CN108409538A - 一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法与用途 - Google Patents

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Abstract

一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法：海带干粉用无水甲醇浸提后减压蒸干得浸膏；浸膏用甲醇水溶液醇淀；上清液加乙酸乙酯萃取减压蒸干，下层蒸出乙酸乙酯后加正丁醇萃取，分别减压蒸干得组份B和C；采用硅胶柱层析进行分离得B1、B2和C2，采用凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液；经过分离得到组份抑藻活性组份B13、B21和C21，B13和C21采用硅胶薄层层析；最后得到纯度已达薄层纯的抑藻活性组份B21、B131、B132、C211和C212。本发明在活性追踪的基础上建立海带抑藻活性物质的分离纯化方法，从海带中分离得到几种抑藻活性物质，使海带可以应用于赤潮微藻治理中。其方法设计合理，分离得到的物质纯度高，抑藻活性好。

Description

一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法与用途
技术领域
本发明涉及一种抑藻活性物质的分离纯化方法，特别是海带抑藻活性物质的分离纯化方法。本发明还涉及前述分离纯化方法得到的物质的用途。海洋生化工程领域。
背景技术
海带（Laminaiia japonica）是一种经济价值较高的大型海洋褐藻，其鲜品营养价值很高，含有大量的糖、蛋白质、维生素等，经烹调后可食用，同时也是鲍类养殖的主要馆料之一。海带还含有丰富有机碘，可治疗和预防甲状腺肿大病。除了食用和药用价值外，海带还是经济价值很高的工业原料，其干品是提取褐藻酸、甘露醇的重要原料。目前，国内外对海带生物活性物质的研究，主要集中在海带多糖的研究，如褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉等多糖的提取工艺，以及海带多糖的抗菌、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等活性。近几年，海带栽培的生物修复研究也见报道。然而，关于海带抑制赤潮微藻生长的研究较少。目前，仅发现海带的鲜组织培养水滤出液对三角褐指藻的生长能产生抑制作用，海带蛋白能抑制塔玛亚历山大藻和中肋骨条藻的生长。关于海带中抑制赤潮微藻生长的抑藻活性物质的分离纯化，国内外尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，分离得到纯化的抑藻活性物质。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述抑藻活性物质的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）海带干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液；反复浸提3次，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏；浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液；检测上清液具有抑制了米氏凯伦藻的生长活性；
（2）将上清液加入乙酸乙酯萃取3次；上层减压蒸干，获得组份A；下层减压蒸发出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份B和组份C；组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长具有强烈的抑制作用；
（3）组份B和组份C采用硅胶柱层析进行分离，分离后，组份B获得2个再分组份，B1和B2；组份C获得3个再分组份，C1、C2和C3；抑藻活性检测得到具有明显的抑米氏凯伦藻活性的组份B1、B2和C2；将B1、B2和C2组份采用凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液；经过分离，从B1中分离得到组份B11、B12和B13；从B2中分离出B21；从C2中分离得到C21和C22，共6个组份，抑藻活性检测得到具有明显的抑米氏凯伦藻活性的组份为B13、B21和C21，组份B21纯度已达薄层纯；组份B13和C21采用硅胶薄层层析进行制备，分别得到纯度已达薄层纯的抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。
本发明所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其进一步优选的技术方案是：步骤（3）中，组份B和组份C均采用硅胶柱层析进行分离，洗脱液均为体积比为1:5的氯仿/甲醇，流速为1.0 mL/min，洗脱2倍柱体积；所有馏分减压浓缩，点样于硅胶GF254薄层层析，以体积比为1:10氯仿/甲醇为展开剂；合并相同馏分后，组份B获得2个再分组份，B1和B2；组份C获得3个再分组份，C1、C2和C3。
本发明所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其进一步优选的技术方案是：步骤（3）中，再分组份B1、B2和C2采用Sephadax LH-20凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液。
本发明所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其进一步优选的技术方案是：步骤（3）中，组份B13和C21采用硅胶薄层层析进行制备，分别以体积比为1:2石油醚/乙酸乙酯和体积比为4:1氯仿/甲醇为展开剂；制备到抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。
以上任何一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法分离制得的组份B21、B131、B132、C211、C212中的一种或几种在制备抑制了米氏凯伦藻的生长活性组合物中的应用。
本发明在活性追踪的基础上建立海带抑藻活性物质的分离纯化方法，从海带中分离得到几种抑藻活性物质，使海带可以应用于赤潮微藻治理中。其方法设计合理，分离得到的物质纯度高，抑藻活性好。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明而不构成对其权利的限制。
实施例1，海带抑藻活性物质的分离纯化方法：
（1）海带干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液。反复浸提3次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏。此浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。取适量此上清液减压蒸干后，溶解于甲醇，此甲醇溶液进行抑藻活性检测，结果表明，它显著抑制了米氏凯伦藻的生长；
（2）将其余上清液加入乙酸乙酯萃取3次。上层减压蒸干，获得组份A。下层减压蒸发出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份B和组份C。上述3种组份分别溶解于无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液。此3种组份中，除组份A外，其余2种组份均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用；
（3）此2个组份采用硅胶柱层析进行分离，分离后，组份B获得2个再分组份，B1和B2；组份C获得3个再分组份，C1、C2和C3。抑藻活性检测表明，此5个组份中，再分组份B1、B2和C2具有明显的抑藻活性。在此基础上，此3个活性组份采用凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液。经过分离，依次得到组份B11、B12和B13；B21；C21以及C22等6个组份，组份B13、B21和C21较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。除组份B21（完成分离纯化，需进行纯度检测）外，组份B13和C21采用硅胶薄层层析进行制备，最终，制备到抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。纯度检测表明，抑藻活性组份B131、B132、B21、C211和C212的纯度已达薄层纯。
实施例2，海带抑藻活性物质的分离纯化方法：
（1）海带干品粉碎成0.3 mm粉末，加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，反复浸提3次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏。此浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。取适量此上清液，60℃下减压蒸干后，溶解于甲醇，进行抑藻活性检测（本发明中，除特别说明外，抑藻活性检测方法相同）。在96孔板上，1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板在光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。结果表明，此上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长；
（2）将其余上清液加入乙酸乙酯萃取3次。上层40℃下减压蒸干，获得组份A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次。萃取完成后，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得组份B和组份C。上述3种组份分别溶解于无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液。除组份A外，组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用；
（3）组份B和组份C 2个组份采用硅胶（200-300目）柱层析进行分离，组份B和组份C的洗脱液均为氯仿/甲醇（1:5，体积比，下同）。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测，展开剂为氯仿/甲醇（1:10）。合并相同馏分后，40℃下减压蒸干，依次获得再分组份B1和B2，以及再分组份C1、C2和C3。取适量上述5个再分组份重新溶解于无水甲醇中，进行抑藻活性检测。结果表明，再分组份B1、B2和C2对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此3个再分组份分别溶解于甲醇后，分别加载于Sephadax LH-20凝胶柱层析上，均以甲醇为洗脱液。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，依次获得B11、B12和B13；B21（完成分离纯化，需进行纯度检测）；C21以及C22等6个组份。
40℃下减压蒸干后，前述6个组份重新溶解于甲醇。抑藻活性检测结果表明，组份B13、B21和C21较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。采用划线法，将组份B13和C21加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上，分别以石油醚/乙酸乙酯（1:2）和氯仿/甲醇（4:1）为展开剂。经展开，组份B13和C21分别在硅胶预制板上呈现2个清晰且相距较明显的条带。将相应条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，经过滤和40℃下减压蒸干，制备到抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。取适量上述5种抑藻活性组份（B131、B132、B21、C211和C212），溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5种组份均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5种组份同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。
实施例3，海带抑藻活性物质的分离纯化方法：
称取海带干粉末1000 g，加入3 L无水甲醇，15-20℃浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏30.16 g。向此浸膏中加入150 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液130 mL。
取上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为8.0 mg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为53.4%（第10d）。结果表明，海带浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。
其余上清液，加入乙酸乙酯萃取3次（50 mL、40 mL和40 mL）。上层（乙酸乙酯层）合并收集后，40℃下减压蒸干，获得1.36 g组份A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次（50 mL、40 mL和40 mL），上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得1.12 g组份B和6.03 g组份C。分别称取10 mg上述3种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度2.0 mg/mL时，除组份A外，组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。将组份B和组份C分别溶解于2 mL和10 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×20 cm）上，以氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，5.0×40 cm）进行分离，氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测，展开剂为氯仿/甲醇（1:10）。合并相同馏分后，40℃下减压蒸干除去溶剂，依次获得再分组份B1和B2，以及再分组份C1、C2和C3。
上述5个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度1.0 mg/mL时，再分组份B1、B2和C2对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此3个再分组份分别溶解于1 mL甲醇后，分别加载于SephadaxLH-20凝胶柱层析上（2.0×20 cm），均以甲醇为洗脱液。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，依次获得B11、B12和B13，B21（0.33 g，完成分离纯化，需进行纯度检测），以及C21和C22等6个组份。
分别称取5 mg此6个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度0.25 mg/mL时，组份B13、B21和C21较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。此3个组份中，B13和C21分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行薄层层析分离制备。采用划线法，将组份B13和C21加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上，分别以石油醚/乙酸乙酯（1:2）和氯仿/甲醇（4:1）为展开剂。经展开，组份B13和C21分别在硅胶预制板上呈现2个清晰且相距较明显的条带。将相应条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，过滤和减压蒸干后，制备到组份B131（0.12 g）和B132（0.10 g），以及C211（0.004 g）和C212（0.005 g）。分别称取2 mg此4个组份，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为0.05 mg/mL时，此4个组份较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性组份B131、B132、B21、C211和C212，溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5种组份均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5种组份同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。
实施例4，海带抑藻活性物质的分离纯化方法：
称取海带干粉末2000 g，加入6 L无水甲醇，室温（15-20℃）浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏68.22 g。向此浸膏中加入300 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液280 mL。
取此上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为8.0 mg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为56.2%（第10d）。结果表明，海带浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。其余上清液，加入乙酸乙酯萃取3次（100 mL、90 mL和90 mL）。上层（乙酸乙酯层）合并收集后，40℃下减压蒸干，获得2.58 g组份A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次（100 mL、90 mL和90 mL），上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得2.23 g组份B和11.34g组份C。分别称取10 mg上述3种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度2.0 mg/mL时，除组份A外，组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。
将组份B和组份C分别溶解于3 mL和15 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×40 cm）上，以氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，5.0×80 cm）进行分离，氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测，展开剂为氯仿/甲醇（1:10）。合并相同馏分后，40℃下减压蒸干除去溶剂，依次获得再分组份B1和B2，以及再分组份C1、C2和C3。上述5个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度1.0 mg/mL时，再分组份B1、B2和C2对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此3个再分组份分别溶解于2 mL甲醇后，分别加载于Sephadax LH-20凝胶柱层析上（2.0×25cm），均以甲醇为洗脱液。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，依次获得B11、B12和B13，B21（0.56 g，完成分离纯化，需进行纯度检测），以及C21和C22等6个组份。分别称取5 mg此6个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度0.25 mg/mL时，组份B13、B21和C21较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。此3个组份中，B13和C21分别溶解于1 mL甲醇中，进行薄层层析分离制备。采用划线法，将组份B13和C21加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上，分别以石油醚/乙酸乙酯（1:2）和氯仿/甲醇（4:1）为展开剂。经展开，组份B13和C21分别在硅胶预制板上呈现2个清晰且相距较明显的条带。将相应条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，过滤和减压蒸干后，制备到组份B131（0.24 g）和B132（0.19 g），以及C211（0.008 g）和C212（0.011 g）。分别称取2 mg此4个组份，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为0.05 mg/mL时，此4个组份较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性组份B131、B132、B21、C211和C212，溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5种组份均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5种组份同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。
实施例5，海带抑藻活性物质的分离纯化方法：
称取海带干粉末4000 g，加入12 L无水甲醇，室温（15-20℃）浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液（浸提共3次）。经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏143.1 g。向此浸膏中加入520 mL90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液500 mL。
取此上清液1 mL，60℃下减压蒸干后，溶解于20 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。在96孔板上，将1 μL待测组份溶液加入到199 μL藻液中，对照组为199 μL藻液中加入1 μL无水甲醇。96孔板放置于光照培养箱内培养，温度20℃，光照强度2000 lx。4d后，显微镜下计数藻细胞数量。当浓度为8.0 mg/mL时，此甲醇溶液对米氏凯伦藻的生长抑制率为60.6%（第10d）。结果表明，海带浸膏上清液显著抑制了米氏凯伦藻的生长。其余上清液，加入乙酸乙酯萃取3次（250 mL、125mL和125 mL）。上层（乙酸乙酯层）合并收集后，40℃下减压蒸干，获得7.45 g组份A。
下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次（250 mL、125mL和125mL），上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得7.24 g组份B和29.30 g组份C。
分别称取10 mg上述3种组份，分别溶解于1 mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行抑藻活性检测。在浓度2.0 mg/mL时，除组份A外，组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长表现出强烈的抑制作用。将组份B和组份C分别溶解于8 mL和30 mL甲醇中，进行硅胶柱层析分离。组份B加载于硅胶柱（200-300目，2.0×60 cm）上，以氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分10 mL。组份C采用硅胶柱层析（200-300目，5.0×100 cm）进行分离，氯仿/甲醇（1:5）为洗脱液，流速1.0 mL/min，每个馏分20 mL。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，进行硅胶GF254薄层层析检测，展开剂为氯仿/甲醇（1:10）。合并相同馏分后，40℃下减压蒸干除去溶剂，依次获得再分组份B1和B2，以及再分组份C1、C2和C3。
上述5个再分组份分别称取10 mg，依次溶解于1 mL甲醇，配制为10 g/L 母液，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度1.0 mg/mL时，再分组份B1、B2和C2对米氏凯伦藻的生长具有较为明显的抑藻活性。将此3个再分组份分别溶解于3 mL甲醇后，分别加载于SephadaxLH-20凝胶柱层析上（2.0×60 cm），均以甲醇为洗脱液。洗脱2倍柱体积后，所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶GF254薄层层析检测，合并，减压蒸干后，依次获得B11、B12和B13，B21（1.39 g，完成分离纯化，需进行纯度检测），以及C21和C22等6个组份。
分别称取5 mg此6个组份，分别溶解于0.5 mL甲醇中，进行抑藻活性检测。抑藻活性检测结果表明，在浓度0.25 mg/mL时，组份B13、B21和C21较为显著地抑制了米氏凯伦藻的生长。此3个组份中，B13和C21分别溶解于2 mL甲醇中，进行薄层层析分离制备。采用划线法，将组份B13和C21加载于硅胶薄层层析预制板（100×200 mm）上，分别以石油醚/乙酸乙酯（1:2）和氯仿/甲醇（4:1）为展开剂。经展开，组份B13和C21分别在硅胶预制板上呈现2个清晰且相距较明显的条带。将相应条带分别刮下收集，采用丙酮浸泡，过滤和减压蒸干后，制备到组份B131（0.51 g）和B132（0.48 g），以及C211（0.016 g）和C212（0.020 g）。分别称取2 mg此4个组份，分别溶解于0.2 mL甲醇后，进行抑藻活性检测。结果表明，在浓度为0.05mg/mL时，此4个组份较为明显地抑制了米氏凯伦藻的生长。取适量上述5种抑藻活性组份B131、B132、B21、C211和C212，溶解于甲醇后，点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇（1:1），环己烷/乙酸乙酯（1:2）和正丁醇/醋酸/水（1:1:0.5）等3种展开剂下展开，发现此5种组份均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘），发现在此2种显色剂下，此5种组份同样呈现单一斑点，表明它们的纯度达到了薄层纯。

Claims (5)

1.一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于，其步骤如下：
海带干粉末加入无水甲醇，15-20℃下浸提12h后，获得浸提液；反复浸提3次，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到海带浸膏；浸膏加入90%甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液；检测上清液具有抑制了米氏凯伦藻的生长活性；
将上清液加入乙酸乙酯萃取3次；上层减压蒸干，获得组份A；下层减压蒸发出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得组份B和组份C；组份B和组份C均对米氏凯伦藻的生长具有强烈的抑制作用；
组份B和组份C采用硅胶柱层析进行分离，分离后，组份B获得2个再分组份，B1和B2；组份C获得3个再分组份C1、C2和C3；抑藻活性检测得到具有明显的抑米氏凯伦藻活性的组份B1、B2和C2；将B1、B2和C2组份采用凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液；经过分离，从B1中分离得到组份B11、B12和B13；从B2中分离出B21；从C2中分离得到C21和C22，共6个组份；抑藻活性检测得到具有明显的抑米氏凯伦藻活性的组份为B13、B21和C21，组份B21纯度已达薄层纯；组份B13和C21采用硅胶薄层层析进行制备，分别得到纯度已达薄层纯的抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。
2.根据权利要求1所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中，组份B和组份C均采用硅胶柱层析进行分离，洗脱液均为体积比为1:5的氯仿/甲醇，流速为1.0 mL/min，洗脱2倍柱体积；所有馏分减压浓缩，点样于硅胶GF254薄层层析，以体积比为1:10氯仿/甲醇为展开剂；合并相同馏分后，组份B获得2个再分组份，B1和B2；组份C获得3个再分组份，C1、C2和C3。
3.根据权利要求1或2所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中，再分组份B1、B2和C2采用Sephadax LH-20凝胶柱层析进行分离，以甲醇为洗脱液。
4.根据权利要求1或2所述的海带抑藻活性物质的分离纯化方法，其特征在于：步骤（3）中，组份B13和C21采用硅胶薄层层析进行制备，分别以体积比为1:2石油醚/乙酸乙酯和体积比为4:1氯仿/甲醇为展开剂；制备到抑藻活性组份B131和B132，以及C211和C212。
5.权利要求1－4中任何一种海带抑藻活性物质的分离纯化方法分离制得的组份B21、B131、B132、C211、C212中的一种或几种在制备抑制了米氏凯伦藻的生长活性组合物中的应用。
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