CN114657198B - 重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用 - Google Patents

重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用 Download PDF

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Abstract

重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用，本发明涉及一种重组工程菌及其在制备D‑泛解酸中的应用，以缬氨酸和甲醇为底物，加入重组工程菌诱导产生的菌体，得到D‑泛解酸溶液。本发明首次成功构建生物合成D‑泛解酸的基因工程菌以缬氨酸为底物发酵转化生成D‑泛解酸，原料价廉易得，反应成本低。

Description

重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用。
背景技术
泛酸又称维生素B5，为包括人和家畜在内的哺乳动物的必须营养元素，并在机体细胞中用于生物合成辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)，进而参与一百多种细胞代谢反应。
D-泛解酸内酯是合成D-泛酸的重要前体。CN110423717A公开了一种D-泛解酸内酯的制备方法，将DL-泛解酸内酯经酶法选择性水解分离或酶法催化合成，制得D-泛解酸内酯。但存在下述缺陷，DL-泛解酸内酯的合成需要使用大量的异丁醛和甲醛，甲醛对人体有刺激性危害，并采用有机试剂萃取分离，反应底物价格昂贵和需要拆分外消旋中间产物(如拆分DL-泛解酸内酯，获得D-泛解酸内酯，用于与β-丙氨酸聚合)的限制，经济效益和环境效益不尽如人意。
CN108456701A公开了一种D-泛解酸内酯的制备方法。该方法以缬氨酸为底物，通过多酶组合催化，制得D-泛解酸内酯。但存在反应步骤繁琐、反应时间长、酮泛解酸转化成泛解酸过程中的辅酶NADPH消耗带来的成本高等缺陷，限制了其产业化应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组质粒，包括：
含有L-氨基酸脱氨酶编码基因的第一重组质粒；
和/或，含有甲醇脱氢酶编码基因和醛缩酶编码基因的第二重组质粒；
和/或，含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因的第三重组质粒。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因来源于奇异变形杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因经过密码子优化得到L-氨基酸脱氨酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因1。
本发明优选的技术方案，所述第一重组质粒所采用质粒为pET-28a质粒。
本发明优选的技术方案，所述甲醇脱氢酶编码基因来源于芽孢杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明优选的技术方案，所述甲醇脱氢酶编码基因经过密码子优化得到甲醇脱氢酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述甲醇脱氢酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明优选的技术方案，所述甲醇脱氢酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因2。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因来源于大肠杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因经过密码子优化得到醛缩酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因3。
本发明优选的技术方案，所述第二重组质粒所采用质粒为pRSFDuet-I质粒。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因来源于伯克霍尔德氏菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因经过密码子优化得到甲酸脱氢酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因4。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因来源于嗜麦芽窄食单胞菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因经过密码子优化得到酮泛解酸还原酶优化基因序列。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶优化基因序列进行人工合成并加上酶切位点得到目的基因5。
本发明优选的技术方案，所述第三重组质粒所采用质粒为pRSFDUet-I质粒。
本发明的另一目的是提供一种重组工程菌，包括：
能够将缬氨酸转化成α-酮异戊酸的第一重组工程菌；
和/或，能够将α-酮异戊酸转化为酮泛解酸的第二重组工程菌；
和/或，能够将酮泛解酸转化为D-泛解酸的第三重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述缬氨酸选自L-缬氨酸和D-缬氨酸的混合物、L-缬氨酸的任一种。
本发明优选的技术方案，所述第一重组工程菌包括L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明优选的技术方案，所述第二重组工程菌包括甲醇脱氢酶编码基因和醛缩酶编码基因，或所述第二重组工程菌包括目的基因2和目的基因3，或所述第二重组工程菌包括如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明优选的技术方案，所述第三重组工程菌包括甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，或所述第三重组工程菌包括目的基因4和目的基因5，或所述第三重组工程菌包括如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
本发明优选的技术方案，所述第一重组工程菌的获得方法为：将L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第一重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第一重组工程菌的获得方法为：将L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1或如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到载体pET-28a上，再将所得重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第一重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述第二重组工程菌的获得方法为：将甲醇脱氢酶编码基因和醛缩酶编码基因、或目的基因2和目的基因3、或如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第二重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第二重组工程菌的获得方法为：
(a)将甲醇脱氢酶编码基因或目的基因2或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列克隆到载体pRSFDuet-I上，获得重组质粒pRSF-mdh；
(b)将醛缩酶编码基因或目的基因3或如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列克隆到重组质粒pRSF-mdh上，获得重组质粒pRSF-mdh-ald；
(c)将载体pRSF-mdh-ald导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第二重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述第三重组工程菌的获得方法为：将甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因、或目的基因4和目的基因5、或如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到第三重组工程菌。
本发明优选的技术方案，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、酵母菌、埃希氏菌、泛菌、沙门氏菌、谷棒杆菌、大肠杆菌、菠萝泛菌的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案，所述第三重组工程菌的获得方法为：
(a)将甲酸脱氢酶编码基因或目的基因4或如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列克隆到载体pRSFDUet-I上，获得重组质粒pRSF-fdh；
(b)将酮泛解酸还原酶编码基因或目的基因5或如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列克隆到重组质粒pRSF-fdh上，获得重组质粒pRSF-fdh-kur；
(c)将重组质粒pRSF-fdh-kur导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到第三重组工程菌。本发明优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因来源于奇异变形杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明优选的技术方案，所述甲醇脱氢酶编码基因来源于芽孢杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明优选的技术方案，所述醛缩酶编码基因来源于大肠杆菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因来源于伯克霍尔德氏菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明优选的技术方案，所述酮泛解酸还原酶编码基因来源于嗜麦芽窄食单胞菌，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明的另一目的在于提供一种重组工程菌在制备D-泛解酸中的应用，具体为：本发明所述的第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三，将菌体一、菌体二、菌体三用于制备D-泛解酸。
本发明优选的技术方案，所述诱导表达方法为：
(1)将重组工程菌按照1-5％接种量接种于LB培养基中，于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-12h，获得种子液；
(2)将种子液按照1-10％的接种量接种于发酵培养基中，30-40℃、pH 6.0-8.0下培养至发酵液OD值为0.5-2，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5-1mM/L，30℃下发酵培养12-24h，收集湿菌体，于-20℃下保存。
本发明优选的技术方案，所述LB培养基的组成包括：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
本发明优选的技术方案，所述发酵培养基的组成包括：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
本发明优选的技术方案，培养温度为30-37℃。
本发明优选的技术方案，转速为100-400rpm，优选为200-300rpm。
本发明优选的技术方案，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6-1。
本发明优选的技术方案，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.6-0.8mM/L。
本发明的另一目的是提供一种D-泛解酸的制备方法，包括下述步骤：将本发明所述的菌体一、菌体二、菌体三，以及缬氨酸、甲醇加水混合，添加甲酸铵，在30-40℃、pH为4-7条件下反应10-60h，制得D-泛解酸。
本发明优选的技术方案，所述菌体一为含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体一为含有L-氨基酸脱氨酶编码基因或目的基因1的菌体，其中，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体一的OD值为1-15，优选为5-15，更优选为8-12。
本发明优选的技术方案，所述菌体二为含有如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体二为含有甲醇脱氢酶编码基因和醛缩酶编码基因，或目的基因2和目的基因3的菌体，其中，所述甲醇脱氢酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述醛缩酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体二的OD值为1-15，优选为8-15，更优选为10-12。
本发明优选的技术方案，所述菌体三为含有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的菌体。
本发明优选的技术方案，所述菌体三为含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，或目的基因4和目的基因5的菌体，其中，所述甲酸脱氢酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述酮泛解酸还原酶编码基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示。
本发明优选的技术方案，反应体系菌体三的OD值为1-15，优选为8-15，更优选为10-12。
本发明优选的技术方案，所述缬氨酸：甲醇的摩尔比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)，优选为(0.95-1.05):(0.95-1.05)
本发明优选的技术方案，甲酸铵以流加方式进行添加。
本发明优选的技术方案，甲酸铵的浓度为1.5g/L-2.5g/L，优选为1.8g/L-2.2g/L。
本发明的优选技术方案中，反应体系中还可加入金属盐或磷酸盐溶液。
本发明优选的技术方案，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、钠盐、钾盐中的任一种或其组合，优选为氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。本发明优选的技术方案，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为0-50mmol/L，优选为1-40mol/L，更优选为5-30mol/L。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Zn2+浓度为0-15mM，优选为5-10mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Cu2+浓度为0-15mM，优选为5-10mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Ca2+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Mg2+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，金属盐溶液中的Na+浓度为0-9mM，优选为2-7mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液的PO4 3-浓度为0-21mM，优选浓度为0-15mM，优选为2-10mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的HPO4 2-浓度为0～15mM，优选为2～10mM。
本发明优选的技术方案，磷酸盐溶液中的H2PO4 -浓度为0～15mM，优选为2～10mM。
本发明优选的技术方案，反应温度为35-38℃。
本发明优选的技术方案，反应时间为20-40h。
本发明优选的技术方案，反应体系pH为5-7。
本发明的优选方案中，用于调节反应体系pH的pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硫酸的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种如上所述的方法制备得到的D-泛解酸在制备泛化合物中的应用，所述泛化合物选自D-泛解酸内酯、D-泛酸钙、D-泛醇、泛硫乙胺中的任一种。
本发明的另一目的在于提供一种D-泛解酸内酯的制备方法，D-泛解酸进行内酯化反应，得到D-泛解酸内酯。
本发明优选的技术方案，D-泛解酸在酸性条件、30-80℃下反应，得到D-泛解酸内酯。
本发明优选的技术方案，酸性条件为pH3.0以下，优选pH2.0以下。
本发明优选的技术方案，反应温度为40-70℃，优选为50-60℃。
本发明优选的技术方案，D-泛解酸可采用发酵液过滤后的清液。
本发明优选的技术方案，D-泛解酸可采用本发明的重组工程菌发酵液过滤后的清液。本发明优选的技术方案，所述内酯化反应为，取D-泛解酸的反应溶液，过陶瓷膜，收集清相溶液，过纳滤膜，收集清液用硫酸调节pH2.0以下，在40-60℃下搅拌反应；加入0.1mol/LNaOH溶液，调节溶液pH至4-7，制得D-泛解酸内酯。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明按照下述方法检测转化率和收率。
1.酶活
酶活为酶活力的度量单位，单位为U。在本申请中，定义1个酶活单位表示1ml底物溶液在1分钟内转化生成1umolD-泛解酸的酶量。
2.转化率
仪器及工作条件：色谱柱：InertsilNH25um 4.6*250mm；
流动相：乙腈：0.04moL/L磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节pH＝3.0)＝75:25；柱温：30℃；波长：205nm；流速：1.0mL/min；进样量：5uL。
分别在转化时间T＝0和T＝M(M为大于0的任一数值)时，取反应液稀释100倍，过滤后进样，进样量10ul，分别记录缬氨酸峰面积S0和SM。
转化率(M时刻)＝0.79Nm/(S0-SM)。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、首次成功构建生物合成D-泛解酸的重组工程菌，以缬氨酸为底物发酵转化生成D-泛解酸，原料价廉易得，反应成本低。
2、本发明以甲醇作为底物，有效避免直接添加甲醛，同时不会有额外的甲醛外溢到***外，有利于节约成本，且对环境有好。
3、本发明将甲酸转化为易挥发的二氧化碳，既利于提高反应效率，又避免了分离除去甲酸所致的繁琐步骤，缩短生产周期，减低三废生成及其回收处理成本，适合工业化生成。
附图说明
图1为本发明实施例的技术原理示意图；
图2试验例1-6与对比例1的D-泛解酸转化率对比；
图3试验例1-6与对比例1的D-泛解酸内酯收率对比。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1构建表达L-氨基酸脱氨酶的第一重组工程菌
步骤一，将来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶编码基因(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到L-氨基酸脱氨酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；
将所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列人工合成，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因1。
步骤二，以目的基因1的DNA分子为模板，采用引物对LA-for和LA-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因1的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
LA-for：GGAATTCCATATGATGGCTATAAGTAGGAGAAAATTTATTC；
LA-rev：CCGCTCGAGAAAGCGGTACAAGCTGAACGG。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288668740000141
Figure BDA0003288668740000151
PCR过程如下：
95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶XhoI与NdeI双酶切pET-28a质粒和目的基因1的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物(命名为pET-28a-LA)转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-28a-LA。
实施例2构建共表达甲醇脱氢酶和醛缩酶的第二重组工程菌
步骤一，将来源于芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)的甲醇脱氢酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到甲醇脱氢酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的醛缩酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，得到醛缩酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
将所述SEQ ID NO:2和所述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列人工合成，分别加上BamHI与NotI酶切位点，XhoI与NdeI酶切位点，得到目的基因2和目的基因3。
步骤二，以目的基因2的DNA分子为模板，采用引物对mdh-for和mdh-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因2的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
mdh-for：CGGGATCCATGAAAAACACCCAGTCTGCTTTC；
mdh-rev：
ATAAGAATGCGGCCGCCATAGCGTTTTTGATGATCTGGATAAC。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288668740000161
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
以目的基因3的DNA分子为模板，采用引物对ald-for和ald-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因3的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
ald-for：
GGAATTCCATATGATGAAAAACTGGAAAACAAGTGCAGAATCAATC；
ald-rev：CCGCTCGAGCAGCTTAGCGCCTTCTACAGCTTCAC。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288668740000171
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶双酶切pRSFDuet-I质粒和目的基因2的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-mdh转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-mdh；
用限制性内切酶双酶切重组质粒pRSF-mdh和目的基因3的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-mdh-ald转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-mdh-ald。
实施例4构建共表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶的第三重组工程菌
步骤一，将来源于伯克霍尔德氏菌(burkholderia stabilis)的甲酸脱氢酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上BamHI与NotI酶切位点，得到甲酸脱氢酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
将来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的酮泛解酸还原酶编码基因序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)的核苷酸序列根据大肠杆菌(E.coli)的密码子偏好性进行密码子优化，并加上XhoI与NdeI酶切位点，得到酮泛解酸还原酶优化基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
将所述SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列进行人工合成，得到目的基因4和目的基因5。
步骤二，以目的基因4的DNA分子为模板，采用引物对fdh-for和fdh-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因4的基因片段。
引物序列如下：(下划线部位为酶切位点)
fdh-for：CGGGATCCATGGCTACCGTTCTGTGCGTTC；
fdh-rev：ATAAGAATGCGGCCGCGGTCAGACGGTAAGACTG。
PCR体系如下：
Figure BDA0003288668740000191
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min10s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
以目的基因5的DNA分子为模板，采用引物对kur-for和kur-rev进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再用凝胶回收试剂盒回收目的基因5的基因片段。
引物序列如下：
kur-for：GGAATTCCATATGATGACCCAGCAACGGTGGCGCC
kur-rev：CCGCTCGAGTCAGAACCCGTAGCGCAGG
PCR体系如下：
Figure BDA0003288668740000192
Figure BDA0003288668740000201
PCR过程如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸50s，循环28次，72℃保温10min，降温至4℃，保存在4℃冰箱待用。
步骤三，用限制性内切酶双酶切pRSFDUet-I质粒和目的基因4的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-fdh转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-fdh。
用限制性内切酶双酶切重组质粒pRSF-fdh和目的基因5的基因片段，回收载体骨架和酶切产物，用T4 DNA连接酶将两者连接，连接产物pRSF-fdh-kur转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆、抽提质粒、进行测序鉴定，将正确的克隆命名为E-pRSF-fdh-kur。
实施例4第一重组工程菌E-28a-LA的诱导表达
将实施例1制备的第一重组工程菌E-28a-LA按2％的接种量接种于5ml的LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h，获得种子液；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子液接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD600值为0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集菌体，为菌体一，于-20℃下保存。发酵培养基包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
实施例5第二重组工程菌E-pRSF-mdh-ald的诱导表达
将实施例2中的第二重组工程菌E-pRSF-mdh-ald按2％的接种量接种于5ml的LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床培养8h，获得种子液；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子液接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入IPTG至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集菌体，为菌体二，于-20℃下保存。发酵罐中培养基包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
实施例6第三重组工程菌E-pRSF-fdh-kur的诱导表达
将实施例3中的第三重组工程菌E-pRSF-fdh-kur按2％的接种量接种于5ml的LB培养基，37℃，200rpm恒温摇床培养8h，获得种子液；LB培养基的组成如下：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
按照2％的接种量将种子液接种于10L发酵罐中，发酵罐中含6L发酵培养基，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6，加入IPTG至其终浓度为0.5mM/L，30℃下培养18h；收集菌体，为菌体三，于-20℃下保存。发酵培养基的组成包括七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
将实施例4所得的菌体一、实施例5所得的菌体二、实施例6所得的菌体三用于试验例1-6中制备D-泛解酸和D-泛解酸内酯。
试验例1D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，菌体一、菌体二、菌体三，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为8，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为55.3g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
试验例2D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
对菌体一、菌体二、菌体三进行破碎处理，分别获得L-氨基酸脱氨酶、醛缩酶、甲醇脱氢酶、甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶。
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，加水至总体积为5L，搅拌溶解，L-氨基酸脱氨酶10U/L、甲醇脱氢酶10U/L、醛缩酶12U/L、甲酸脱氢酶12U/L和酮泛解酸还原酶12U/L。流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。
调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为56.7g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
试验例3D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，菌体一、菌体二、菌体三，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为12，菌体三的OD值为8，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为55.0g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
试验例4D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，菌体一、菌体二、菌体三，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为56.9g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
试验例5D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，氯化锌3.4g，菌体一、菌体二、菌体三，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为59.56g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
试验例6D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，磷酸二氢钠6g，菌体一、菌体二、菌体三，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中菌体一的OD值为12，菌体二的OD值为10，菌体三的OD值为10，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，D-泛解酸浓度为60.44g/L，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
对比例1D-泛解酸和D-泛解酸内酯的制备
向反应容器中加入缬氨酸249.5g，甲醇68.25g，L-氨基酸脱氨酶、甲醇脱氢酶、醛缩酶、酮泛解酸还原酶、甲酸脱氢酶，加水至总体积为5L，搅拌溶解，反应体系中，L-氨基酸脱氨酶10U/L、甲醇脱氢酶10U/L、醛缩酶12U/L、酮泛解酸还原酶12U/L、甲酸脱氢酶12U/L，流加甲酸铵，维持反应液中甲酸铵浓度为2g/L。调节溶液温度为37℃，反应过程中采用稀硫酸和氨水调节溶液pH为5-7，在搅拌条件下持续反应20h，得到D-泛解酸溶液，经检测，转化率见图2。
取D-泛解酸反应液，过陶瓷膜；所得清相溶液，过纳滤膜；使用硫酸调节溶液pH至2.0以下，在50℃下搅拌反应0.5小时；加入0.1mol/LNaOH，调节溶液pH至6.0，浓缩、结晶，得到D-泛解酸内酯，收率见图3。
序列表
<110> 安徽华恒生物科技股份有限公司
合肥华恒生物工程有限公司
<120> 重组工程菌及其在制备泛化合物中的应用
<150> 202011524368X
<151> 2020-12-22
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctatat caagaaggaa atttattcta ggtggcacgg tggtggccgt tgctgcgggc 60
gcgggcgttt tgaccccgat gctgacccgt gaaggtcgtt tcgtgccggg tactccgcgc 120
cacggctttg tggagggtac tggtggtcca ctgccaaaac aagatgatgt tgtggtcatt 180
ggcgcgggca tcctcgggat catgactgcg attaacctgg cggaacgtgg cctgagcgtt 240
acgattgttg aaaaaggtaa tattgcaggc gaacaatcca gccgcttcta tggtcaggcg 300
atcagctaca aaatgccgga cgaaacgttt ctgctgcatc acctgggtaa gcaccgttgg 360
cgtgagatga acgcgaaagt tggcatcgac accacgtacc gcacccaggg acgtgttgag 420
gttccgcttg acgaggagga tctggagaat gttcgtaaat ggattgacgc caaatccaaa 480
gatgtgggtt ctgacatccc gttccgcact aaaatgattg aaggtgctga gctgaagcaa 540
cgtctgagag gcgccaccac cgattggaaa attgcaggct tcgaagagga cagcggttcg 600
ttcgatccgg aggtggctac gttcgtgatg gcagaatacg ccaaaaagat gggcatcaag 660
atctttacca actgcgcagc gcgtggcctg gaaacccaag cgggggtgat cagcgacgtg 720
gtgaccgaaa agggtccgat taaaaccagc cgtgttgttg tcgcgggcgg tgtcggttct 780
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caactgatca gcgccgctcc gaatgcgcct ggtggcaacg tggcgttgcc gggcggtatc 900
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<212> DNA
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gcaatcaaga tcatcagcaa gtacctgccg cgcgcagttg cgaacggtaa agacatcgag 720
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gcggctgaga aagcgattaa ggccatcgag cgtatggcgc gtgatttaaa tattccgaag 1020
ggtttcaaag agctgggtgc gaaagaggaa gatatcgaga cattggctaa aaacgctatg 1080
aatgatgcct gcgcactgac caatcctcgt aaaccgaagc tggaagaggt gattcaaatt 1140
atcaagaacg ccatg 1155
<210> 3
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaaaatt ggaagacatc agctgaaagt atcctgacga ccggtccggt cgttccggtt 60
attgtggtga agaagttgga gcacgctgtg ccgatggcca aggctctggt ggccggtggt 120
gttcgtgttc tggaggtgac gctgcgtacc gagtgcgcag tcgatgccat ccgcgcaatt 180
gctaaggagg tgccggaagc gatcgttggt gctggcaccg ttctcaaccc gcagcaactg 240
gcagaagtaa ctgaggcggg cgcgcagttt gcaatctctc cgggtttgac cgagccgttg 300
ctcaaggccg caaccgaggg caccattccg ctgattccgg ggatctcgac cgtgagcgaa 360
ctgatgctgg gtatggacta cggcctgaaa gaatttaaat tcttcccggc ggaagcgaat 420
ggtggcgtga aagcgctgca agcgatcgcg ggccctttta gccaggttcg cttctgcccg 480
acgggcggca tctccccggc gaactataga gactacctgg cgttaaaaag cgtcctgtgt 540
attggtggta gctggctggt tccagcggat gcgttggagg ctggcgacta tgatcgtatt 600
accaaacttg cgcgtgaagc ggtggaaggt gccaagttg 639
<210> 4
<211> 1152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctacag tactatgtgt tttatatccc gacccggttg acggctaccc gcctcactac 60
gtgcgcgaca ccataccggt catcacccgt tacgcggacg gccagaccgc gccgacccca 120
gccggcccac cgggttttcg tccgggtgag ttggtgggca gcgtttccgg gcttggtctg 180
cgtggctatt tggaggccca cggtcacacc ctgatcgtta ccagcgacaa ggacggtccg 240
gacagcgaat ttgaacgtcg tctgccggat gctgatgtgg tgatttccca gcctttctgg 300
cctgcctact tgactgccga gcgcattgca cgcgcgccaa agctgcgctt ggcgctgacc 360
gcaggtattg gtagcgatca tgttgatctg gacgctgccg cgcgcgcgca catcaccgtg 420
gcggaggtga cgggtagcaa tagcattagt gttgctgagc acgttgttat gaccactctg 480
gcgttggttc gcaactattt accgtcccat gccatcgccc aacagggtgg catgaatatt 540
gcggattgcg tttctagatc ctacgacgtg gaaggtatgc attttggtac ggtcggggca 600
ggccgtatcg gccttgcggt actgcgtcgt ttaccgttcg gtctgcactt gcactatacc 660
caacgtcatc gtcttgatgc ggcgattgaa caagagctgg gtctgacgta tcatgcagat 720
ccggctagcc tggctgcggc ggtagacatc gtgaacctgc agattccgct gtatccgtcg 780
accgaacacc tattcgacgc ggcaatgatt gcccgtatga aacgtggtgc gtacctgatc 840
aacaccgctc gcgcgaaact ggtggatcgt gatgcggtcg tgagagcggt cacgtcaggt 900
catctcgctg gttacggcgg tgatgtttgg ttcccgcagc cggctccggc ggaccacccg 960
tggcgtgcga tgccgttcaa cggtatgacc ccgcatatct ctggcacttc tctgagcgca 1020
caggcacgct acgcagctgg caccctggag atcctgcaat gttggtttga tggccgtccg 1080
attcgtaatg aatatctgat cgtggacggc ggaacattgg cgggcacggg tgcacaaagc 1140
tatcgtttga cc 1152
<210> 5
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacacagc aaagatggag gctagatgga caaaccgcgc tgatcaccgg tgcctccgct 60
ggcatcggcc tggcgattgc ccacgaatta gcaggtttcg gtgctgatct gatgatcgtt 120
ggtcgtgaca tcgatatgct ggaaaccgct agagacgagc tcttggacgt gtacccgcag 180
atgcaggttc atgcgctggc tgcggatgtt tccgacgacg aggatcgtcg ccaaattctg 240
gactgggtcg aggaccactc cgacggcctg cacatcttgg tcaacaacgc tggcggtaat 300
gttaccaaag cagccaccga atatagcgaa gatgagtggc gtaaaatctt tgagacaaat 360
ttgtttagcg cgtttgagtt gtctcgttac gcgcacccgc tgctggcgcg ccacgcgagc 420
agcagcattg tgaacgtagg tagcgtttct ggtttgaccc atgttcgttc tggcgttgtt 480
tatggcatga gcaaggcggc tatgcatcag atgacccgta atctggcggt ggagtgggca 540
gaagacggta ttcgtgttaa cgcagtggca ccgtggtata tccgcacgcg tcgcacgagc 600
ggcccactga gcgatccgga ttactacgag gaagtgatca accgcacccc gatgcgtcgt 660
attggtgaac cggaagaggt cgcggcggcg gtgggcttcc tttgcctgcc ggcagcgagc 720
tatgtgactg gtgaatgtat tgcggtggat ggtggtttcc tgcgttacgg cttctaa 777
<210> 6
<211> 471
<212> PRT
<213> Proteus mirabilis
<400> 6
Met Ala Ile Ser Arg Arg Lys Phe Ile Leu Gly Gly Thr Val Val Ala
1 5 10 15
Val Ala Ala Gly Ala Gly Val Leu Thr Pro Met Leu Thr Arg Glu Gly
20 25 30
Arg Phe Val Pro Gly Thr Pro Arg His Gly Phe Val Glu Gly Thr Gly
35 40 45
Gly Pro Leu Pro Lys Gln Asp Asp Val Val Val Ile Gly Ala Gly Ile
50 55 60
Leu Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Leu Ser Val
65 70 75 80
Thr Ile Val Glu Lys Gly Asn Ile Ala Gly Glu Gln Ser Ser Arg Phe
85 90 95
Tyr Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Lys Met Pro Asp Glu Thr Phe Leu Leu
100 105 110
His His Leu Gly Lys His Arg Trp Arg Glu Met Asn Ala Lys Val Gly
115 120 125
Ile Asp Thr Thr Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Val Pro Leu Asp
130 135 140
Glu Glu Asp Leu Glu Asn Val Arg Lys Trp Ile Asp Ala Lys Ser Lys
145 150 155 160
Asp Val Gly Ser Asp Ile Pro Phe Arg Thr Lys Met Ile Glu Gly Ala
165 170 175
Glu Leu Lys Gln Arg Leu Arg Gly Ala Thr Thr Asp Trp Lys Ile Ala
180 185 190
Gly Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Phe Asp Pro Glu Val Ala Thr Phe
195 200 205
Val Met Ala Glu Tyr Ala Lys Lys Met Gly Ile Lys Ile Phe Thr Asn
210 215 220
Cys Ala Ala Arg Gly Leu Glu Thr Gln Ala Gly Val Ile Ser Asp Val
225 230 235 240
Val Thr Glu Lys Gly Pro Ile Lys Thr Ser Arg Val Val Val Ala Gly
245 250 255
Gly Val Gly Ser Arg Leu Phe Met Gln Asn Leu Asn Val Asp Val Pro
260 265 270
Thr Leu Pro Ala Tyr Gln Ser Gln Gln Leu Ile Ser Ala Ala Pro Asn
275 280 285
Ala Pro Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Gly Gly Ile Phe Phe Arg Asp
290 295 300
Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Thr Ser Pro Arg Val Ile Val Ala Pro
305 310 315 320
Val Val Lys Glu Ser Phe Thr Tyr Gly Tyr Lys Tyr Leu Pro Leu Leu
325 330 335
Ala Leu Pro Asp Phe Pro Val His Ile Ser Leu Asn Glu Gln Leu Ile
340 345 350
Asn Ser Phe Met Gln Ser Thr His Trp Asp Leu Asn Glu Glu Ser Pro
355 360 365
Phe Glu Lys Tyr Arg Asp Met Thr Ala Leu Pro Asp Leu Pro Glu Leu
370 375 380
Asn Ala Ser Leu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Phe Pro Ala Phe Lys Glu
385 390 395 400
Ser Thr Leu Ile Asp Gln Trp Ser Gly Ala Met Ala Ile Ala Pro Asp
405 410 415
Glu Asn Pro Ile Ile Ser Asp Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile
420 425 430
Asn Thr Ala Thr Gly Trp Gly Met Thr Glu Ser Pro Val Ser Ala Glu
435 440 445
Ile Thr Ala Asp Leu Leu Leu Gly Lys Lys Pro Val Leu Asp Ala Lys
450 455 460
Pro Phe Ser Leu Tyr Arg Phe
465 470
<210> 7
<211> 385
<212> PRT
<213> Bacillus methanolicus
<400> 7
Met Lys Asn Thr Gln Ser Ala Phe Tyr Met Pro Ser Val Asn Leu Phe
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ser Val Asn Glu Val Gly Thr Arg Leu Ala Gly Leu Gly
20 25 30
Val Lys Lys Ala Leu Leu Val Thr Asp Ala Gly Leu His Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Ser Glu Lys Ile Ala Gly Ile Ile Arg Glu Ala Gly Val Glu Val
50 55 60
Ala Ile Phe Pro Lys Ala Glu Pro Asn Pro Thr Asp Lys Asn Val Ala
65 70 75 80
Glu Gly Leu Glu Ala Tyr Asn Ala Glu Asn Cys Asp Ser Ile Val Thr
85 90 95
Leu Gly Gly Gly Ser Ser His Asp Ala Gly Lys Ala Ile Ala Leu Val
100 105 110
Ala Ala Asn Gly Gly Thr Ile His Asp Tyr Glu Gly Val Asp Val Ser
115 120 125
Lys Lys Pro Met Val Pro Leu Ile Ala Ile Asn Thr Thr Ala Gly Thr
130 135 140
Gly Ser Glu Leu Thr Lys Phe Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Arg Lys
145 150 155 160
Val Lys Met Ala Ile Val Asp Lys His Val Thr Pro Thr Leu Ser Ile
165 170 175
Asn Asp Pro Glu Leu Met Val Gly Met Pro Pro Ser Leu Thr Ala Ala
180 185 190
Thr Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Ala Ile Glu Ala Tyr Val Ser Thr
195 200 205
Gly Ala Thr Pro Ile Thr Asp Ala Leu Ala Ile Gln Ala Ile Lys Ile
210 215 220
Ile Ser Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Val Ala Asn Gly Lys Asp Ile Glu
225 230 235 240
Ala Arg Glu Gln Met Ala Phe Ala Gln Ser Leu Ala Gly Met Ala Phe
245 250 255
Asn Asn Ala Gly Leu Gly Tyr Val His Ala Ile Ala His Gln Leu Gly
260 265 270
Gly Phe Tyr Asn Phe Pro His Gly Val Cys Asn Ala Ile Leu Leu Pro
275 280 285
His Val Cys Arg Phe Asn Leu Ile Ser Lys Val Glu Arg Tyr Ala Glu
290 295 300
Ile Ala Ala Phe Leu Gly Glu Asn Val Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Glu
305 310 315 320
Ala Ala Glu Lys Ala Ile Lys Ala Ile Glu Arg Met Ala Arg Asp Leu
325 330 335
Asn Ile Pro Lys Gly Phe Lys Glu Leu Gly Ala Lys Glu Glu Asp Ile
340 345 350
Glu Thr Leu Ala Lys Asn Ala Met Asn Asp Ala Cys Ala Leu Thr Asn
355 360 365
Pro Arg Lys Pro Lys Leu Glu Glu Val Ile Gln Ile Ile Lys Asn Ala
370 375 380
Met
385
<210> 8
<211> 213
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Met Lys Asn Trp Lys Thr Ser Ala Glu Ser Ile Leu Thr Thr Gly Pro
1 5 10 15
Val Val Pro Val Ile Val Val Lys Lys Leu Glu His Ala Val Pro Met
20 25 30
Ala Lys Ala Leu Val Ala Gly Gly Val Arg Val Leu Glu Val Thr Leu
35 40 45
Arg Thr Glu Cys Ala Val Asp Ala Ile Arg Ala Ile Ala Lys Glu Val
50 55 60
Pro Glu Ala Ile Val Gly Ala Gly Thr Val Leu Asn Pro Gln Gln Leu
65 70 75 80
Ala Glu Val Thr Glu Ala Gly Ala Gln Phe Ala Ile Ser Pro Gly Leu
85 90 95
Thr Glu Pro Leu Leu Lys Ala Ala Thr Glu Gly Thr Ile Pro Leu Ile
100 105 110
Pro Gly Ile Ser Thr Val Ser Glu Leu Met Leu Gly Met Asp Tyr Gly
115 120 125
Leu Lys Glu Phe Lys Phe Phe Pro Ala Glu Ala Asn Gly Gly Val Lys
130 135 140
Ala Leu Gln Ala Ile Ala Gly Pro Phe Ser Gln Val Arg Phe Cys Pro
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asn Tyr Arg Asp Tyr Leu Ala Leu Lys
165 170 175
Ser Val Leu Cys Ile Gly Gly Ser Trp Leu Val Pro Ala Asp Ala Leu
180 185 190
Glu Ala Gly Asp Tyr Asp Arg Ile Thr Lys Leu Ala Arg Glu Ala Val
195 200 205
Glu Gly Ala Lys Leu
210
<210> 9
<211> 384
<212> PRT
<213> burkholderia stabilis
<400> 9
Met Ala Thr Val Leu Cys Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Pro His Tyr Val Arg Asp Thr Ile Pro Val Ile Thr Arg Tyr Ala
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Arg Pro
35 40 45
Gly Glu Leu Val Gly Ser Val Ser Gly Leu Gly Leu Arg Gly Tyr Leu
50 55 60
Glu Ala His Gly His Thr Leu Ile Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro
65 70 75 80
Asp Ser Glu Phe Glu Arg Arg Leu Pro Asp Ala Asp Val Val Ile Ser
85 90 95
Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg Ala
100 105 110
Pro Lys Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val
115 120 125
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala His Ile Thr Val Ala Glu Val Thr
130 135 140
Gly Ser Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Thr Leu
145 150 155 160
Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Ala Ile Ala Gln Gln Gly
165 170 175
Gly Met Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser Arg Ser Tyr Asp Val Glu Gly
180 185 190
Met His Phe Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu
195 200 205
Arg Arg Leu Pro Phe Gly Leu His Leu His Tyr Thr Gln Arg His Arg
210 215 220
Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr His Ala Asp
225 230 235 240
Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Val Asp Ile Val Asn Leu Gln Ile Pro
245 250 255
Leu Tyr Pro Ser Thr Glu His Leu Phe Asp Ala Ala Met Ile Ala Arg
260 265 270
Met Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Ala Lys Leu Val
275 280 285
Asp Arg Asp Ala Val Val Arg Ala Val Thr Ser Gly His Leu Ala Gly
290 295 300
Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His Pro
305 310 315 320
Trp Arg Ala Met Pro Phe Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly Thr
325 330 335
Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Leu Glu Ile Leu
340 345 350
Gln Cys Trp Phe Asp Gly Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile Val
355 360 365
Asp Gly Gly Thr Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Tyr Arg Leu Thr
370 375 380
<210> 10
<211> 258
<212> PRT
<213> Stenotrophomonas
<400> 10
Met Thr Gln Gln Arg Trp Arg Leu Asp Gly Gln Thr Ala Leu Ile Thr
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala His Glu Leu Ala Gly
20 25 30
Phe Gly Ala Asp Leu Met Ile Val Gly Arg Asp Ile Asp Met Leu Glu
35 40 45
Thr Ala Arg Asp Glu Leu Leu Asp Val Tyr Pro Gln Met Gln Val His
50 55 60
Ala Leu Ala Ala Asp Val Ser Asp Asp Glu Asp Arg Arg Gln Ile Leu
65 70 75 80
Asp Trp Val Glu Asp His Ser Asp Gly Leu His Ile Leu Val Asn Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Asn Val Thr Lys Ala Ala Thr Glu Tyr Ser Glu Asp Glu
100 105 110
Trp Arg Lys Ile Phe Glu Thr Asn Leu Phe Ser Ala Phe Glu Leu Ser
115 120 125
Arg Tyr Ala His Pro Leu Leu Ala Arg His Ala Ser Ser Ser Ile Val
130 135 140
Asn Val Gly Ser Val Ser Gly Leu Thr His Val Arg Ser Gly Val Val
145 150 155 160
Tyr Gly Met Ser Lys Ala Ala Met His Gln Met Thr Arg Asn Leu Ala
165 170 175
Val Glu Trp Ala Glu Asp Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Ala Pro Trp
180 185 190
Tyr Ile Arg Thr Arg Arg Thr Ser Gly Pro Leu Ser Asp Pro Asp Tyr
195 200 205
Tyr Glu Glu Val Ile Asn Arg Thr Pro Met Arg Arg Ile Gly Glu Pro
210 215 220
Glu Glu Val Ala Ala Ala Val Gly Phe Leu Cys Leu Pro Ala Ala Ser
225 230 235 240
Tyr Val Thr Gly Glu Cys Ile Ala Val Asp Gly Gly Phe Leu Arg Tyr
245 250 255
Gly Phe

Claims (31)

1.一种重组工程菌在制备D-泛解酸中的应用，具体为：第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三，将菌体一、菌体二、菌体三用于制备D-泛解酸；
所述第一重组工程菌表达L-氨基酸脱氨酶，所述L-氨基酸脱氨酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述第二重组工程菌表达甲醇脱氢酶和醛缩酶，所述甲醇脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述醛缩酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述第三重组工程菌表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶，所述甲酸脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述酮泛解酸还原酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述诱导表达方法为：
（1）将重组工程菌按照1-5%接种量接种于LB培养基中，于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-12h，获得种子液；
（2）将种子液按照1-10%的接种量接种于发酵培养基中，30-40℃、pH 6.0-8.0下培养至发酵液OD600值为0.5-2，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5-1mM/L，30℃下发酵培养12-24h，收集湿菌体，于-20℃下保存。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述LB培养基的组成包括：卡那霉素50mg/L，胰蛋白胨10g/，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。
4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述发酵培养基的组成包括：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，培养温度为30-37℃。
6.根据权利要求2所述的应用，其中，转速为100-400rpm。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，转速为200-300rpm。
8.根据权利要求2所述的应用，其中，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD600值为0.6-1。
9.根据权利要求2所述的应用，其中，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.6-0.8mM/L。
10.一种D-泛解酸的制备方法，包括下述步骤：将菌体一、菌体二、菌体三，以及缬氨酸、甲醇加水混合，添加甲酸铵，在30-40℃、pH为4-7条件下反应10-60h，制得D-泛解酸；
其中，第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三；
所述第一重组工程菌表达L-氨基酸脱氨酶，所述L-氨基酸脱氨酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述第二重组工程菌表达甲醇脱氢酶和醛缩酶，所述甲醇脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述醛缩酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述第三重组工程菌表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶，所述甲酸脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述酮泛解酸还原酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
11.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述第一重组工程菌含有L-氨基酸脱氨酶编码基因，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
12.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应体系菌体一的OD600值为5-15。
13.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述第二重组工程菌含有甲醇脱氢酶编码基因和醛缩酶编码基因，所述甲醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2，所述醛缩酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
14.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应体系菌体二的OD600值为8-15。
15.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述第三重组工程菌含有甲酸脱氢酶编码基因和酮泛解酸还原酶编码基因，所述甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述酮泛解酸还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
16.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应体系菌体三的OD600值为8-15。
17.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述缬氨酸：甲醇的摩尔比为(0.9-1.1):(0.9-1.1)。
18.根据权利要求17所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述缬氨酸：甲醇的摩尔比为(0.95-1.05):(0.95-1.05)。
19.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，甲酸铵以流加方式进行添加。
20.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，甲酸铵的浓度为1.5g/L-2.5g/L。
21.根据权利要求20所述的D-泛解酸的制备方法，其中，甲酸铵的浓度为1.8g/L-2.2g/L。
22.根据权利要求10所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应体系中还加入金属盐或磷酸盐溶液。
23.根据权利要求22所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述金属盐或磷酸盐选自锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、钠盐、钾盐中的任一种或其组合。
24.根据权利要求23所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述金属盐或磷酸盐为氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化铜、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸钾、硫酸镁、硫酸锌、硫酸钙、硫酸铜、磷酸镁、磷酸锌、磷酸钙、磷酸铜、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的任一种或其组合。
25.根据权利要求22所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为0-50mmol/L。
26.根据权利要求25所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为1-40mol/L。
27.根据权利要求26所述的D-泛解酸的制备方法，其中，所述金属盐或磷酸盐溶液浓度为5-30mol/L。
28.根据权利要求10-27任一项所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应温度为35-38℃。
29.根据权利要求10-27任一项所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应时间为20-40h。
30.根据权利要求10-27任一项所述的D-泛解酸的制备方法，其中，反应体系pH为5-7。
31.根据权利要求30所述的D-泛解酸的制备方法，其中，用于调节反应体系pH的pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙胺、氢氧化钾、磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硫酸的任一种。
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