CN114736204A - 一种培西达替尼结构类似物的制备方法及其抗肿瘤中的应用 - Google Patents

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CN114736204A CN202210488501.3A CN202210488501A CN114736204A CN 114736204 A CN114736204 A CN 114736204A CN 202210488501 A CN202210488501 A CN 202210488501A CN 114736204 A CN114736204 A CN 114736204A
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    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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Abstract

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体公开了一种培西达替尼类似物的设计、合成及其在制备抗癌药物中的应用，具体涉及化合物5‑氯‑3‑{[2‑({[6‑(三氟甲基)吡啶‑3‑基]甲基}氨基)嘧啶‑5‑基]甲基}‑1H‑吡咯并[2,3‑b]吡啶的合成及其在制备抗癌药物中的应用。本发明的化合物在保留培西达替尼的基本药效母核5‑氯‑7‑氮杂吲哚的基础上，通过生物电子等排体原理对其结构进行修饰和优化，从而设计了一个具有潜在抗癌活性的培西达替尼类似物。以2‑氨基嘧啶‑5‑羧酸甲酯和6‑三氟甲基烟醛为原料，经六步反应合成了此化合物。细胞毒性实验表明该化合物能抑制癌细胞的增殖。细胞凋亡实验进一步验证了其具有诱导癌细胞调亡的能力。

Description

一种培西达替尼结构类似物的制备方法及其抗肿瘤中的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，涉及一种培西达替尼结构类似物的制备方法及其抗肿瘤中的应用，更具体涉及一种化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
培西达替尼(Pexidartinib)是一种集落刺激因子1受体(CSF-1R)抑制剂，于2019年在美国上市，被批准用于治疗腱鞘巨细胞瘤(TGCT)成人患者，该药是全球首个获批被用于治疗TGCT的药物，被授予孤儿药称号。同时，在体内外活性研究中发现，培西达替尼对胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、急性髓细胞样白血病、类风湿关节炎等也具有一定的治疗效果。本发明的化合物在保留培西达替尼的基本药效母核5-氯-7-氮杂吲哚的基础上，通过生物电子等排体原理对其结构进行修饰和优化，以期开发出新的具有抗肿瘤活性的培西达替尼类似物，扩宽该类药物的新适应症和治疗窗。
目前已报道的培西达替尼类似物均以5-氯-7-氮杂吲哚环为母核，这些类似物都显示出较强的抗癌活性。如维罗非尼(Bollag G,et al.Nature,2010)，该药于2011年被美国FDA批准用于治疗黑色素瘤；PLX-4720，该类似物在体外能显著抑制人结肠癌细胞COLO205、人恶性黑色素瘤细胞A375的增殖(Paraiso KH,et al.Cancer research,2011)；Bezuclastinib，该类似物对胃肠道间质瘤、转移癌有较强的治疗效果(WO2014100620)。
基于以上报道，为了扩宽培西达替尼类似物在抗癌领域的应用，本发明期望开发出新的培西达替尼类似物，探索该化合物新的抗癌活性。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，申请人为了开发出新的具有抗肿瘤活性的培西达替尼类似物，扩宽该类药物的新适应症和治疗窗，在保留培西达替尼的基本药效母核5-氯-7-氮杂吲哚的基础上，通过生物电子等排体原理对其结构进行修饰和优化。
本发明的第一个目的在于设计、合成了一种培西达替尼结构类似物—化合物(Ⅰ)：5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶，其结构式如下：
Figure BDA0003630236110000021
分子式：C19H14ClF3N6
分子量：418.8082
该化合物是在保留培西达替尼药效基团5-氯-7-氮杂吲哚的基础上，利用生物电子等排体原理进行结构修饰，从而得到了这种新的培西达替尼类似物，通过细胞实验证明，该类似物具有潜在的抗肿瘤活性和应用开发价值。
本发明的第二个目的在于提供了所述化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶在制备抗癌药物中的应用。
本发明对其进行了初步的体外活性评价。通过细胞毒性实验，以培西达替尼标准品作为对照，结果证明该化合物能显著抑制肿瘤细胞HOS、MCF-7、A549的生长；此外，通过细胞凋亡实验，进一步验证了其能诱导HOS与A549细胞的凋亡。
所述化合物(Ⅰ)，可以采用以下的工艺路线制备：
步骤一、以2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯和6-三氟甲基烟醛为原料，与还原剂作用，发生还原胺化反应得到中间体(Ⅱ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000031
其中，中间体(Ⅱ)的结构式为：
Figure BDA0003630236110000032
中间体(Ⅱ)的化学名称为：2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-甲酸甲酯。
步骤二、以中间体(Ⅱ)作为原料，与还原剂作用，发生还原反应得到中间体(Ⅲ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000033
其中，中间体(Ⅲ)的结构式为：
Figure BDA0003630236110000034
中间体(Ⅲ)的化学名称为：[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲醇。
步骤三、以中间体(Ⅲ)作为原料，与氧化剂作用，发生氧化反应得到中间体(Ⅳ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000041
其中，中间体(Ⅳ)的结构式为：
Figure BDA0003630236110000042
中间体(Ⅳ)的化学名称为：2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-甲醛。
步骤四、以中间体(Ⅳ)作为原料，与一种氨基的保护基作用，发生取代反应得到中间体(Ⅴ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000043
其中，中间体(Ⅴ)的结构式为：
Figure BDA0003630236110000044
中间体(Ⅴ)的化学通用名为：[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基})-(G-取代氨基)]嘧啶-5-甲醛。
步骤五、以中间体(Ⅴ)和5-氯-7-氮杂吲哚作为原料，在碱性条件下，发生加成反应得到中间体(Ⅵ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000051
其中，中间体(Ⅵ)的结构式为：
Figure BDA0003630236110000052
中间体(Ⅵ)的化学通用名为：{5-[(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)羟甲基]嘧啶-2-基}-{[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}-G-取代胺。
步骤六、以中间体(Ⅵ)作为原料，在酸性条件下，发生取代反应，脱除氨基保护基，同时与三乙基硅烷作用，脱除羟基，从而得到所述化合物(Ⅰ)，具体的反应路线如下：
Figure BDA0003630236110000053
在以上技术方案中，式中-G为一种氨基的保护基团，优选为叔丁氧羰基、芴甲氧羰基、对甲氧基苄基等。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤一中，所述的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、钯碳/H2、雷尼镍/H2、2-甲基吡啶-N-甲硼烷、三乙基硅烷、铑/CO中的一种。更加优选的，步骤一中，所述的还原剂为氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、三乙基硅烷、铑/CO中的一种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤一中，2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯：6-三氟甲基烟醛：还原剂的摩尔比为1：1～4：2～10。更加优选的，步骤一中，2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯：6-三氟甲基烟醛：还原剂的摩尔比为1：1.2～3：2～9。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤二中，所述的还原剂为氢化铝锂、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾、二异丁基氢化铝、硼氢化钠/氯化镁、硼氢化钠/氯化铝、硼氢化钠/氯化锌中的一种。更加优选的，步骤二中，所述的还原剂为氢化铝锂、硼氢化钠/氯化镁、硼氢化钠/氯化铝、硼氢化钠/氯化锌中的一种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤二中，中间体(Ⅱ)：还原剂的摩尔比为1：1～5。更加优选的，步骤二中，中间体(Ⅱ)：还原剂的摩尔比为1：1.2～4。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤三中，所述的氧化剂为二氧化锰、PDC氧化剂、PCC氧化剂、DMSO、戴斯-马丁氧化剂、Collins试剂、2-碘酰基苯甲酸、四丙基过钌酸铵、四甲基哌啶氧化物中的一种。更加优选的，步骤三中，所述的氧化剂为戴斯-马丁氧化剂、Collins试剂、四丙基过钌酸铵、四甲基哌啶氧化物中的任意一种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤三中，中间体(Ⅲ)：氧化剂的摩尔比为1：0.5～5。更加优选的，步骤三中，中间体(Ⅲ)：氧化剂的摩尔比为1：1～4。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤四中，所述的氨基保护试剂为氯甲酸苄酯、二碳酸二叔丁酯、芴甲氧羰酰氯、对甲氧基苄溴、溴化苄、对甲苯磺酰氯、三苯基氯甲烷、N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺中的一种。更加优选的，步骤四中，所述的氨基保护试剂为氯甲酸苄酯、二碳酸二叔丁酯、芴甲氧羰酰氯、对甲氧基苄溴中的任意一种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤四中，中间体(Ⅳ)：氨基保护剂的摩尔比为1：1～6。更加优选的，步骤四中，中间体(Ⅳ)：氨基保护剂的摩尔比为1：1.2～4.5。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤五中，提供碱性环境的物质为甲醇钠、乙醇钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、叔戊醇钠、叔戊醇钾中的一种或几种。更加优选的，步骤五中，提供碱性环境的物质为氢氧化钠、碳酸钾、叔丁醇钾、叔戊醇钾中的一种或几种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤五中，中间体(Ⅴ)：5-氯-7-氮杂吲哚：提供碱性环境物质的摩尔比为1：1～3：0.01～5。更加优选的，步骤五中，中间体(Ⅴ)：5-氯-7-氮杂吲哚：碱性试剂的摩尔比为1：1.2～2.5：0.01～4。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤六中，提供酸性环境的物质为甲酸、盐酸、氢溴酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、磷酸、三氟乙酸、溴化锌中的一种。更加优选的，步骤六中，提供酸性环境的物质为盐酸、氢溴酸、磷酸、三氟乙酸中的一种。
在以上技术方案基础上，优选的，步骤六中，中间体(Ⅵ)：提供酸性环境物质的摩尔比为1：0.5～85。更加优选的，步骤六中，中间体(Ⅵ)：酸性试剂的摩尔比为1：1～80。
与现有技术比较而言，本发明具有以下的有益效果：
(1)本发明以廉价易得的原料、温和的反应条件、简便的工艺路线，首次合成出了一种新的、具有潜在应用价值的生物活性分子。其次，在本工艺路线中，每步合成的中间体，亦为首次合成。
(2)本发明验证了该化合物具有潜在的抗癌活性，在体外，其能显著抑制HOS、MCF-7、A549细胞的生长，尤其对于HOS与A549细胞而言，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中间体(Ⅱ)2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-甲酸甲酯的质谱图；
图2为本发明中间体(Ⅲ)[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲醇的核磁共振氢谱图；
图3为本发明中间体(Ⅳ)2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-甲醛的红外光谱图；
图4为本发明中间体(Ⅴ)(5-甲酰基嘧啶-2-基){[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基甲酸叔丁酯的核磁共振氢谱图；
图5为本发明中间体(Ⅵ){5-[(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)羟甲基]嘧啶-2-基}-{[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基甲酸叔丁基酯的质谱图；
图6为化合物(Ⅰ)5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶的核磁共振氢谱图；
图7为HOS细胞毒性实验结果统计图(“*”表示数据间存在显著性差异且P小于0.05，“**”表示数据间存在显著性差异且P小于0.01)；
图8为MCF-7细胞毒性实验结果统计图(“***”表示数据间存在显著性差异且P小于0.001)；
图9为A549细胞毒性实验结果统计图(“*”表示数据间存在显著性差异且P小于0.05)；
图10为HOS细胞凋亡实验结果图(A、B为流式细胞图，C为柱状统计分析图)(“*”表示数据间存在显著性差异且P小于0.05，“**”表示数据间存在显著性差异且P小于0.01)；
图11为A549细胞凋亡实验结果图(A、B为流式细胞图，C为柱状统计分析图)(“*”表示数据间存在显著性差异且P小于0.05)。
具体实施方式
为了更方便本领域普通技术人员理解本发明，下面申请人结合具体的实施方式更好地说明本发明。应该指出的是，以下实施方式只是本专利申请保护范围内的一部分实施方式，并非全部的实施方式。在没有做出创造性改变的前提下，也应该视为本发明的保护范围之内。
以下各实施例中所用的试剂，全部为普通试剂，纯度为分析纯，所用的溶剂均未进一步处理，浓盐酸的浓度为37wt％，氢溴酸的浓度为48wt％。
实施例1、中间体(Ⅱ)的合成
1.1向单口烧瓶中，加入200mg 2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯，274.4mg 6-三氟甲基烟醛，将其溶解在20ml甲苯中，加入382.3mg氰基硼氢化钠、1ml浓盐酸。反应温度为100℃、反应32h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml10％m/v(m/v＝g/mL，下同，不赘述)碳酸钾水溶液，用100ml二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得385mg中间体(Ⅱ)，收率为94.41％。
1.1所得中间体(Ⅱ)的质谱表征结果如下：ESI-MS(m/z)：313.09[M+H]+，见附图1。
1.2向单口烧瓶中，加入300mg 2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯，480.3mg 6-三氟甲基烟醛，将其溶解在30ml乙腈中，加入1.24g三乙酰氧基硼氢化钠、1.5ml浓盐酸。反应温度为85℃、反应36h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入150ml 10％m/v碳酸钾水溶液，用200ml二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得526mg中间体(Ⅱ)，收率为85.99％。
1.3向单口烧瓶中，加入200mg 2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯，343mg 6-三氟甲基烟醛，将其溶解在20ml甲苯中，加入5.2ml三乙基硅烷、313.7mg冰醋酸。反应温度为100℃、反应30h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml 10％m/v碳酸钾水溶液，用100ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得373mg中间体(Ⅱ)，收率为91.47％。
实施例2、中间体(Ⅲ)的合成
2.1向三口烧瓶中，加入150mg实施例1中1.1所制备的中间体(Ⅱ)，将其溶解在20ml四氢呋喃中，整个反应通入氮气保护。加入27.3mg硼氢化钠，131mg氯化锌。反应温度为60℃、反应42h。反应结束后，加入50ml 10％m/vNH4Cl水溶液，继续搅拌1h，将反应液直接过滤，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得89mg中间体(Ⅲ)，收率为65.18％。
2.1所得中间体(Ⅲ)的核磁共振氢谱表征结果如下：1H NMR(400MHz,dmso)δ8.79-8.70(m,2H),8.23(s,1H),8.16(s,1H),7.95(dd,J＝8.1,1.4Hz,1H),7.86-7.83(m,1H),6.49(s,1H),4.60(d,J＝6.3Hz,2H),4.28(d,J＝4.9Hz,2H)，见附图2。
2.2向三口烧瓶中，加入200mg实施例1中1.1所制备的中间体(Ⅱ)，将其溶解在20ml四氢呋喃中，整个反应通入氮气保护。加入29.1mg硼氢化钠，91.5mg氯化镁。反应温度为50℃、反应48h。反应结束后，加入50ml 10％m/vNH4Cl水溶液，继续搅拌1h，将反应液直接过滤，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得116mg中间体(Ⅲ)，收率为63.72％。
2.3向三口烧瓶中，加入300mg实施例1中1.1所制备的中间体(Ⅱ)，将其溶解在30ml四氢呋喃中，整个反应通入氮气保护。滴加1.54ml 2.5mol/L氢化铝锂的四氢呋喃溶液，反应温度为40℃、反应38h。反应结束后，加入100ml饱和NH4Cl水溶液，继续搅拌1h，将反应液直接过滤，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得160mg中间体(Ⅲ)，收率为58.59％。
实施例3、中间体(Ⅳ)的合成
3.1向三口烧瓶中，加入200mg实施例2中2.1所制备的中间体(Ⅲ)，将其溶解在20ml二氯甲烷中，整个反应通入氮气保护。加入332.9mg四丙基过钌酸铵，在室温条件下，反应8h，反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml 10％m/v碳酸钾水溶液，用100ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得184mg中间体(Ⅳ)，收率为92.66％。
3.1所得中间体(Ⅳ)的红外光谱表征如下：IR(KBr)v:2965,2212,1942,1661,1578,1408,1027cm-1，见附图3。
3.2向三口烧瓶中，加入150mg实施例2中2.1所制备的中间体(Ⅲ)，将其溶解在20ml二氯甲烷中，整个反应通入氮气保护。加入218mg Collins试剂，反应温度为30℃、反应6h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml 10％m/v碳酸钾水溶液，用100ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得134mg中间体(Ⅳ)，收率为89.97％。
3.3向三口烧瓶中，加入250mg实施例2中2.1所制备的中间体(Ⅲ)，将其溶解在30ml二氯甲烷中，整个反应通入氮气保护。加入218mg四甲基哌啶氧化物，反应温度为40℃、反应5h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入200ml 10％m/v碳酸钾水溶液，用200ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得209mg中间体(Ⅳ)，收率为84.2％。
实施例4、中间体(Ⅴ)的合成
4.1向单口烧瓶中，加入300mg实施例3中3.1所制备的中间体(Ⅳ)，将其溶解在30ml二氯甲烷中。加入464mg二碳酸二叔丁酯，295μL三乙胺，19.5mg 4-二甲氨基吡啶。在室温条件下、反应45h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入200ml水，用300ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得225mg中间体(Ⅴ)，收率为55.36％。
4.1所得中间体(Ⅴ)的核磁共振氢谱表征结果如下：1H NMR(400MHz,dmso)δ9.56(s,1H),8.69(s,2H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),7.56(s,1H),6.68(s,1H),5.13(s,2H),1.43(dd,J＝10.0,3.1Hz,9H)，见附图4。
4.2向单口烧瓶中，加入150mg实施例3中3.1所制备的中间体(Ⅳ)，将其溶解在20ml二氯甲烷中。加入181.3mg氯甲酸苄酯，111μL三乙胺，6.5mg4-二甲氨基吡啶。反应温度为40℃、反应48h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml水，用200ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得150mg中间体(Ⅴ)，收率为73.81％。
4.3向单口烧瓶中，加入250mg实施例3中3.1所制备的中间体(Ⅳ)，将其溶解在30ml二氯甲烷中。加入343.7mg芴甲氧羰酰氯，184.7μL三乙胺，6.5mg 4-二甲氨基吡啶。反应温度为50℃、反应36h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入200ml水，用300ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在60℃下，干燥24h后得261mg中间体(Ⅴ)，收率为77.06％。
实施例5、中间体(Ⅵ)的合成
5.1向单口烧瓶中，加入300mg实施例4中4.1所制备的中间体(Ⅴ)，将其溶解在30ml甲醇中。加入143.7mg 5-氯-7-氮杂吲哚，7.2mg碳酸钾。反应温度为30℃、反应40h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入200ml水用250ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得298mg中间体(Ⅵ)，收率为70.99％。
5.1所得中间体(Ⅵ)的质谱表征结果如下：ESI-MS(m/z)：533.13[M-H]-，见附图5。
5.2向单口烧瓶中，加入200mg实施例4中4.1所制备的中间体(Ⅴ)，将其溶解在20ml甲醇中。加入119.7mg 5-氯-7-氮杂吲哚，4.7mg叔丁醇钾。反应温度为40℃、反应35h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml水，用200ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得178mg中间体(Ⅵ)，收率为63.61％。
5.3向单口烧瓶中，加入150mg实施例4中4.1所制备的中间体(Ⅴ)，将其溶解在20ml甲醇中。加入83.8mg 5-氯-7-氮杂吲哚，2.4mg氢氧化钠。反应温度为45℃、反应48h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml水，用200ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，在70℃下，干燥24h后得111mg中间体(Ⅵ)，收率为52.89％。
实施例6、化合物(Ⅰ)的合成
6.1向单口烧瓶中，加入250mg实施例5中5.1所制备的中间体(Ⅵ)，将其溶解在30ml乙腈中。加入5.58ml三乙基硅烷，3.17ml氢溴酸。反应温度为85℃、反应28h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入150ml 5％m/v碳酸钾水溶液，用200ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩。将浓缩液先用乙醇：水＝1：4(v:v)的溶剂比例重结晶，再用乙醇：水＝1：6(v:v)的溶剂比例重结晶，加入1g活性炭进行脱色，自然冷却结晶，在70℃下，干燥24h后得126mg化合物(Ⅰ)，收率为64.37％。
6.1所得化合物(Ⅰ)的核磁共振氢谱表征结果如下：1H NMR(400MHz,dmso)δ11.88(s,1H),10.15(s,1H),8.71(s,2H),8.19(d,J＝2.3Hz,1H),7.97(d,J＝1.3Hz,1H),7.92(s,1H),7.70(d,J＝8.0Hz,1H),7.57–7.55(m,1H),6.45–6.44(m,1H),4.54(s,2H),3.94–3.70(m,2H)，见附图6。
6.2向单口烧瓶中，加入200mg实施例5中5.1所制备的中间体(Ⅵ)，将其溶解在20ml乙腈中。加入4.17ml三乙基硅烷，1.93ml浓盐酸。反应温度为85℃、反应25h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入100ml 5％m/v碳酸钾水溶液，用150ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩。将浓缩液先用乙醇：水＝1：4(v:v)的溶剂比例重结晶，再用乙醇：水＝1：6(v:v)的溶剂比例重结晶，加入0.8g活性炭进行脱色，自然冷却结晶，在70℃下，干燥24h后得85mg化合物(Ⅰ)，收率为54.28％。
6.3向单口烧瓶中，加入300mg实施例5中5.1所制备的中间体(Ⅵ)，将其溶解在30ml乙腈中。加入6.7ml三乙基硅烷，3ml三氟乙酸。反应温度为85℃、反应30h。反应结束后，将其倒入烧瓶中，加入200ml 5％m/v碳酸钾水溶液，用300ml乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩。将浓缩液先用乙醇：水＝1：4(v:v)的溶剂比例重结晶，再用乙醇：水＝1：6(v:v)的溶剂比例重结晶，加入1.5g活性炭进行脱色，自然冷却结晶，干燥后得139mg化合物(Ⅰ)，收率为59.18％。
以下实施例7和实施例8所用化合物(Ⅰ)均为实施例6中6.1所得化合物(Ⅰ)。
实施例7、细胞毒性实验
人乳腺癌MCF-7细胞和人肺癌A549细胞，源于湖北工业大学胡康洪教授课题组赠送，人骨肉瘤HOS细胞购置于武汉普诺赛生命科技有限公司，MTT试剂购置于武汉菲优特生物科技有限公司，DMEM高糖培养基(500ml)、MEM培养基(500ml)、胰酶消化液(0.25％m/v，100ml)购置于武汉菲优特生物科技有限公司。其中，MCF-7与A549细胞使用DMEM高糖培养基进行培养，HOS细胞使用MEM培养基进行培养。此外，以已上市的培西达替尼标准品(购置于美国TargetMol有限公司，纯度：99.66％)作为对照，从而验证化合物(Ⅰ)的抗癌活性。选取生长状态良好的细胞进行实验，将T25瓶中的细胞用1ml胰酶消化液处理2min，将细胞转移至96孔板中，保证细胞数目为104个/孔，放入恒温培养箱(37℃、5％CO2，下同，不再赘述)，培养24h。当细胞恢复活力后，吸弃孔内旧培养基，每孔加入100μl配置好的给药培养基(将培西达替尼标准品、化合物(Ⅰ)预先使用DMSO溶解，再用培养基稀释一定的倍数)，加入完毕后，放入恒温培养箱，培养24h。每孔加入20μl MTT溶液，避光孵育4h。先将各孔中的溶液尽可能吸弃，然后每孔加入150μl DMSO，置于摇床(震荡频率为150次/min)，震荡10～15min左右，在酶标仪上检测各孔于490nm处的吸光度值(OD值)。细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％。实验组为孔内含有细胞，加入100μl给药培养基；对照组为孔内含有细胞，加入100μl培养基；空白组为孔内没有细胞，仅加入100μl培养基。
细胞毒性实验重复三次，每组浓度实验包含5个实验孔。根据计算得出结果，在Origin 8.0软件中做统计分析。对应的数据见表1-3，结果见附图7-9。
表1化合物对HOS细胞的毒性，以细胞存活率％计。
Figure BDA0003630236110000131
表2化合物对MCF-7细胞的毒性，以细胞存活率％计。
Figure BDA0003630236110000141
表3化合物对A549细胞的毒性，以细胞存活率％计。
Figure BDA0003630236110000142
从表1-3和附图7-9可看出随着给药浓度浓度的增加，相较于培西达替尼标准品，化合物(Ⅰ)在纳摩尔浓度就能显著抑制HOS细胞的生长。此外，化合物(Ⅰ)在微摩尔浓度也能抑制MCF-7和A549细胞的生长。
实施例8、细胞凋亡实验
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购置于江苏凯基生物技术股份有限公司。同样，以培西达替尼标准品作为对照，从而验证化合物(Ⅰ)诱导癌细胞凋亡的能力。选取生长状态良好的细胞进行实验，将T25瓶中的细胞用胰酶消化液处理(同实施例7)，用培养基对消化下来的细胞进行稀释，之后将细胞混悬液转移至6孔板中(每孔加入2ml，保证每孔的细胞数量为1～5×105个)，放入恒温培养箱，培养24h。当细胞恢复活力后，吸弃孔内旧培养基，每孔各加入2ml预先配置好的给药培养基(配制方法同实施例7)，放入恒温培养箱，培养48h。将6孔板中的溶液分别吸入至相应的6支离心管中，之后用胰酶消化液处理孔内剩余的贴壁细胞，将消化下来的细胞收集于对应的6支离心管中。将离心管进行离心，收集沉降细胞，之后向每支离心管各加入2ml PBS溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.4)进行洗涤，清洗2次。再次离心，收集沉降细胞，向各支离心管内加入100μL 1×Binding Buffer溶液，轻轻吹打混匀，再次向其中加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI溶液，轻轻吹散混匀。在避光条件下，静置孵育15min左右。向6支离心管中再次加入400μL 1×Binding Buffer溶液，轻轻吹打混匀。将细胞悬液过300目筛网收集于6支流式管中，之后将流式管外壁用锡箔纸包裹，放置于预先装有碎冰的泡沫箱中，冷冻避光保存。最后用流式细胞仪上机检测，保证样品在1h内全部检测完毕。每个6孔板属于一组浓度梯度实验，细胞凋亡实验重复三次。流式细胞结果图使用FlowJo V10软件处理，流式数据使用Origin 8.0软件做统计分析。对应的数据见表4-5，结果见附图10-11。
表4化合物诱导HOS细胞的凋亡，以凋亡细胞总数％计。
Figure BDA0003630236110000151
表5化合物诱导A549细胞的凋亡，以凋亡细胞总数％计。
Figure BDA0003630236110000161
从表4-5和附图10-11可看出，随着给药浓度的增加，相较于培西达替尼标准品，化合物(Ⅰ)在纳摩尔浓度就能诱导HOS细胞的凋亡，在微摩尔浓度诱导A549细胞的凋亡，且化合物(Ⅰ)诱导两种细胞凋亡的能力强于培西达替尼标准品。

Claims (10)

1.化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶，其结构式如下：
Figure FDA0003630236100000011
2.一种权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，化合物(Ⅰ)是采用2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯和6-三氟甲基烟醛为原料，经还原胺化反应、还原反应、氧化反应、取代反应、亲核加成反应和取代反应，共6步反应制备得到。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物(Ⅰ)是通过如下步骤合成：
步骤一、以2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯和6-三氟甲基烟醛为原料，与还原剂作用，发生还原胺化反应，得到中间体(Ⅱ)；
步骤二、中间体(Ⅱ)与还原剂作用，发生还原反应得到中间体(Ⅲ)；
步骤三、中间体(Ⅲ)与氧化剂作用，发生氧化反应得到中间体(Ⅳ)；
步骤四、中间体(Ⅳ)与氨基的保护基，发生取代反应得到中间体(Ⅴ)；
步骤五、中间体(Ⅴ)与5-氯-7-氮杂吲哚，在碱性条件下，发生加成反应得到中间体(Ⅵ)；
步骤六、中间体(Ⅵ)在酸性条件下发生取代反应，脱去氨基保护基，同时与三乙基硅烷作用，脱去羟基，得到目标化合物(Ⅰ)；
Figure FDA0003630236100000012
Figure FDA0003630236100000021
式中，-G为一种氨基的保护基团。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、钯碳/H2、雷尼镍/H2、2-甲基吡啶-N-甲硼烷、三乙基硅烷、铑/CO中的一种；所述2-氨基嘧啶-5-羧酸甲酯：6-三氟甲基烟醛：还原剂的摩尔比为1：1～4：2～10。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述的还原剂为氢化铝锂、三仲丁基硼氢化锂、硼氢化钠、硼氢化钾、二异丁基氢化铝、硼氢化钠/氯化镁、硼氢化钠/氯化铝、硼氢化钠/氯化锌中的一种；所述中间体(Ⅱ)：还原剂的摩尔比为1：1～5。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述的氧化剂为二氧化锰、PDC氧化剂、PCC氧化剂、DMSO、戴斯-马丁氧化剂、Collins试剂、2-碘酰基苯甲酸、四丙基过钌酸铵、四甲基哌啶氧化物中的一种；所述中间体(Ⅲ)：氧化剂的摩尔比为1：0.5～5。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述的氨基保护试剂为氯甲酸苄酯、二碳酸二叔丁酯、芴甲氧羰酰氯、对甲氧基苄溴、溴化苄、对甲苯磺酰氯、三苯基氯甲烷、N-乙氧羰基邻苯二甲酰亚胺中的一种；所述中间体(Ⅳ)：氨基保护剂的摩尔比为1：1～6。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤五中，提供碱性环境的物质为甲醇钠、乙醇钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、叔戊醇钠、叔戊醇钾中的一种或几种；所述中间体(Ⅴ)：5-氯-7-氮杂吲哚：提供碱性环境物质的摩尔比为1：1～3：0.01～4。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤六中，提供酸性环境的物质为甲酸、盐酸、氢溴酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、磷酸、三氟乙酸、溴化锌中的一种；所述中间体(Ⅵ)：提供酸性环境物质的摩尔比为1：0.5～85。
10.如权利要求1所述化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶在制备抗癌药物中的应用；
如权利要求1所述化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶在制备抑制人骨肉瘤细胞HOS、人乳腺癌细胞MCF-7和/或人肺癌细胞A549生长的药物中的应用；
如权利要求1所述化合物5-氯-3-{[2-({[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]甲基}氨基)嘧啶-5-基]甲基}-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶在制备诱导肿瘤细胞HOS和/或A549凋亡的药物中的应用。
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