CN114720604A - 一种清热化痰中药特征图谱的构建方法及其特征图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种清热化痰中药特征图谱的构建方法,涉及药物分析技术领域,该构建方法包括以下步骤:步骤一参照物溶液的制备:6‑甲氧基愈创木酚对照品适量,用甲醇制成每1mL为0.03mg/ml的溶液,即得参照物溶液;步骤二供试品溶液的制备:精密量取清热化痰中药30ml,用乙酸乙酯振摇提取3次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,低温旋干,残渣加甲醇溶解并定容至5ml;步骤三色谱条件测定:精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl注入气相色谱仪,按照特定方式升温,并记录36mi n色谱图,得到清热化痰中药的GC特征图谱。本发明特征图谱可用于全面、整体地控制和评价其的质量,保证其真实性、整体性以及一致性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域,具体是一种清热化痰中药特征图谱的构建方法及其特征图谱。
背景技术
清热化痰中药为禾本科刚竹属数种植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体,具有清热化痰、镇惊利窍之功效,主要用于肺热咳嗽痰多,壮热烦渴,小儿痰热惊风等,《本草衍义》称之为“痰家之圣剂”。从国家药品监督管理局网站数据库查询到有该中药制剂的批准文号单方及其复方制剂共计43个,其中单方制剂的文号有24个,复方制剂文号有19个,涉及全国多家生产企业,江西为主产区。
清热化痰中药现行质量标准现收载于《中华人民共和国***药品标准》(1992年)中药材(第一册),其规定为刚竹属植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体。而刚竹属就有50余种,且还受产地、采收期等因素影响,加之其炮制方法也未对其具体加热温度以及时间参数做具体规定。因此受其基原、产地、采收期、炮制方法等因素影响,现行该清热化痰中药法定质量标准仅有性状、薄层色谱鉴别以及pH值、总固体、相对密度检查项,远远不足以全面反映其质量的优劣,且难以保证质量真实性、完整性和一致性。
文献报道该中药主要含有酚类、木质素以及氨基酸等成分,且酚类成分为其药效成分,目前该中药的质量控制技术报道主要集中在单组分酚类、以及糖和氨基酸等一类成分的含量测定方面,难以全面控制和评价清热化痰中药的质量,同时目前未见清热化痰中药特征图谱等相关研究报道。中药特征图谱是一种综合、可量化的鉴定手段,主要用于评价中药材及其制剂质量的真实性、稳定性以及一致性等,建立中药特征图谱将能全面地反映中药化学成分的种类和数量,进而对其质量进行整体的控制、评价和描述。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清热化痰中药特征图谱的构建方法及其特征图谱,以解决背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种清热化痰中药特征图谱的构建方法,包括以下步骤:步骤一参照物溶液的制备:6-甲氧基愈创木酚对照品适量,精密称定,用甲醇制成每1mL为0.03mg/ml的溶液,即得参照物溶液;步骤二供试品溶液的制备:精密量取清热化痰中药30ml,用乙酸乙酯振摇提取3次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,低温旋干,残渣加甲醇溶解并定容至5ml,即得供试品溶液;步骤三色谱条件测定:精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl注入气相色谱仪,分流比50:1,按照特定方式升温,并记录36min色谱图,得到清热化痰中药的GC特征图谱;步骤四构建清热化痰中药的对照特征图谱:取清热化痰中药样品十三批次,分别按步骤一供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按步骤三中色谱条件测定,得到十三批次样品的色谱图,分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价***中,剪切0-2min的溶剂峰,对其中14个峰进行多点校正,采用Mark峰匹配,采用中药色谱指纹图谱相识度评价软件对13批次特征图谱进行比较,确定共有特征峰,生成具有十四个个共有峰构成的对照特征图谱。
在上述技术方案的基础上,本发明还提供以下可选技术方案:
在一种可选方案中:所述步骤三中采用DB-WAX为色谱柱,以N2为载气,柱流速为3.5ml/min,进样口温度为250℃;FID检测器温度为280℃。
在一种可选方案中:所述步骤三中特定方式升温为:初始温度为75℃,以升温速率5℃/min升温至150℃,并保持温度在150℃下0.5min;以升温速率3℃/min升温至210℃,并保持温度在210℃下0.5min,260℃后运行5min。
在一种可选方案中:在进行步骤四构建清热化痰中药的对照特征图谱还分别对清热化痰中药样品进行精密度试验、稳定性试验和重复性试验。
在一种可选方案中:所述精密度试验的步骤如下:取清热化痰中药样品,按步骤二中供试品溶液制备方法制成供试品溶液,连续进样6次,按步骤三进行色谱条件测定;以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.01%。
在一种可选方案中:所述稳定性试验的步骤如下:取清热化痰中药样品,按步骤二中供试品溶液制备方法制成供试品溶液,分别在0、4、8、12、16、24小时按步骤三进行色谱条件测定,以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.02%。
在一种可选方案中:所述重复性试验的步骤如下:取同一批清热化痰中药,按步骤二中平行制备供试品溶液6份,步骤三进行色谱条件测定,以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.02%。
一种清热化痰中药特征图谱,该清热化痰中药特征图谱为使用如上述所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法构建得到。
相较于现有技术,本发明的有益效果如下:
1、本发明通过气相色谱仪建立清热化痰中药特征图谱,并通过试验确定标准对照特征图谱的精密度、重现性及稳定性;
2、本发明建立并公开一种清热化痰中药特征图谱的构建方法以及特征图谱,可用于全面、整体地控制和评价其的质量,保证其真实性、整体性以及一致性。
附图说明
图1为本发明的清热化痰中药的GC特征图谱。
图2为本发明的构建清热化痰中药的对照特征图谱中的13批样品色谱叠加图。
图3为本发明的甲醇溶剂峰色谱图。
图4为本发明的对照特征图谱。
图5为本发明的供试品溶液色谱图。
图6为本发明的愈创木酚对照品溶液色谱图(4号峰)。
图7为本发明的4-甲基愈创木酚对照品溶液色谱图(5号峰)。
图8为本发明的苯酚对照品溶液色谱图(6号峰)。
图9为本发明的6-甲氧基愈创木酚对照品溶液色谱图(7号峰)。
图10为本发明的甲基苯酚对照品溶液色谱图(8号峰)。
图11为本发明的乙基苯酚对照品溶液色谱图(9号峰)。
图12为本发明的乙酸乙酯提取色谱图。
图13为本发明的***提取色谱图。
图14为本发明的水饱和正丁醇提取色谱图。
图15为本发明的色谱图(HP-5色谱柱)。
图16为本发明的色谱图(DB-17色谱柱)。
图17为本发明的色谱图(DB-WAX色谱柱)。
图18为本发明的试验组1的色谱图。
图19为本发明的试验组2的色谱图。
图20为本发明的试验组3的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。本发明所列举的各实施例仅用以说明本发明,并非用以限制本发明的范围。对本发明所作的任何显而易知的修饰或变更都不脱离本发明的精神与范围。
在一个实施例中,提出一种一种清热化痰中药特征图谱的构建方法
1、仪器与试药
1.1仪器与试剂:8890B型气相色谱仪,配置氢火焰离子化检测器(FID)、7693型液体自动进样器,Openlab色谱工作站。BT25S型十万分之一电子天平,Milli-Q超纯水仪。6-甲氧基愈创木酚(StanfordChemicals,批号MA190816-07,纯度99.08%)。
2、方法与结果
2.1参照物溶液的制备:称6-甲氧基愈创木酚对照品适量,精密称定,用甲醇制成每1mL为0.03mg/ml的溶液,即得。
2.2供试品溶液的制备:精密量取清热化痰中药30ml,用乙酸乙酯振摇提取3次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,低温旋干,残渣加甲醇溶解并定容至5ml,即得。
2.3色谱条件:采用DB-WAX(30m×0.32mm×0.25um)为色谱柱,以N2(99.999%)为载气,柱流速:3.5ml/min,进样口温度:250℃;FID检测器温度280℃。精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl注入气相色谱仪,分流比50:1,按表1程序升温,得到清热化痰中药的GC特征图谱,如图1所示,特征峰的保留时间见表2。理论塔板数以6-甲氧基愈创木酚峰计算应不低于50000。
表1程序升温表
初始温度(℃) | 率(℃/min) | 温度(℃) | 保持时间(min) |
75 | 5 | 150 | 0.5 |
/ | 3 | 210 | 0.5 |
表2各特征峰的保留时间
峰号 | 保留时间 |
1 | 8.433 |
2 | 9.935 |
3 | 13.160 |
4 | 13.739 |
5 | 15.579 |
6 | 16.694 |
7 | 17.134(参照峰) |
8 | 18.356 |
9 | 20.486 |
10 | 20.806 |
11 | 22.522 |
12 | 24.577 |
13 | 25.634 |
14 | 29.409 |
2.4方法学考察:
2.4.1精密度试验:取清热化痰中药样品,按“2.1”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液,连续进样6次,按“2.3”项下色谱条件测定。以7号峰(6-甲氧基愈创木酚)为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.01%,见表3,表明精密度良好。
表3精密度试验结果
2.4.2稳定性试验:取清热化痰中药样品,按“2.1”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液,分别在0、4、8、12、16、24小时按“2.3”项下色谱条件测定。以7号峰(6-甲氧基愈创木酚)为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.02%,见表4,表明供试品溶液在24小时内稳定。
表4稳定性试验结果
2.4.3重复性试验:取同一批清热化痰中药,按“2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“2.3”项下色谱条件测定,以7号峰(6-甲氧基愈创木酚)为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD,结果表明6次测定特征中13个各共有特征峰的相对保留时间RSD≤0.02%,见表5,表明方法重复性良好。
表5重复性性试验结果
3构建清热化痰中药的对照特征图谱:取清热化痰中药样品13批次,分别按“2.1”项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件测定,得到13批次样品的色谱图,分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价***,剪切0-2min的溶剂峰,对其中14个峰进行多点校正,采用Mark峰匹配,如图2所示。
采用中药色谱指纹图谱相识度评价软件对13批次特征图谱进行比较,确定共有特征峰(剪除0-2min溶剂峰,见图3),生成14个共有峰构成的对照特征图谱,如图4所示,其中参照峰为6-甲氧基愈创木酚峰(7号峰)。
4特征图谱色谱峰的确认:取愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、甲基苯酚、乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚对照品适量,按按“2.3”项下色谱条件测定,记录色谱图,结果如图5-11所示,以保留时间对供试品溶液的色谱图的主要色谱峰进行指认,指认结果如图5-所示,其中4号峰为愈创木酚,5号峰为4-甲基愈创木酚,6号峰为苯酚,7号峰为6-甲氧基愈创木酚,8号峰为对甲基苯酚,9号峰为对乙基苯酚。
5相似度分析:采用中药色谱指纹图谱相识度评价软件对13批次特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度,结果均大于0.950,结果见表6。
表6清热化痰中药GC特征图谱相似度评价结果
6条件优化与讨论
6.1提取溶剂的考察:实验考察了水饱和正丁醇、乙酸乙酯、***三种试剂作为提取溶剂的提取试验效果,结果表明,水饱和的正丁醇提取时色谱峰明显少于乙酸乙酯和***,不利于样品整体情况的表征,而乙酸乙酯和***色谱峰的数量相当,考虑到***试剂安全性以及管控性,试验最终选择以乙酸乙酯为提取溶剂,其色谱图见12-14。
6.2色谱柱的考察:本试验对比考察了HP-5、DB-17以及DB-WAX三种规格相同但固定相不同的毛细管色谱柱,结果HP-5以及DB-17色谱柱存在分离效果不佳,导致大部分色谱峰都在集中在保留时间段处出峰,不利于特征图谱的全面表征。综合各色谱峰的分离度,保留时间分布以及分离度,故选择DB-WAX色谱柱,其色谱图见15-17。
6.3升温程序以及分流比的考察:试验考察了三组色谱柱程序升温以及分流比(见下表7),结果表明,在试验组1的条件下,色谱峰分离均大于1.5以及峰形尖锐对称且14个共有特征峰保留时间分布较平均,在试验组2的条件下部分峰分离度小于1.5,在试验组3的条件下所有特征峰均有前沿且部分峰分离度小于1.5,色谱图见18-20。
以上所述,仅为本公开的具体实施方式,但本公开的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此,本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一参照物溶液的制备:6-甲氧基愈创木酚对照品适量,精密称定,用甲醇制成每1mL为0.03mg/ml的溶液,即得参照物溶液;
步骤二供试品溶液的制备:精密量取清热化痰中药30ml,用乙酸乙酯振摇提取3次,每次30ml,合并乙酸乙酯液,低温旋干,残渣加甲醇溶解并定容至5ml,即得供试品溶液;
步骤三色谱条件测定:精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl注入气相色谱仪,分流比50:1,按照特定方式升温,并记录36min色谱图,得到清热化痰中药的GC特征图谱;
步骤四构建清热化痰中药的对照特征图谱:取清热化痰中药样品十三批次,分别按步骤一供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按步骤三中色谱条件测定,得到十三批次样品的色谱图,分别导入中药色谱指纹图谱相似度评价***中,剪切0-2min的溶剂峰,对其中14个峰进行多点校正,采用Mark峰匹配,采用中药色谱指纹图谱相识度评价软件对13批次特征图谱进行比较,确定共有特征峰,生成具有十四个个共有峰构成的对照特征图谱。
2.根据权利要求1所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,所述步骤三中采用DB-WAX为色谱柱,以N2为载气,柱流速为3.5ml/min,进样口温度为250℃;FID检测器温度为280℃。
3.根据权利要求1所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,所述步骤三中特定方式升温为:初始温度为75℃,以升温速率5℃/min升温至150℃,并保持温度在150℃下0.5min;以升温速率3℃/min升温至210℃,并保持温度在210℃下0.5min,260℃后运行5min。
4.根据权利要求1所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,在进行步骤四构建清热化痰中药的对照特征图谱还分别对清热化痰中药样品进行精密度试验、稳定性试验和重复性试验。
5.根据权利要求4所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,所述精密度试验的步骤如下:取清热化痰中药样品,按步骤二中供试品溶液制备方法制成供试品溶液,连续进样6次,按步骤三进行色谱条件测定;以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD。
6.根据权利要求4所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法,其特征在于,所述稳定性试验的步骤如下:取清热化痰中药样品,按步骤二中供试品溶液制备方法制成供试品溶液,分别在0、4、8、12、16、24小时按步骤三进行色谱条件测定,以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD。
7.根据权利要求4所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法及其特征图谱,其特征在于,所述重复性试验的步骤如下:取同一批清热化痰中药,按步骤二中平行制备供试品溶液6份,步骤三进行色谱条件测定,以7号峰为参照峰,计算各特征峰与参照峰的相对保留时间的RSD。
8.一种清热化痰中药特征图谱,其特征在于,该清热化痰中药特征图谱为使用如权利要求1-7任一项所述的清热化痰中药特征图谱的构建方法构建得到。
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李红;蒋孟良;: "国药竹沥及其伪品的HPLC指纹图谱比较研究" * |
李红;蒋孟良;金晓飞;: "采用GC-MS法研究干馏时间对竹沥中化学成分的影响" * |
李红;蒋孟良;金晓飞;尹谦;杨欣;吴治谚;: "不同干馏时间对竹沥中化学成分的影响" * |
杨欣;金晓飞;李红;蒋孟良;吴治谚;: "不同种类竹沥化学成分的GC-MS比较分析" * |
肖小武等: "GC-MS同时测定复方鲜竹沥液中8个酚类有效成分" * |
肖小武等: "GC-MS法分析不同基原、炮制方法制备的鲜竹沥中成分" * |
肖小武等: "GC法同时测定鲜竹沥中10种成分" * |
金晓飞: "竹沥GC/MS成分分析及药理研究" * |
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