CN114634991B

CN114634991B - 一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用

Info

Publication number: CN114634991B
Application number: CN202210198993.2A
Authority: CN
Inventors: 李静; 杨耀东; 王永; 吴翼; 肖勇; 刘蕊; 张璐璐; 曾春茹
Original assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: CN114634991A

Abstract

本发明提供了一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用。其中InDel标记引物对序列如SEQ ID No.1‑2所示或如SEQ ID No.3‑4所示，InDel标记引物组由SEQ ID No.1‑2所述引物对和SEQ ID No.3‑4所述引物对组成。同时还公开了包括所述InDel标记引物对或所述InDel标记引物组的试剂盒。采用本发明的InDel标记引物对或InDel标记引物组或试剂盒对椰子进行PCR扩增电泳，即可根据电泳条带鉴别出高种椰子品种，可以在苗期到成年大树中随时检测，鉴定准确率高，对于区分高种椰子具有重要意义。

Description

一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用。

背景技术

椰子(Cocos nucifera L.)又叫胥椰、胥余或越王头，是棕榈科椰子属中唯一的一个种，属于单子叶多年生常绿乔木，是热带地区重要的木本油料作物，也是食品能源作物，经济寿命达 25～60年，自然寿命可达100年以上。

按照常规分类方法可将椰子分为高种椰子、矮种椰子以及介于高种和矮种之间的中间类型。其中高种椰子的主要特征为植株高大，椰干基部膨大呈“葫芦头”，异花授粉；而矮种椰子植株矮小，椰干基部没有“葫芦头”，自花授粉，经济寿命和自然寿命较短；中间类型则介于以上两者之间。此外,在各类变种中根据果实大小、果实形状和果皮颜色等，又将椰子种质资源分为若干类型，例如矮种椰子可根据果皮颜色分为黄矮、红矮、绿矮和褐矮。

海南高种椰子植株较为高大。五年龄椰树茎秆可达3～5米，茎干较粗壮，抗风能力强，抗寒性较好，椰衣含量较高，果实较大，果实的围径达50～60cm，椰肉脂肪酸含量高(60％以上)，经济寿命可达50～60年，但存在生产周期长，种植后7～8年才开花结果、年产果量较少等缺点。

矮种椰子植株较矮，五年龄椰树茎秆可达1.5～2米。茎干偏细，抗台风、抗寒力弱；果实较小，果实围径大概30～40cm，椰肉脂肪酸含量偏低。经济寿命较短，约25～30年。但其种植后结果早(4～6年可开花结果)，产果量高，椰子水甜度高。此外由于其产果量高、种质纯，育种中常作为杂交亲本(母本)用于培育杂交种。

InDel标记(Insertion-Deletion)是在全基因组重测序的基础上开发的，是等位基因位点上 DNA***或缺失一段短序列产生的多态性变异。简单来说就是两个亲本在全基因组中的差异，对于其中的一个亲本基因组，另外一个亲本中有一定数量的核苷酸的***或者缺失，可以根据基因组中***或缺失的位点，设计扩增这些位点的PCR引物，就是InDel标记。

InDels广泛分布在整个基因组中，与其它的分子标记相比，在基因组的相同位置出现相同大小的InDel标记的几率很小，避免了后续分析的模糊性。在基因组序列测定的基础上， InDel标记可以通过生物信息学的方法方便简单地获得。与SSR标记相比，InDel标记的扩增产物带型清晰简单，稳定性和产物分离效果均优于SSR标记。InDel标记具有其它分子标记的优点。基于全基因组重测序的InDel标记，具有在基因组内分布广、密度高、多态性强、检测容易、分型***简单、遗传稳定。InDel标记适用于全基因组分子标记的开发，目前已开始应用于动植物群体遗传分析、构建高密度分子标记遗传图谱和基因定位、生物的遗传多样性分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，首次利用椰子重测序所得的***和缺失序列开发椰子InDel标记，应用多态性InDel标记获取部分椰子品种的指纹特征图谱，利用筛选得到的分子标记组合开展椰子品种纯度鉴定和种苗的早期选育，通过分子标记辅助选育缩短椰子新品种的繁育周期。

本发明是提供一组用于鉴别高种椰子的InDel标记引物对，所述InDel标记引物对如SEQ ID No.1-2所述引物对或者如SEQ ID No.3-4所述引物对。

本发明的第二个方面是提供一种用于鉴别高种椰子的InDel标记引物组，所述InDel标记引物组由SEQ ID No.1-2所述引物对和SEQ ID No.3-4所述引物对组成。

本发明的第三个方面是提供一种用于鉴别高种椰子的试剂盒，其包括本发明的第一个方面所述的InDel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的InDel标记引物组。

优选地，所述试剂盒还包括进行PCR反应和电泳所需的试剂。

本发明的第四个方面是提供本发明的第一个方面所述的InDel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的InDel标记引物组或者本发明的第三个方面所述的试剂盒在鉴别高种椰子中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种鉴别高种椰子的方法，采用第一个方面所述的InDel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的InDel标记引物组或者本发明的第三个方面所述的试剂盒进行。

优选地，所述方法，包括以下步骤：(1)提取椰子叶片DNA；(2)采用InDel标记引物对或InDel标记引物组或试剂盒对椰子叶片DNA进行PCR扩增；(3)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(4)根据检测结果对不同品种椰子进行鉴别，与凝胶电泳目的条带大小一致的是海南高种椰子，而存在***或缺失片段使得电泳结果小于或大于目的条带或目的片段的是其他品种椰子(如马哇椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、香水椰子等)，其中：

当所述InDel标记引物对如SEQ ID No.1-2所示引物对时，目的条带或目的片段为142bp；

当所述InDel标记引物对如SEQ ID No.3-4所示引物对时，目的条带或目的片段为141bp。

本发明的有益效果：

高种椰子和矮种椰子各有优缺点，因此在杂交育种中，确定亲本的品种以及亲缘关系尤为重要。明确的椰子品种是椰子分子育种的重要前提和保障。采用本发明的InDel标记引物对对椰子进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并染色或测序，即可根据电泳条带结果鉴别出高种椰子品种，可以在苗期到成年大树中随时检测，对于区分高种椰子与其他椰子品种具有重要意义，鉴定准确率高，能够保证高种椰子的纯度，在椰子杂交育种领域应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明的InDel标记引物对ID202和ID325对6个椰子品种扩增产物电泳图，每个品种取不同的三棵树提取DNA作为生物学重复。其中R1、R2和R3为红矮椰子；Y1、Y2 和Y3为黄矮椰子；X1、X2和X3为褐矮椰子；G1、G2和G3为香水椰子；M1、M2和M3 为马哇椰子；B1、B2和B3为海南高种椰子。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

一、椰子叶片的DNA提取

实验材料：选择6个椰子品种共18个样品，其中马哇椰子3个、海南高种椰子3个、红矮椰子3个、黄矮椰子3个、香水椰子3个、褐矮椰子3个。以上样品均来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所椰子种质资源圃。

椰子叶片的DNA提取参考CTAB法，具体操作为：

称取1g左右椰子叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，转入2mL离心管中，加约1mL提取缓冲液，摇匀后置于冰上；4℃条件下8000r/min离心5min，弃去上清，再次加入约1mL提取缓冲液，摇匀后，4℃条件下8000r/min离心5min，弃去上清；加入约800μL 预热至65℃的裂解缓冲液，摇匀后65℃水浴60min，每10min摇一次；加入等体积加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)抽提液抽提，充分混匀，8000r/min 25℃离心10min，取上清转入新离心管；再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀，8000r/min 25℃离心10min，取上清转入新离心管；加入0.6倍体积的冰冻异丙醇和1/10体积的3M乙酸钠(pH 5.2)，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出，4℃放置过夜；将沉淀钩出，转入新离心管，用75％的酒精漂洗2次， 25℃条件下8000r/min离心5min，倒干酒精；自然风干后加200μLTE缓冲液溶解，用 NanoDrop核酸测定仪检测DNA的浓度并加TE缓冲液将所有DNA浓度调至50ng/μL，-20℃ 保存备用。

二、InDel标记引物的设计

根据香水椰子和黄矮椰子基因组重测序所得大量的序列，以海南高种椰子基因组为参考，通过Blastn序列比对，得到InDel序列的相关信息，根据***和缺失序列，从中选取400个序列片段采用软件Primer Premier 5.0设计引物，引物设计分为***缺失片段大小为5bp和＞5bp两种类型。筛选得到2对引物，可用于鉴别高种椰子，如表1所示。

表1用于筛选高种椰子的InDel标记引物

引物编号	正向引物(5'-3')	反向引物(5'-3')	产物长度(bp)
				ID202	TCCTTCACAAATACCTGCAA	GCAAATTGTTTTGGCTTCT	142
ID325	CTCATGGCATACTCTGGTGC	ATCGCTGTTCTTTCCACTCA	141

三、鉴别高种椰子品种

①InDel标记引物对ID202

用于鉴别高种椰子品种的InDel标记引物对为ID202(表1)。采用ID202对“一、椰子叶片的DNA提取”中所得的不同品种椰子叶片的DNA进行PCR扩增；PCR扩增体系为： 10×Buffer(Mg ²⁺)2μL，4×dNTP Mixture(10mM each)0.5μL；10μmol/L正、反向引物各1.0 μL；20ng/μL DNA2μL；5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL；加无菌ddH ₂O至20μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸50s，重复循环30次； 72℃延伸10min。PCR扩增产物中加入3μL6×上样缓冲液混匀后取1.2μL点样，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带；聚丙烯酰胺胶30(mL)：ddH₂O15.81 mL；5×TBE 6mL；30％ (丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝29：1)贮存液7.98mL；10％AP(过硫酸铵)0.21mL，TEMED 15μL，电泳条件为6％PAGE，150V、400mA、30W，电泳时间为1h 20min；电泳后使用硝酸银进行染色并拍照。结果见图1和表2，目的条带为142bp，海南高种椰子的带型为长度142 bp的条带，马哇椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、香水椰子的带型为长度148bp的条带。说明InDel标记引物对ID202可特异性鉴别海南高种椰子。

②InDel标记引物对ID325

采用与“①InDel标记引物对ID202”相同的方法，用InDel标记引物对ID325(表1)对高种椰子品种进行鉴别。结果如图1和表2所示，目的条带为141bp，海南高种椰子的带型为长度141bp的条带，马哇椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、香水椰子的带型为长度156bp的条带。说明InDel标记引物对ID325可特异性鉴别海南高种椰子。

表2用于筛选高种椰子的多态性引物带型

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院椰子研究所

<120> 一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

tccttcacaa atacctgcaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

gcaaattgtt ttggcttct 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

ctcatggcat actctggtgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

atcgctgttc tttccactca 20

Claims

1.一种用于鉴别海南高种椰子的InDel标记引物对，其特征在于，所述InDel标记引物对如SEQ ID No.3-4所述引物对。

2.一种用于鉴别海南高种椰子的InDel标记引物组，其特征在于，所述InDel标记引物组由SEQ ID No.1-2所述引物对和SEQ ID No.3-4所述引物对组成。

3.一种用于鉴别海南高种椰子的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的InDel标记引物对、或者权利要求2所述的InDel标记引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。

5.权利要求1所述的InDel标记引物对、或者权利要求2所述的InDel标记引物组、或者权利要求3或4所述的试剂盒在鉴别海南高种椰子中的应用。

6.一种鉴别海南高种椰子的方法，其特征在于，采用权利要求1述的InDel标记引物对、或者权利要求2所述的InDel标记引物组、或者权利要求3或4所述的试剂盒进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取椰子叶片DNA；

（2）采用InDel标记引物对、或InDel标记引物组或试剂盒对椰子叶片DNA进行PCR扩增；

（3）对扩增结果进行凝胶电泳检测；

（4）根据检测结果对不同品种椰子进行鉴别，凝胶电泳与目的条带大小一致的是海南高种椰子，而存在***或缺失片段使得电泳小于或大于目的条带或目的片段的是其他品种椰子，其中：

当所述InDel标记引物对为SEQ ID No.1-2所示引物对时，目的条带或目的片段为142bp；

当所述InDel标记引物对为SEQ ID No.3-4所示引物对时，目的条带或目的片段为141bp。