CN114807202A - 噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和定向进化方法，该进化***包含AV1质粒、AV2质粒和噬菌体，AV1质粒、AV2质粒的核酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。对纤维寡糖转运蛋白定向进化方法包括：将AV1质粒和AV2质粒共转化宿主菌，得到进化用工程菌；将噬菌体和步骤1获得的进化用工程菌在含有纤维寡糖的培养基中经过多轮进化培养，在多轮进化培养过程中，纤维寡糖在培养基中的浓度递减以增加筛选压力，获得突变体蛋白。本发明设计了一种可视化噬菌体辅助持续定向进化***，该***包括AV1质粒和AV2质粒，采用该进化***进化纤维寡糖转运蛋白，可以实现纤维寡糖转运蛋白的可视化高通量进化过程，并避免过多人为干预，进化效率更高更灵敏，进而大大提高LacY对纤维寡糖的转运能力。

Description

噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和方法。

背景技术

在基因组中，大约有30％的基因产物是膜蛋白，这个比例显示膜蛋白在生物体中的重要性。膜蛋白主要包括信号受体、转运蛋白、离子通道蛋白及一些酶类，对细胞代谢、生理平衡、胞内调节至关重要。在药物研发设计过程中，很多膜蛋白是药物设计的靶点，然而膜蛋白结构及生化信息的匮乏制约了药物设计的发展，因为膜蛋白的不稳定性及不溶性导致科研人员很难获得高纯度的膜蛋白进行其三维结构的解析及研究。针对膜蛋白的这些特性，定向进化或许可用作为强有力的工具帮助科研人员理解膜蛋白结构及其生物功能的关系。

哈佛大学David R Liu团队发明了一种噬菌体辅助持续进化***(PACE)。该***主要包含三个部分，第一部分将需要进化的基因置于噬菌体M13基因组上并替换原有的gIII基因，形成SP，SP缺少gIII无法侵染宿主并产生子代噬菌体；第二部分将SP侵染及产生子代噬菌体所需的gIII基因置于额外的质粒上进行表达，形成辅助质粒AP，gIII的表达受SP上的目的基因活性的调控，即将SP在细胞内的繁殖能力与目的基因的生物活性偶联在一起；第三部分是诱变质粒MP，利用***糖诱导物诱导MP上的基因DNAQ926、dam和seqA表达，使DNA复制过程中错误碱基不能修复，突变率提高几百倍。当带有目的基因的SP侵染宿主后，SP在宿主胞内进行遗传物质的复制，在MP的帮助下，会产生SP的各种突变体。若SP上的目的基因获得正向突变，则AP质粒上的gIII蛋白表达，能够包装出具有侵染性的子代SP噬菌体并分泌到包外，进入下一轮的侵染、突变、子代循环；若SP上的目的基因不突变或者负面突变，则AP质粒上的gIII蛋白不表达，产生的子代不分泌到包外或者数量较少；进化池是以一定流速持续被稀释，正面突变的SP可以持续产生子代并保留在池中，负面突变的SP会不断被流出池中并消失。David R Liu团队用PACE***成功进化了T7 RNA聚合酶(NATURE.2011April；472:498–505)、蛋白酶(Nature Communications,2014,5:5352.)、DNA结合蛋白(Nature Methods,2015,12(10):939.)并赋予这些蛋白新的特性，但该PACE进化***需要依赖昂贵的操作设备，因而成本较高，且该***并不适合对纤维寡糖转运蛋白进行定向进化。我们之前申请的专利《一种质粒以及噬菌体辅助的连续定向进化***和定向进化方法》对PACE进化***进行了改进，并成功用于纤维寡糖转运蛋白的进化，但是其还存在一定缺陷，其一，人为干预较多；其二，提高突变率的诱导方式为***糖诱导，可能与本身的纤维寡糖诱导的PACE***存在干扰。其三，PIII的本地本底表达对进化***有负面影响，会降低进化效率。

发明内容

针对现有技术存在的问题和缺陷，本发明提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和方法，无需较多人为干预操作，无干扰，且进化效率高。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***，包含AV1质粒、AV2质粒和噬菌体，所述AV1质粒、所述AV2质粒的核酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示；所述AV1质粒为gIII表达的辅助质粒，在gIII启动子下游具有CelRS序列，核糖体结合位点RBS两侧具有用于翻译抑制的发卡结构，所述发卡结构的序列为：ATAAGTGCAAATGCTTGTTCTATCGTCTTGAAACAGAGGAGACAAGACATGAGAACAAGCgtG；所述发卡结构的解除由与其互补的SRNA序列完成，所述SRNA序列由启动子启动并由CelR抑制其转录；所述CelR蛋白基因位于AV1质粒上组成型表达；所述AV2质粒由pPSP启动子启动。

进一步地，所述噬菌体为SP-LacY，是M13噬菌体的gIII基因被待进化的基因LacY替代形成。

优选地，所述AV1质粒的gIII基因启动子为pTAC。

优选地，所述SRNA序列启动子为pTAC。

第二个方面，本发明提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化方法，包括以下步骤：

步骤1，将AV1质粒和AV2质粒共转化宿主菌，得到进化用工程菌；

步骤2，将噬菌体和步骤1获得的进化用工程菌在含有纤维寡糖的培养基中经过多轮进化培养，在多轮进化培养过程中，纤维寡糖在培养基中的浓度递减以增加筛选压力，获得突变体蛋白。

进一步地，所述宿主菌为携带F因子的大肠杆菌。

优选地，所述携带F因子的大肠杆菌为大肠杆菌FM15，基因型为F’proA+B+lacI qΔ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/λ–ilvG–rfb-50rph-1attB::Kan RΔ(lacZ)M15；其构建方法包括：将MG1655大肠杆菌菌株与K12 ER2738(NEB公司)杂交，赋予MG1755菌株F因子；用λRed敲除技术敲除LacZ基因α片段，所得菌株即为FM15。

可选地，所述步骤2的具体操作过程为：第一轮进化培养，所述噬菌体的滴度为1×10⁹pfu/mL，将进化用工程菌点在含0.01g/mL纤维寡糖的LB软琼脂正中央，在离宿主菌位点1～1.5cm处分别点三个噬菌体液滴，每个液滴的体积为1-2uL；第二轮进化培养及以后，将纤维寡糖在培养基中的浓度逐步降低，并且该轮进化培养的噬菌体用前一轮进化后的噬菌体稀释100倍点板，直到扇形板形成困难或突变体库不再发生变化为止，每轮取样测序检测LacY突变累计情况。

可选地，第二轮进化培养及以后的纤维寡糖在培养基中的浓度降低为前一轮的1/2，或者根据斑大小调整浓度。

第三个方面，本发明提供一种纤维寡糖转运蛋白的突变体蛋白，是采用上述进化方法获得。

第四个方面，本发明提供上述突变体蛋白的表达载体，包括所述突变体蛋白的突变位点或突变位点的组合。

第五个方面，本发明提供上述突变体蛋白在转运纤维寡糖上的应用。

本发明的有益效果为：本发明设计了一种可视化噬菌体辅助持续定向进化***，该***包括AV1质粒和AV2质粒，采用该进化***进化纤维寡糖转运蛋白，可以实现纤维寡糖转运蛋白的可视化高通量进化过程，并避免过多人为干预，进化效率更高更灵敏，进而大大提高LacY蛋白对纤维寡糖的转运能力。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型噬菌体SP-lacY的基因图谱。

图2为本发明实施例1中AV1质粒图谱。

图3为本发明实施例1中AV2质粒图谱。

图4为本发明实施例1中采用PACE***进化纤维寡糖转运蛋白对纤维二糖的操作原理图。

图5为本发明实施例1的进化***本底压制效果，图1)为不加纤维二糖对照图，图2)为加入了1mM纤维二糖的效果图。

图6为本发明实施例2中进化***进化LacY对纤维二糖转运活性突变位点累计情况。

图7为本发明实施例3中AV3-LacY质粒图谱。

图8为本发明实施例3中AV4质粒图谱。

图9为本发明实施例8中野生型LacY和突变A177V在10uM纤维二糖诱导下的荧光分布图。

图10为本发明实施例4中野生型LacY和突变A177V在0.4mM纤维三糖诱导下的荧光分布图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***，包括：AV1质粒、AV2质粒和噬菌体，AV1质粒、AV2质粒的核酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。噬菌体，即M13噬菌体基因gIII被目的基因LacY替代形成的噬菌体SP-LacY：PCR扩增M13噬菌体大框架SP(不包含gIII基因)，PCR扩增野生型lacY基因，然后采用gibson连接M13噬菌体大框架SP和lacY基因形成SP-lacY双链质粒，基因图谱如图1所示，核酸序列如SEQID NO.3所示。

野生型SP-LacY的获取方法具体如下：

1)AV1及AV2共转化FM15感受态细胞，获得宿主FM15-AV1/AV2，该宿主在没有LacY蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.9)将纤维二糖转运进胞内前，AV1上表达的CelR蛋白与gIII上游的CelR识别位点结合，阻遏下游基因gIII的表达。

2)PCR扩增(M13-F:ttccgtcaatatttaccttccctccct，M13-R:gttgaaaatctccaaaaaaaaaggctccaaaagg，扩增程序：98℃10s，55℃10s，72℃1min，循环30次)M13噬菌体大框架SP(不包含gIII基因)，PCR扩增野生型lacY基因(LacY-F:ggctccttttggagcctttttttttggagattttcaacatgtactatttaaaaaacacaaacttttggatgttcg，LacY-R:aggtaaatattgacggaattaagcgacttcattcacctgacgac，扩增程序：98℃10s，55℃10s，72℃10s，循环30次)，gibson组装酶连接M13噬菌体大框架SP和lacY基因形成SP-lacY双链质粒，连接产物备用。

3)将步骤2)的连接产物转化宿主FM15-AV1/AV2感受态细胞，复苏2h并添加终浓度为0.01g/mL的纤维二糖，复苏阶段LacY将纤维二糖转运进胞内，胞内纤维二糖解除CelR蛋白对AP1上gIII蛋白的抑制效果，gIII得到表达，噬菌体在胞内包装并分泌具有侵染能力的子代SP-lacY噬菌体，复苏后的菌与软琼脂混合均匀平铺于含固体琼脂的平板上。于37℃过夜，取平板上单个噬菌斑于5mL的对数期(OD600＝0.4)FM15-AV1/AV2宿主菌中，补加终浓度1％的纤维二糖，37℃，150rpm培养6h。培养液离心上清0.22uM滤膜过滤，即为野生型SP-lacY噬菌体，验证野生型SP-lacY噬菌体滴度为1×10⁹pfu/mL左右。

AV1(基因图谱如图2所示)为gIII表达的辅助质粒，由启动子pTAC启动，在启动子下游紧接着包含CelRS序列，CelRS的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；RBS两侧包含发卡结构，用于翻译抑制；发卡结构的解除需要与其互补的SRNA序列(tctataagtgcaaatgcttgttctatcgtcttgttcacctattggaaacgggtccaataggtccc)(SEQ ID NO.5)来完成，该SRNA序列同样由另一个pTAC-CelRS启动及控制；CelR蛋白基因同样位于AV1质粒上组成型表达。发卡结构的序列为：

ataagtgcaaatgcttgttctatcgtcttgaaacagaggagacaagacatgagaacaagcgtg(SEQID NO.6)。

AV2(基因图谱如图3所示)质粒包含提高突变率的相关基因并全部由pPSP启动，还包含pPSP启动子所需的全部调控蛋白基因。

AV1和AV2质粒共转化FM15获得进化用的工程菌株FM15-AV1/AV2。验证宿主FM15-AV1/AV2对PIII本底表达的压制效果。具体操作原理如图4所示：将宿主FM15-AV1/AV2养至对数期(OD600＝0.4)，点在软琼脂板的正中央，噬菌体点在距离菌液1cm处；其中一个板不包含纤维二糖，另一个实验板子包含1mM纤维二糖，结果显示没有添加纤维二糖的板几乎看不见扇形板，而包含1mM纤维二糖的实验组具有超大并清晰的扇形斑，如图5所示，说明本套***具有更加优异的PIII本底压制效果和纤维二糖诱导效果。

实施例2

本实施例考察采用实施例1的进化***进化LacY的底物特异性，采用的是纤维二糖，具体操作如下：

初始噬菌体为野生型SP-lacY，滴度1×10⁹pfu/mL，宿主为FM15-AV1/AV2(OD600＝0.4)，宿主菌1-2uL点在LB软琼脂(含1mM的纤维二糖)正中央，在离宿主位点大概1cm处分别点三个噬菌体液滴(1-2uL)，隔天即可看见三个大的噬菌体扇形斑；第二轮类似，只是将纤维二糖浓度降低至200uM，噬菌体用第一轮进化后的噬菌体稀释100倍点板；之后的轮次，第三轮为40uM，第四轮10uM，第五轮2uM。直到扇形斑形成困难或不再发生新的突变为止。每轮取样测序检测LacY突变累计情况。结果显示在第二轮就出现了突变体的累计。

在进化的过程中，取扇形板最尾端的噬菌体纯化并送测序，查看LacY突变累计情况。进化结果如图6所示，显示突变体在第二轮就有累积，5轮就完成了整个进化过程，进化效率明显提高。

实施例3

进化产物LacY_A177V转运活性验证，采用的是纤维二糖：

构建质粒AV3-LacY_wild和AV3-LacY_A177V，其分别携带野生型LacY或者突变体LacY_A177V，并都由启动子J23109启动组成型表达(AV3-LacY_wild的质粒图谱如图7所示，AV3-LacY_wild的序列结构如SEQ ID NO.7)；构建质粒AV4(质粒图谱如图8所示，SEQ ID NO.8)，其携带报告基因GFP，由pTAC-CelRS启动，并受CelR和发卡结构双水平控制。

质粒AV3-LacY_wild和AV3-LacY_A177V分别转化菌株S1030-AV4，得到工程菌株S1030-AV4/AV3-LacY_wild和S1030-AV4/AV3-LacY_A177V。

S1030-AV4/AV3-LacY_wild和S1030-AV4/AV3-LacY_A177V分别在LB培养基中培养至对数期，添加10uM纤维二糖诱导GFP表达3h，离心并用PBSbuffer清洗菌体两次，将菌体稀释至1×10⁶/mL左右，用流式细胞仪测定两个样品的GFP表达情况。结果如图9所示，显示10uM纤维二糖浓度下lacY_A177V诱导产生的GFP信号明显高于野生型的lacY，说明位点A177V的突变明显提高了LacY转运纤维二糖的效率。

实施例4

进化产物LacY_A177V转运活性验证，采用的是纤维三糖：

LacY_A177V对纤维三糖的转运活性验证同实施例3，只是将诱导物改成0.4mM纤维三糖。结果如图10所示，显示突变体A177V在纤维三糖的诱导性比野生LacY具有更高的荧光信号。说明A177V的突变明显提高了LacY转运纤维三糖的效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州先进技术研究所

<120> 噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctagggcg gcggatttgt cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa 60

cgaaaggccc agtctttcga ctgagccttt cgttttattt gatgcctcta gattaattaa 120

ttaagcggcc gcatcgatcg ggccctgagg cctgcagggt acccatgttg acaattaatc 180

atcggctcgt ataatgtgtg gaatgggagc gctcccaagt aataagtgca aatgcttgtt 240

ctatcgtctt gaaacagagg agacaagaca tgagaacaag cgtgatgaaa aaattattat 300

tcgcaattcc tttagttgtt cctttctatt ctcactccgc tgaaactgtt catcaccatc 360

accatcacgc tgaaactgtt gaaagttgtt tagcaaaacc ccatacagaa aattcattta 420

ctaacgtctg gaaagacgac aaaactttag atcgttacgc taactatgag ggctgtctgt 480

ggaatgctac aggcgttgta gtttgtactg gtgacgaaac tcagtgttac ggtacatggg 540

ttcctattgg gcttgctatc cctgaaaatg agggtggtgg ctctgagggt ggcggttctg 600

agggtggcgg ttctgagggt ggcggtacta aacctcctga gtacggtgat acacctattc 660

cgggctatac ttatatcaac cctctcgacg gcacttatcc gcctggtact gagcaaaacc 720

ccgctaatcc taatccttct cttgaggagt ctcagcctct taatactttc atgtttcaga 780

ataataggtt ccgaaatagg cagggggcat taactgttta tacgggcact gttactcaag 840

gcactgaccc cgttaaaact tattaccagt acactcctgt atcatcaaaa gccatgtatg 900

acgcttactg gaacggtaaa ttcagagact gcgctttcca ttctggcttt aatgaggatc 960

cattcgtttg tgaatatcaa ggccaatcgt ctgacctgcc tcaacctcct gtcaatgctg 1020

gcggcggctc tggtggtggt tctggtggcg gctctgaggg tggtggctct gagggtggcg 1080

gttctgaggg tggcggctct gagggaggcg gttccggtgg tggctctggt tccggtgatt 1140

ttgattatga aaagatggca aacgctaata agggggctat gaccgaaaat gccgatgaaa 1200

acgcgctaca gtctgacgct aaaggcaaac ttgattctgt cgctactgat tacggtgctg 1260

ctatcgatgg tttcattggt gacgtttccg gccttgctaa tggtaatggt gctactggtg 1320

attttgctgg ctctaattcc caaatggctc aagtcggtga cggtgataat tcacctttaa 1380

tgaataattt ccgtcaatat ttaccttccc tccctcaatc ggttgaatgt cgcccttttg 1440

tctttggcgc tggtaaacct tacgagttca gtatcgactg cgataagatc aacctgttcc 1500

gcggtgtctt tgcgtttctt ttatatgttg ccacctttat gtatgtattt tctacgtttg 1560

ctaacatact gcgtaataag gagtcttaaa aatataatga ccctcttgat aacccaagag 1620

ggcatttttt aaagctctat aagtgcaaat gcttgttcta tcgtcttgtt cacctattgg 1680

aaacgggtcc aataggtccc accttgggag cgctcccatt ccacacatta tacgagccga 1740

tgattaattg tcaacacatg ccatggaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta 1800

atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 1860

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 1920

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 1980

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 2040

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 2100

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 2160

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 2220

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 2280

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 2340

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 2400

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 2460

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 2520

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 2580

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 2640

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 2700

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 2760

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 2820

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 2880

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 2940

agttttcgtt ccactgactc actagtgcta cgctcggtcg tttttacggc tagctcagtc 3000

ctaggtatag tgctagcgaa ttctagagaa agaggagaaa ctcgagatgg aacgtcgccg 3060

tcgcccgacc ctggaaatgg ttgcagccct ggccggtgtc tgtcgtggta cggtgagccg 3120

cgttattaac ggtagcgatc aggtctctcc ggcgacccgt gaagccgtga aacgcgcaat 3180

caaagaactg ggctatgtgc cgaatcgtgc agctcgtacc ctggtgaccc gtcgtaccga 3240

tacggttgca ctggtggttt ctgaaaacaa tcagaaactg tttgctgaac cgttctacgc 3300

gggtattgtg ctgggtgttg gtgtcgcact gagcgaacgt ggctttcaat tcgttctggc 3360

aaccggccgt tctggtatcg aacatgaacg cctgggcggt tatctggcag gccagcatgt 3420

cgatggtgtg ctgctgctgt cactgcaccg cgatgacccg ctgccgcaaa tgctggacga 3480

agcgggcgtt ccgtatgtct atggcggtcg tccgctgggt gtgccggaag aacaggtgtc 3540

gtacgttgat attgacaaca tcggtggtgg ccgtcaggca acccaacgtc tgattgaaac 3600

gggtcaccgt cgtattgcaa ccatcgcagg tccgcaggat atggtcgctg gcgtggaacg 3660

tctgcaaggt tatcgcgaag ccctgctggc ggccggtatg gaatacgacg aaaccctggt 3720

tagttatggc gattttacgt acgactccgg tgtcgcagct atgcgtgaac tgctggatcg 3780

tgcgccggat gttgacgcag tcttcgcagc cagtgacctg atgggcctgg cagctctgcg 3840

tgttctgcgt gcttccggtc gtcgcgtccc ggaagatgtg gcagtcgtgg gttatgatga 3900

ctcaaccgtg gcagaacatg ctgaaccgcc gatgacctcg gttaatcagc cgacggaact 3960

gatgggtcgt gaaatggcgc gcctgctggt ggatcgtatc accggtgaaa ccacggaacc 4020

ggtgcgcctg gttatggaaa cgcacctgat ggttcgtgaa tcaggctaac tgcaggtccc 4080

taagtctcct cagcctcggt accaaattcc agaaaagagg cctcccgaaa ggggggcctt 4140

ttttcgtttt ggtccgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 4200

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 4260

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 4320

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 4380

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 4440

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 4500

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 4560

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 4620

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 4680

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 4740

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggccg 4800

ctag 4804

<210> 2

<211> 6074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactcggtcg ctacgctccg ggcgtgagac tgcggcgggc gctgcggaca catacaaagt 60

tacccacaga ttccgtggat aagcagggga ctaacatgtg aggcaaaaca gcagggccgc 120

gccggtggcg tttttccata ggctccgccc tcctgccaga gttcacataa acagacgctt 180

ttccggtgca tctgtgggag ccgtgaggct caaccatgaa tctgacagta cgggcgaaac 240

ccgacaggac ttaaagatcc ccaccgtttc cggcgggtcg ctccctcttg cgctctcctg 300

ttccgaccct gccgtttacc ggatacctgt tccgcctttc tcccttacgg gaagtgtggc 360

gctttctcat agctcacaca ctggtatctc ggctcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 420

ggctgtaagc aagaactccc cgttcagccc gactgctgcg ccttatccgg taactgttca 480

cttgagtcca acccggaaaa gcacggtaaa acgccactgg cagcagccat tggtaactgg 540

gagttcgcag aggatttgtt tagctaaaca cgcggttgct cttgaagtgt gcgccaaagt 600

ccggctacac tggaaggaca gatttggttg ctgtgctctg cgaaagccag ttaccacggt 660

taagcagttc cccaactgac ttaaccttcg atcaaaccac ctccccaggt ggttttttcg 720

tttacagggc aaaagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 780

tctactgaac cgctctagat ttcagtgcaa tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc 840

agcccaggag gaagaggaca tccggtcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 900

cctttcgttt tagacttagg gaccctttat gacaacttga cggctacatg atgaaattcg 960

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<210> 3

<211> 6587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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gccagtggcg ttttaccgtg cttttccggg ttggactcaa gtgaacagtt accggataag 1800

gcgcagcagt cgggctgaac ggggagttct tgcttacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1860

tacaccgagc cgagatacca gtgtgtgagc tatgagaaag cgccacactt cccgtaaggg 1920

agaaaggcgg aacaggtatc cggtaaacgg cagggtcgga acaggagagc gcaagaggga 1980

gcgacccgcc ggaaacggtg gggatcttta agtcctgtcg ggtttcgccc gtactgtcag 2040

attcatggtt gagcctcacg gctcccacag atgcaccgga aaagcgtctg tttatgtgaa 2100

ctctggcagg agggcggagc ctatggaaaa acgccaccgg cgcggccctg ctgttttgcc 2160

tcacatgtta gtcccctgct tatccacgga atctgtgggt aactttgtat gtgtccgcag 2220

cgcccgccgc agtctcacgc ccggagcgta gcgaccgagt gacggcctat ttggcttggc 2280

acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc actaccgggc gtattttttg 2340

agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata 2400

ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagtta 2460

ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa 2520

agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg 2580

ctcatccgga gttccgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc 2640

acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat 2700

accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg 2760

aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc 2820

cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc 2880

ccgttttcac tatgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga 2940

ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac 3000

aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaaacgcc atg 3043

<210> 8

<211> 4216

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctagggcg gcggatttgt cctactcagg agagcgttca ccgacaaaca acagataaaa 60

cgaaaggccc agtctttcga ctgagccttt cgttttattt gatgcctcta gattaattaa 120

ttaagcggcc gcatcgatcg ggccctgagg cctgcagggt acccatgttg acaattaatc 180

atcggctcgt ataatgtgtg gaatgggagc gctcccaagt aataagtgca aatgcttgtt 240

ctatcgtctt gaaacagagg agacaagaca tgagaacaag cgtgatgagc aaaggagaag 300

aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca 360

aattttctgt ccgtggagag ggtgaaggtg atgctacaaa cggaaaactc acccttaaat 420

ttatttgcac tactggaaaa ctacctgttc cgtggccaac acttgtcact actctgacct 480

atggtgttca atgcttttcc cgttatccgg atcacatgaa acggcatgac tttttcaaga 540

gtgccatgcc cgaaggttat gtacaggaac gcactatatc tttcaaagat gacgggacct 600

acaagacgcg tgctgaagtc aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa 660

agggtattga ttttaaagaa gatggaaaca ttcttggaca caaactcgag tacaacttta 720

actcacacaa tgtatacatc acggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca 780

aaattcgcca caacgttgaa gatggttccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata 840

ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg 900

tcctttcgaa agatcccaac gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg 960

ctgctgggat tacacatggc atggatgagc tctacaaata aaaatataat gaccctcttg 1020

ataacccaag agggcatttt ttaaagctct ataagtgcaa atgcttgttc tatcgtcttg 1080

ttcacctatt ggaaacgggt ccaataggtc ccaccttggg agcgctccca ttccacacat 1140

tatacgagcc gatgattaat tgtcaacaca tgccatggaa gggcctcgtg atacgcctat 1200

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 1260

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 1320

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 1380

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 1440

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 1500

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 1560

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 1620

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 1680

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 1740

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 1800

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 1860

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 1920

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 1980

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 2040

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 2100

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 2160

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 2220

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 2280

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 2340

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgac tcactagtgc tacgctcggt cgtttttacg 2400

gctagctcag tcctaggtat agtgctagcg aattctagag aaagaggaga aactcgagat 2460

ggaacgtcgc cgtcgcccga ccctggaaat ggttgcagcc ctggccggtg tctgtcgtgg 2520

tacggtgagc cgcgttatta acggtagcga tcaggtctct ccggcgaccc gtgaagccgt 2580

gaaacgcgca atcaaagaac tgggctatgt gccgaatcgt gcagctcgta ccctggtgac 2640

ccgtcgtacc gatacggttg cactggtggt ttctgaaaac aatcagaaac tgtttgctga 2700

accgttctac gcgggtattg tgctgggtgt tggtgtcgca ctgagcgaac gtggctttca 2760

attcgttctg gcaaccggcc gttctggtat cgaacatgaa cgcctgggcg gttatctggc 2820

aggccagcat gtcgatggtg tgctgctgct gtcactgcac cgcgatgacc cgctgccgca 2880

aatgctggac gaagcgggcg ttccgtatgt ctatggcggt cgtccgctgg gtgtgccgga 2940

agaacaggtg tcgtacgttg atattgacaa catcggtggt ggccgtcagg caacccaacg 3000

tctgattgaa acgggtcacc gtcgtattgc aaccatcgca ggtccgcagg atatggtcgc 3060

tggcgtggaa cgtctgcaag gttatcgcga agccctgctg gcggccggta tggaatacga 3120

cgaaaccctg gttagttatg gcgattttac gtacgactcc ggtgtcgcag ctatgcgtga 3180

actgctggat cgtgcgccgg atgttgacgc agtcttcgca gccagtgacc tgatgggcct 3240

ggcagctctg cgtgttctgc gtgcttccgg tcgtcgcgtc ccggaagatg tggcagtcgt 3300

gggttatgat gactcaaccg tggcagaaca tgctgaaccg ccgatgacct cggttaatca 3360

gccgacggaa ctgatgggtc gtgaaatggc gcgcctgctg gtggatcgta tcaccggtga 3420

aaccacggaa ccggtgcgcc tggttatgga aacgcacctg atggttcgtg aatcaggcta 3480

actgcaggtc cctaagtctc ctcagcctcg gtaccaaatt ccagaaaaga ggcctcccga 3540

aaggggggcc ttttttcgtt ttggtccgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3600

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3660

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3720

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3780

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 3840

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3900

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 3960

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4020

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4080

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4140

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4200

gcaacgcggc cgctag 4216

<210> 9

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Tyr Tyr Leu Lys Asn Thr Asn Phe Trp Met Phe Gly Leu Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Tyr Phe Phe Ile Met Gly Ala Tyr Phe Pro Phe Phe Pro Ile

20 25 30

Trp Leu His Asp Ile Asn His Ile Ser Lys Ser Asp Thr Gly Ile Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Leu Phe Gln Pro Leu Phe Gly

50 55 60

Leu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Trp Ile Ile

65 70 75 80

Thr Gly Met Leu Val Met Phe Ala Pro Phe Phe Ile Phe Ile Phe Gly

85 90 95

Pro Leu Leu Gln Tyr Asn Ile Leu Val Gly Ser Ile Val Gly Gly Ile

100 105 110

Tyr Leu Gly Phe Cys Phe Asn Ala Gly Ala Pro Ala Val Glu Ala Phe

115 120 125

Ile Glu Lys Val Ser Arg Arg Ser Asn Phe Glu Phe Gly Arg Ala Arg

130 135 140

Met Phe Gly Cys Val Gly Trp Ala Leu Cys Ala Ser Ile Val Gly Ile

145 150 155 160

Met Phe Thr Ile Asn Asn Gln Phe Val Phe Trp Leu Gly Ser Gly Cys

165 170 175

Ala Leu Ile Leu Ala Val Leu Leu Phe Phe Ala Lys Thr Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Ser Ala Thr Val Ala Asn Ala Val Gly Ala Asn His Ser Ala Phe

195 200 205

Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Leu Phe Arg Gln Pro Lys Leu Trp Phe

210 215 220

Leu Ser Leu Tyr Val Ile Gly Val Ser Cys Thr Tyr Asp Val Phe Asp

225 230 235 240

Gln Gln Phe Ala Asn Phe Phe Thr Ser Phe Phe Ala Thr Gly Glu Gln

245 250 255

Gly Thr Arg Val Phe Gly Tyr Val Thr Thr Met Gly Glu Leu Leu Asn

260 265 270

Ala Ser Ile Met Phe Phe Ala Pro Leu Ile Ile Asn Arg Ile Gly Gly

275 280 285

Lys Asn Ala Leu Leu Leu Ala Gly Thr Ile Met Ser Val Arg Ile Ile

290 295 300

Gly Ser Ser Phe Ala Thr Ser Ala Leu Glu Val Val Ile Leu Lys Thr

305 310 315 320

Leu His Met Phe Glu Val Pro Phe Leu Leu Val Gly Cys Phe Lys Tyr

325 330 335

Ile Thr Ser Gln Phe Glu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ile Tyr Leu Val

340 345 350

Cys Phe Cys Phe Phe Lys Gln Leu Ala Met Ile Phe Met Ser Val Leu

355 360 365

Ala Gly Asn Met Tyr Glu Ser Ile Gly Phe Gln Gly Ala Tyr Leu Val

370 375 380

Leu Gly Leu Val Ala Leu Gly Phe Thr Leu Ile Ser Val Phe Thr Leu

385 390 395 400

Ser Gly Pro Gly Pro Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gln Val Asn Glu Val

405 410 415

Ala

Claims (10)

1.一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和定向进化方法，其特征在于：包含AV1质粒、AV2质粒和噬菌体，所述AV1质粒、所述AV2质粒的核酸序列分别如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示；所述AV1质粒为gIII表达的辅助质粒，在gIII启动子下游具有CelRS序列，核糖体结合位点RBS两侧具有用于翻译抑制的发卡结构，所述发卡结构的序列为：ATAAGTGCAAATGCTTGTTCTATCGTCTTGAAACAGAGGAGACAAGACATGAGAACAAGCgtG；所述发卡结构的解除由与其互补的SRNA序列完成，所述SRNA序列由启动子启动并由CelR抑制其转录；所述CelR蛋白基因位于AV1质粒上组成型表达；所述AV2质粒由pPSP启动子启动。

2.根据权利要求1所述的一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和定向进化方法，其特征在于：所述噬菌体为SP-LacY，是M13噬菌体的gIII基因被待进化的基因LacY替代形成。

3.根据权利要求1所述的一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和定向进化方法，其特征在于：所述AV1质粒的gIII基因启动子为pTAC。

4.根据权利要求1所述的一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化***和定向进化方法，其特征在于：所述SRNA序列启动子为pTAC。

5.一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，将AV1质粒和AV2质粒共转化宿主菌，得到进化用工程菌；

步骤2，将噬菌体和步骤1获得的进化用工程菌在含有纤维寡糖的培养基中经过多轮进化培养，在多轮进化培养过程中，纤维寡糖在培养基中的浓度递减以增加筛选压力，获得突变体蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化方法，其特征在于：所述宿主菌为携带F因子的大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的一种噬菌体辅助的纤维寡糖转运蛋白连续定向进化方法，其特征在于：所述携带F因子的大肠杆菌为大肠杆菌FM15，基因型为F’proA+B+lacI qΔ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/λ–ilvG–rfb-50rph-1attB::Kan RΔ(lacZ)M15；其构建方法包括：将MG1655大肠杆菌菌株与K12 ER2738(NEB公司)杂交，赋予MG1755菌株F因子；用λRed敲除技术敲除LacZ基因α片段，所得菌株即为FM15。

8.一种纤维寡糖转运蛋白的突变体蛋白，其特征在于：是采用权利要求5～8任意一项所述的进化方法获得。

9.权利要求8所述的突变体蛋白的表达载体，其特征在于：包括所述突变体蛋白的突变位点或突变位点的组合。

10.权利要求8所述的一种纤维寡糖转运蛋白的突变体蛋白在转运纤维寡糖上的应用。

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