提百合多糖污染等一系列缺点。尤其是提取时需要较高的料液比,在进行多糖浓缩时很难完成。因此,产业界急需一种高效、快速、低成本、高活性的百合多糖提取方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提出一种大花卷丹的百合多糖提取工艺,利用超声处理+机械破壁法有效的对长白山甜百合进行百合多糖提取,并且获得较高的提取率和保持高效的多糖活性,有效解决了百合多糖提取中存在的有机溶剂用量复杂、料液比大、提取效率低、耗能高、耗时长、多糖活性低等问题。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一种百合多糖的提取方法,包括以下步骤:
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液;
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与纯水混合,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声8 min~14min,得到超声后的百合浆液;
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行10 min~20min破壁处理,然后用纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液;
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中60℃~75流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用8~12 倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
优选的实施方案中,步骤2中超声时间为8 min。
优选的实施方案中,步骤3中机械破壁时间为10min。
优选的实施方案中,步骤4中浸提温度为60℃。
优选的实施方案中,步骤4中浓缩后百合浆液与95%乙醇溶液的料液比为 1:8。
与现有技术相比,本发明的技术效果:
本发明提出的一种百合多糖的提取方法,对长白山甜百合进行超声处理,利用了超声空化作用、热效应、机械效应等,对细胞破壁、增加细胞壁通透性具有一定效果,从而使其有效成分更容易在溶剂中进行溶解,一方面可以优化对百合中有效成分的提取效率,另一方面可以改善植物功能组分与结构。
本发明提出的一种百合多糖的提取方法,对长白山甜百合进行机械破壁处理,通过研磨介质在管体中高速旋转,使细胞内的有效成分快速释放出来溶解到溶剂中,可以提高溶解度、分散性及吸附性等,可以充分将料液中的百合多糖成分释放出来,提高所得有效成分利用率,同时,机械粉碎破壁属于物理方法,可以极大缩减料液比及有机溶剂的使用,并且不会产生副产物,有效成分破坏少。
综上,本发明通过利用超声处理+机械破壁提相结合的方法,有效的对长白山甜百合进行百合多糖提取,获得较高的提取率和保持高效的多糖活性。并且对提取的多糖进行了抗氧化活性分析,证明本发明方法所得的百合多糖的活性成分明显高于与普通高温水提所得的百合多糖。本发明的方法一方面有效解决了百合多糖提取中存在的有机溶剂用量复杂、料液比大、提取效率低、耗能高、耗时长、多糖活性低等问题,另一方面此方法工艺稳定性高,非常适用于企业工厂化大规模生产。对百合多糖真正应用于食品生产方面、医疗医用方面提供了重要保障。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例5提供的葡萄糖的标准曲线。
图2为本发明实施例5提供的不同超声时间对百合多糖得率的影响结果。
图3为本发明实施例6提供的不同破壁时间对百合多糖得率的影响结果。
图4为本发明实施例7提供的不同温度对百合多糖得率的影响结果。
图5为本发明实施例8提供的不同料液比对百合多糖得率的影响结果。
图6为本发明实施例9提供的不同提取方法所得的百合多糖对O2 -•的抑制作用结果。
图7为本发明实施例10提供的不同提取方法所得的百合多糖对•OH的抑制作用结果。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。无水乙醇、苯酚、硫酸等试剂均为国产分析纯。
下述实施例中所用的长白山甜百合由吉林省白山市靖宇县吉林省泉城农业科技有限公司提供。选取直径在5cm以上百合为原料。
实施例1百合多糖的提取
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,称取100g投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液。
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与0.5L纯水混合后置于1L烧杯内,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声8min,得到超声后的百合浆液。
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行10min破壁处理。然后用0.3L纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液。
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中60℃回流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用 8倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
对比例1普通高温水提所得百合多糖
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,称取100g投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液。
步骤2、百合多糖的浸提
将百合浆液与0.5L纯水混合后在水浴锅中60℃回流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用 8倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
实施例2百合多糖的提取
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,称取100g投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液。
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与0.5L纯水混合后置于1L烧杯内,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声10min,得到超声后的百合浆液。
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行10min破壁处理。然后用0.3L纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液。
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中65℃回流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用 10倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
实施例3百合多糖的提取
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,称取100g投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液。
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与0.5L纯水混合后置于1L烧杯内,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声12min,得到超声后的百合浆液。
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行15min破壁处理。然后用0.3L纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液。
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中70℃回流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用 12倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
实施例4百合多糖的提取
步骤1、原材料处理
百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,称取100g投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液。
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与0.5L纯水混合后置于1L烧杯内,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声14min,得到超声后的百合浆液。
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行20min破壁处理。然后用0.3L纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液。
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中75℃浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用 14倍量的 95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
实施例5 不同超声时间对大花卷丹百合多糖得率的影响
将步骤2超声时间分别设定为0 min、4 min、8 min、12 min、14min,其他操作同时实例1,分别对所得百合多糖进行百合多糖含量测定并计算多糖得率。
百合多糖含量测定方法如下:
取干燥的葡萄糖标准品 50 mg,加水溶解得浓度为 0.1 mg/mL的葡萄糖标准液。取标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0mL,置于10mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,分别量取1.0mL,置于刻度试管内,加入1mL 5%的苯酚溶液,浓硫酸5.0mL,室温放置40min,以1.0mL蒸馏水做空白对照。置于紫外可见分光光度计中,490nm处测定吸收度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标建立标准曲线。标准曲线如图1,y = 8.3287x + 0.0294,线性范围为0.10~1.0 mg/mL,相关系数R2 = 0.9994,表明该线性回归方程的线性良好,拟合程度高,可用于对所提多糖浓度的准确计算。
采用苯酚硫酸法,以葡萄糖为标准品来计算多糖的提取率。吸取 1 mL 稀释的粗多糖溶液,根据标准曲线计算多糖浓度,按照下式计算含量。
其中,C 为样液中多糖浓度(mg/mL);V 为样液体积(mL);D 为稀释倍数;W 为样品重量(g)。
多糖得率的公式按照下式计算:
多糖得率/%=多糖含量/百合千重×100%
结果如图2所示,随着超声时间加长,大花卷丹百合多糖得率也随之升高,当超声时间为8min时,百合多糖得率已达到最高,大花卷丹百合多糖得率为18.5%。随着时间继续加长,百合多糖得率没有明显增加。而且在没有超声参与的情况下,尽管反复延长机械破壁时间,百合多糖得率也无法达到最高水平。说明在超声波作用下,产生的气泡在样品细胞表面迅速形成和破裂,气泡破裂产生的微射流和冲击波会形成高剪切力和机械力,导致细胞膜和细胞壁破裂,周围的溶剂可以有效地通过细胞上的裂缝渗透到细胞内,并将细胞内的多糖快速释放到溶剂中。
实施例6不同破壁时间对大花卷丹多糖得率的影响
将步骤3机械破壁时间分别设定为0 min、5 min、10 min、15 min、20min,其他操作同时实例1,分别对所得百合多糖进行百合多糖含量测定并计算多糖得率。百合多糖含量测定方法和多糖得率计算方法同实施例5。
结果如图3所示,随着破壁时间加长,大花卷丹百合多糖得率也随之升高,当进行充分超声时,机械破壁10min,百合多糖得率就已达到最高值,大花卷丹百合多糖得率为18.5%。随着机械破壁时间继续加长,百合多糖得率没有明显增加。说明通过机械破壁处理可以有效提高植物有效成分的提取率,同时可以改变细胞壁的结构特性。
实施例7不同提取温度对大花卷丹多糖得率的影响
将步骤4提取温度分别设定为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃,其他操作同时实例1,分别对所得百合多糖进行百合多糖含量测定并计算多糖得率。百合多糖含量测定方法和多糖得率计算方法同实施例5。
结果如图4所示,在50~75 ℃范围内,多糖得率先以温度的升高成正比例升高。当温度为60 ℃时,百合为得率 18.6%,此时细胞中的有效成分快速释放,直接与溶剂接触并溶解在其中。当温度高于60℃时,百合多糖得率略有下降。并且当温度过高时,由于百合中蛋白质的净出量增加,不仅使得脱蛋白工作量加大,而且也有可能因温度过高引起多糖的结构被破坏,直接影响百合多糖的活性成分含量,并且加大了百合多糖提取的耗能。所以温度60℃时就可以达到百合多糖得率的最大值。
实施例8不同料液比对大花卷丹多糖得率的影响
对多糖得率的影响。
将步骤4浓缩后的百合浆液和乙醇溶液的料液比别设置为1:4、1:6、1:8、1:10、1:12 和 1:14,其他操作同时实例1,分别对所得百合多糖进行百合多糖含量测定并计算多糖得率。百合多糖含量测定方法和多糖得率计算方法同实施例5。
结果如图5所示,百合多糖得率随着料液比的增大而增大,当料液比为 1:8时,多糖得率最高,多糖得率为18.7%,此时的料液比为最佳料液比。由此可以看出,经过超声、机械破壁后百合多糖更容易溶解到溶剂中,极大的缩小了料液比,从而降低了溶剂和能量消耗,使提取液浓缩更易操作,符合实际工业化生产需要。
实施例9百合多糖的还原力
分别考察实施例1和对比例1提取的百合多糖对O2 -•的抑制作用。
百合多糖的还原力采用邻苯三酚法测定:6mmol/L的邻苯三酚中加入不同浓度多糖为被测液,以蒸馏水代替糖液做对照,在 pH8.0,0.7mol/L磷酸缓冲液中于325nm 每隔30s测一次光吸收值A,检测百合多糖对O2 —·的还原力。并且与对比例1的普通高温水提法所得百合多糖进行对比。
抑制率=(A0-Ai)/A0×100%
其中 A0为空白对照的吸光值,Ai为加样品的吸光值。
结果如由图6所示,百合多糖对邻苯三酚自氧化体系产生的 O2 -•均有一定清除作用,且随加入量的增加,清除率上升,呈现一种正相关关系。并且相同糖浓度下实施例1(超声+机械破壁)提取的多糖对O2 -•的清除率显著高于普通高温水提多糖,说明本发明方法可显著提高大花卷丹百合多糖的抗氧化活性。
实施例10百合多糖对羟基自由基(•OH)的清除能力
羟自由基是一个氧化能力很强的自由基,可使糖类、核酸、氨基酸和脂类等发生氧化,直接损伤各种生物膜,导致多种疾病的发生,从而对生物体产生危害。本实施例分别考察实施例1和对比例1提取的百合多糖对羟基自由基的清除能力。
百合芯多糖对羟基自由基(•OH)的清除能力根据 Smirnoff 的水杨酸法测定:将各百合多糖及Vc 配成浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/ml 的溶液。整个反应体系中含 9 mmol/L H2O2 1.0 mL、9 mmol/L FeSO4 1.0 mL、9 mmol/L 水杨酸-乙醇1.0 mL,各浓度百合多糖溶液 1.0 mL,混匀后加入 9 mmol/L H2O21.0mL 启动整个反应。37 ℃反应 30min 后,5000 r/min离心 10 min,然后以同体积的蒸馏水做参比溶液,在510 nm 下测定吸光度。同时以 9 mmol/L 水杨酸-乙醇1.0 mL、待测溶液 1.0 mL、9 mmol/L FeSO4 1.0 mL作为待测溶液的本底吸收值,以同体积蒸馏水 1.0 mL 代替待测样液为空白组测定吸光度。多糖对•OH自由基的清除能力按下列公式计算:
•OH/自由基清除率%=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%
其中, A0为空白对照的吸光值,Ai为加样品的吸光值,Aj为不加显色剂H 2O2的吸光值。并且与普通高温水提法所得百合多糖进行对比。
结果图7显示,浓度在 0.2~1.0mg/mL范围时,相同糖浓度下实施例1(超声+机械破壁)提取的多糖对•OH的抑制率显著高于对比例1普通高温水提所得百合多糖。说明本发明方法可显著提高大花卷丹百合多糖的抗氧化活性。随着多糖浓度的增大,增大到一定范围内时百合多糖对•OH的抑制率趋于稳定。
综上,本发明通过三因素三水平(超声时间、破壁时间、水提温度)结合单因素分析得到大花卷丹百合多糖的最佳提取条件为:温度为60℃,料液比为1:8,时间为40min,超声时间为 8 min、pH 值为 7、超声功率为180 W,最终获得百合多糖得率为18.6%±0.16%,批间误差小,工艺稳定性好。通过超声处理和机械破壁的方法,可以有效促进细胞内的多糖成分溶解到溶剂中,大大降低了提取温度和料液比,并且为提取节省时间和能耗,节省成本。并且通过对(O2 -•)和(•OH)的抑制作用的分析,证明此方法所得的百合多糖的活性成分明显高于与普通高温水提发所得的百合多糖。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例,毋庸置疑,对于本领域的普通技术人员,在不偏离本发明的精神和范围的情况下,可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此,上述附图和描述在本质上是说明性的,不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (1)
1.一种百合多糖的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、原材料处理
长白山甜百合鳞茎逐片掰开清洗干净后,晾干表面水分,投入研磨机内研磨成浆,得到百合浆液;
步骤2、原料超声处理
将百合浆液与纯水混合,放入高功率超声振荡器内,以超声波功率为 270 W,超声波频率为 20 kHz,超声波探头直径为 25 mm,声波深度3.5 cm,进行超声8 min,得到超声后的百合浆液;
步骤3、原料机械破壁
将超声后的百合浆液投入到超微水冷破壁机内,进行10 min破壁处理,然后用纯水反复冲洗破壁机仓并与破壁后的百合浆液混合,得到破壁后的百合浆液;
步骤4、百合多糖的浸提
将破壁后的百合浆液在水浴锅中60℃回流浸提40min,过滤残渣,经浓缩后用8倍量的95%乙醇溶液沉淀24 h,4000 r/min 离心 10 min,然后用sevage法除去其中蛋白质,所得沉淀为百合多糖。
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