CN111334540B - 一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：S1.将铁皮石斛茎条切成茎条段，置于烘箱中烘干，用高速粉碎机粉碎得到铁皮石斛粉；S2.将铁皮石斛粉加入水中，用胶体磨处理后加入高压均质机均质处理，取出后过筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；S3.将培养基接种于酵母菌，摇瓶培养后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，继续培养后得到发酵液；S4.将步骤S3所得发酵液离心分离得到上清液；S5.将步骤S4所得上清液稀释后上样于吸附柱内的树脂填料中，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置后离心分离得到沉淀物，烘干后得到铁皮石斛多糖。本发明提取得到铁皮石斛多糖的得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。

Description

一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法。

背景技术

铁皮石斛是兰科植物石斛属的一种，是我国传统的中药材。铁皮石斛自古以来就被人们称为“药中黄金”，道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“九大仙草”之首，民间称其为“救命仙草”。铁皮石斛对生长环境的要求比较苛刻，栽培困难，加上人们对铁皮石斛的过度采摘，导致了铁皮石斛资源濒临灭绝，铁皮石斛已被列为国家二级保护濒危植物。近年来的研究表明，铁皮石斛中的主要活性成分为石斛多糖、石斛碱、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分，其中石斛多糖是最重要的功效物质之一。

随着铁皮石斛功效作用的开发和植物组织培养技术的应用，石斛多糖的应用范围得以扩展。除了作为传统的中草药之外，铁皮石斛多糖还被应用于某些疾病的治疗和预防，保健养生，保养护肤等方面。铁皮石斛多糖的常规提取方法包括热水提取，有机溶剂萃取等过程，但铁皮石斛多糖含量高粘度大，经水提取后石斛多糖呈绿褐色，色素含量高，且高温会破坏石斛多糖提取物的活性。

申请号为CN201711480845.5的中国发明公开了“一种铁皮石斛多糖的提取工艺”，其工艺步骤是：原料除去枝叶、洗净、压榨、粉碎、冷冻、解冻、过筛、有机溶剂回流脱脂、水提、抽滤、真空浓缩、复溶、活性炭脱色、过滤、醇降，过滤、挥发、粗品、复溶、酶解除淀粉、醇降、过滤、复溶、纳米膜透析、醇降，过滤、冷冻干燥，得石斛多糖纯品。该专利存在的问题是其提取铁皮石斛多糖的得率不理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，其提取得到铁皮石斛多糖的得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成2-3cm长的茎条段，置于烘箱中烘干12-24小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入水中，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；

S3.将培养基接种于酵母菌，摇瓶培养后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为10-72小时；

S4.将步骤S3所得发酵液离心分离5-20分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释后上样于吸附柱内的树脂填料中，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物烘干后得到铁皮石斛多糖。

进一步地，本发明所述步骤S1中，烘干温度为50-65℃。

进一步地，本发明所述步骤S2中，铁皮石斛粉与水的重量比为1:55；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min。

进一步地，本发明所述步骤S3中，培养基的重量百分比组成为蔗糖1-5％，三叉黑顶藻提取物0.2％，其余为水；酵母菌的体积为培养基体积的1-10％，摇瓶培养的温度为28℃，摇瓶培养的速度为200rpm，摇瓶培养的时间为0.5-10小时，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:(30-150)。

进一步地，本发明所述三叉黑顶藻提取物的制备步骤为：

将三叉黑顶藻洗净后晒干，粉碎后过80目筛得到三叉黑顶藻粉末，将三叉黑顶藻粉末加入水中，超声提取1小时得到提取液，将提取液离心后取上清液，将上清液旋蒸浓缩后醇沉得到沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤后真空冷冻干燥得到三叉黑顶藻提取物。

进一步地，本发明所述三叉黑顶藻提取物的制备步骤中，三叉黑顶藻粉末与水的重量比为1:45，超声提取时的超声功率为400W。

进一步地，本发明所述步骤S4中，离心分离的速度为3000-7000rpm。

进一步地，本发明所述步骤S5中，上清液的稀释倍数为1-3倍，上样流速为0.5-5mL/min，上样pH值为4.5-6.5，洗脱液与无水乙醇的体积比为1:(3-9)，烘干温度为50-65℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明主要通过微生物发酵铁皮石斛，再通过分离纯化得到石斛多糖，发酵过程中微生物生长所产生的酶对铁皮石斛的纤维和细胞壁等进行分解，从而释放出铁皮石斛组织中的活性成分，同时微生物产生的酶还能分解石斛多糖，降低石斛多糖的分子量，使得发酵后的铁皮石斛粘度降低，利于后续的纯化分离，因此利用本发明提取铁皮石斛多糖具有提取物粘度低，杂质易分离的特点，而且得率、蛋白质清除率和脱色率均较高。

2)本发明在发酵之前对铁皮石斛粉还进行了高压均匀处理，该操作有利于铁皮石斛多糖从铁皮石斛中分离出来，能进一步提高本发明的得率和脱色率。

3)本发明使用的培养基中还添加了三叉黑顶藻提取物，其由三叉黑顶藻经超声提取而成，具有能提高发酵效率的活性成分，因此能进一步提高本发明的得率、蛋白质清除率和脱色率。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成2cm长的茎条段，置于烘箱中55℃下烘干18小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入55倍重量的水中，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min；

S3.将培养基接种于体积为培养基2％的酵母菌，28℃、速度为200rpm条件下摇瓶培养2小时后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:60，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为36小时；培养基的重量百分比组成为蔗糖3％，三叉黑顶藻提取物0.2％，其余为水；

S4.将步骤S3所得发酵液速度为4000rpm条件下离心分离10分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释1倍后上样于吸附柱内的树脂填料中，上样流速为2mL/min，上样pH值为5.5，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入4倍体积无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物55℃下烘干后得到铁皮石斛多糖。

其中，三叉黑顶藻提取物的制备步骤为：

将三叉黑顶藻洗净后晒干，粉碎后过80目筛得到三叉黑顶藻粉末，将三叉黑顶藻粉末加入45倍重量的水中，超声功率为400W条件下超声提取1小时得到提取液，将提取液离心后取上清液，将上清液旋蒸浓缩后醇沉得到沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤后真空冷冻干燥得到三叉黑顶藻提取物。

实施例2

利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成3cm长的茎条段，置于烘箱中50℃下烘干24小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入55倍重量的水中，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min；

S3.将培养基接种于体积为培养基1％的酵母菌，28℃、速度为200rpm条件下摇瓶培养5小时后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:30，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为72小时；培养基的重量百分比组成为蔗糖5％，三叉黑顶藻提取物0.2％，其余为水；

S4.将步骤S3所得发酵液速度为7000rpm条件下离心分离5分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释3倍后上样于吸附柱内的树脂填料中，上样流速为5mL/min，上样pH值为6.5，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入3倍体积无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物50℃下烘干后得到铁皮石斛多糖。

三叉黑顶藻提取物的制备步骤与实施例1相同。

实施例3

利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成2cm长的茎条段，置于烘箱中60℃下烘干15小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入55倍重量的水中，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min；

S3.将培养基接种于体积为培养基10％的酵母菌，28℃、速度为200rpm条件下摇瓶培养0.5小时后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:150)，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为10小时；培养基的重量百分比组成为蔗糖1％，三叉黑顶藻提取物0.2％，其余为水；

S4.将步骤S3所得发酵液速度为3000rpm条件下离心分离20分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释1倍后上样于吸附柱内的树脂填料中，上样流速为0.5mL/min，上样pH值为4.5，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入9倍体积无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物60℃下烘干后得到铁皮石斛多糖。

三叉黑顶藻提取物的制备步骤与实施例1相同。

实施例4

利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成2cm长的茎条段，置于烘箱中65℃下烘干12小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入55倍重量的水中，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min；

S3.将培养基接种于体积为培养基5％的酵母菌，28℃、速度为200rpm条件下摇瓶培养1小时后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:50，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为20小时；培养基的重量百分比组成为蔗糖2％，三叉黑顶藻提取物0.2％，其余为水；

S4.将步骤S3所得发酵液速度为5000rpm条件下离心分离15分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释2倍后上样于吸附柱内的树脂填料中，上样流速为1mL/min，上样pH值为5，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入5倍体积无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物65℃下烘干后得到铁皮石斛多糖。

三叉黑顶藻提取物的制备步骤与实施例1相同。

参比实施例1

与实施例1不同的是不包括步骤S2，用步骤S1所得铁皮石斛粉替换步骤S3中使用的铁皮石斛细粉。

参比实施例2

与实施例1不同的是步骤S3中的培养基不包括三叉黑顶藻提取物。

参比实施例3

与实施例1不同的是用三叉黑顶藻替换步骤S3中的三叉黑顶藻提取物。

对比例：申请号为CN201711480845.5的中国发明的实施例一。

试验例一：铁皮石斛多糖得率测试

铁皮石斛投料量为W，所得铁皮石斛多糖量为W1，多糖得率为Y，计算公式为Y＝W1/W×100％。实施例1-4、参比实施例1-3以及对比例的铁皮石斛多糖得率的测试结果如表1所示：

	铁皮石斛多糖得率(％)
		实施例1	34.4
实施例2	28.6
		实施例3	24.2
实施例4	31.5
		参比实施例1	22.7
参比实施例2	21.3
		参比实施例3	23.8
对比例	10.6

表1

从表1可看出，本发明实施例1-4的铁皮石斛多糖得率明显高于对比例，实施例1最高。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，参比实施例1、2的铁皮石斛多糖得率均下降很多，说明发酵前对铁皮石斛进行的高压均质处理以及培养基中的三叉黑顶藻提取物均能有效提高铁皮石斛多糖得率；参比实施例3的铁皮石斛多糖得率比参比实施例2高一些，说明相对于三叉黑顶藻而言，其提取物对铁皮石斛多糖得率的提高效果更佳。

试验例二：蛋白质清除率测试

采用Lowry法，在试管中加入1mL的待测溶液，分别加入5mL碱性铜试剂和1mL福林酚试剂，30℃下保温30min后在650nm处测量吸光度值。同时以牛血清蛋白为对照样品作标准曲线，根据标准曲线算出样品中蛋白质浓度。最终样品中蛋白质的量为W2，发酵液的上清液中蛋白质的量为W3，蛋白质清除率为X，计算公式为X＝(W3-W2)/W3×100％。实施例1-4、参比实施例1-3以及对比例(对比例中的W3为步骤(6)所得合并滤液中蛋白质的量)的蛋白质清除率的测试结果如表2所示：

	蛋白质清除率(％)
		实施例1	92.1
实施例2	85.3
		实施例3	86.4
实施例4	90.5
		参比实施例1	92.0
参比实施例2	77.2
		参比实施例3	80.6
对比例	72.8

表2

从表2可看出，本发明实施例1-4的蛋白质清除率明显高于对比例，实施例1最高。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，参比实施例2的蛋白质清除率下降很多，说明培养基中的三叉黑顶藻提取物能有效提高蛋白质清除率；参比实施例3的蛋白质清除率比参比实施例2高一些，说明相对于三叉黑顶藻而言，其提取物对蛋白质清除率的提高效果更佳。

试验例三：脱色率测试

以蒸馏水作参比，对铁皮石斛多糖树脂吸附前后的溶液进行全波长扫描。在400-760nm波长范围内每隔10nm测吸光度，计算吸光度的平均值。脱色前的平均吸光度为A0，脱色后的平均吸光度为A1，脱色率的计算公式为：脱色率＝(A0-A1)/A0×100％。实施例1-4、参比实施例1-3的脱色率的测试结果如表3所示：

表3

从表3可看出，本发明实施例1-4的脱色率均较高，实施例1最高。参比实施例1-3的部分步骤与实施例1不同，参比实施例1、2的脱色率均下降很多，说明发酵前对铁皮石斛进行的高压均质处理以及培养基中的三叉黑顶藻提取物均能有效提高脱色率；参比实施例3的脱色率比参比实施例2高一些，说明相对于三叉黑顶藻而言，其提取物对脱色率的提高效果更佳。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.将铁皮石斛茎条切成2-3cm长的茎条段，置于烘箱中50-65℃下烘干12-24小时，用高速粉碎机粉碎至50目得到铁皮石斛粉；

S2.将铁皮石斛粉加入水中，铁皮石斛粉与水的重量比为1:55，用胶体磨处理15分钟后加入高压均质机均质处理20分钟，取出后过80目筛，灭菌后得到铁皮石斛细粉；均质处理过程中，压力为25Mpa，时间为20分钟，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为90℃，进料温度为60℃，进料速度为10mL/min；

S3.培养基接种酵母菌，28℃、200rpm速度条件下摇瓶培养0.5-5小时后得到培养液，投料步骤S2所得铁皮石斛细粉，继续培养后得到发酵液，摇瓶培养和继续培养的总时间为10-72小时；培养基的重量百分比组成为蔗糖1-5%，三叉黑顶藻提取物0.2%，其余为水；酵母菌的体积为培养基体积的1-10%，铁皮石斛细粉与培养液的重量比为1:（30-150）；三叉黑顶藻提取物的制备步骤为：

将三叉黑顶藻洗净后晒干，粉碎后过80目筛得到三叉黑顶藻粉末，将三叉黑顶藻粉末加入水中，三叉黑顶藻粉末与水的重量比为1:45，400W超声功率条件下超声提取1小时得到提取液，将提取液离心后取上清液，将上清液旋蒸浓缩后醇沉得到沉淀，将沉淀用无水乙醇洗涤后真空冷冻干燥得到三叉黑顶藻提取物；

S4.将步骤S3所得发酵液离心分离5-20分钟得到上清液；

S5.将步骤S4所得上清液稀释后上样于吸附柱内的树脂填料中，洗脱并收集洗脱液，将洗脱液加入无水乙醇，搅拌至产生沉淀，静置5分钟后离心分离得到沉淀物，将沉淀物烘干后得到铁皮石斛多糖。

2.根据权利要求1所述的一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：所述步骤S4中，离心分离的速度为3000-7000rpm。

3.根据权利要求2所述的一种利用生物发酵提取铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：所述步骤S5中，上清液的稀释倍数为1-3倍，上样流速为0.5-5mL/min，上样pH值为4.5-6.5，洗脱液与无水乙醇的体积比为1:（3-9），烘干温度为50-65℃。