CN116179736B - 用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 - Google Patents
用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116179736B CN116179736B CN202210811346.4A CN202210811346A CN116179736B CN 116179736 B CN116179736 B CN 116179736B CN 202210811346 A CN202210811346 A CN 202210811346A CN 116179736 B CN116179736 B CN 116179736B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- varieties
- strawberry
- ssr
- marker primer
- ssr marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 title claims abstract description 105
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 title claims abstract description 105
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 title 1
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 claims abstract description 128
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 101001115232 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S22-A Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101000811330 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S22-B Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 26
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 10
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 12
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 12
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 240000003173 Drymaria cordata Species 0.000 description 9
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 8
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 8
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 7
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 7
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 7
- 241001274961 Rubus repens Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 7
- QJVOZXGJOGJKPT-IGHBBLSQSA-N (1r,2r,5s,11ar)-2-(prop-2-en-1-yl)-1,2,3,4,5,6,11,11a-octahydro-10h-1,5-methanopyrido[1,2-a][1,5]diazocin-10-one Chemical compound C([C@@H]12)C(=O)C=CN1C[C@@H]1CN[C@H](CC=C)[C@H]2C1 QJVOZXGJOGJKPT-IGHBBLSQSA-N 0.000 description 6
- QJVOZXGJOGJKPT-UHFFFAOYSA-N albine Natural products C12CC(=O)C=CN2CC2CNC(CC=C)C1C2 QJVOZXGJOGJKPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 240000007839 Kleinhovia hospita Species 0.000 description 5
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 240000005001 Paeonia suffruticosa Species 0.000 description 4
- 235000003889 Paeonia suffruticosa Nutrition 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 3
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 2
- 101100059652 Mus musculus Cetn1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100059655 Mus musculus Cetn2 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000198134 Agave sisalana Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 241000220221 Rosales Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于植物品种分子鉴定技术领域，具体公开了一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组及其应用。本发明利用SSR分子标记技术，从178对草莓SSR标记引物中筛选出9对多态性好、条带清晰的核心引物，分别为C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149。利用该SSR标记引物组能够构建出已区分多达60个草莓品种的特征指纹图谱，实现了对不同品种草莓的初步区分，可用于鉴定草莓品种的纯度及真实性。本发明的鉴定方法操作简单，扩增条带清晰、多态性好，对设备要求低，检测成本可控，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物品种分子鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组及其在草莓品种指纹图谱构建、品种纯度及真实性鉴定中的应用。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa Duch.)为蔷薇目蔷薇科多年生草本植物。草莓营养价值高，含有多种营养物质，且有保健功效，有“水果皇后”的美称，原产南美，在中国各地及欧洲等地广为栽培。
草莓在世界上广泛种植，是重要的经济果树。草莓品种繁多，其倍性包括二倍体、四倍体、六倍体、八倍体和十倍体，可利用种子繁殖、匍匐茎繁殖等方式进行繁殖培育。但其中通过匍匐茎营养繁殖时，易导致种质资源圃的种类混乱，长期以来人们大多通过草莓的形状特点来鉴别区分种类。栽培草莓一般是八倍体，以众多农艺特性为主要数量特征。常见的草莓品种鉴定也经常采用外部形态观察来进行。但由于草莓的多数植物学特性易受生长环境、栽培条件等的干扰，常规的植物形态学技术往往存在鉴别周期长、结果误差大、对部分性状差别小的种类不易识别等缺陷。因而，草莓品种纯度及品种权保护尚需要更可靠的种质鉴定方法。
近年来，分子生物学技术发展迅速，用于分子标记的技术包括RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA标记)、RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism，限制性内切酶片段长度多态性)、AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism，扩增片段长度多态性))、SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列等)等。其中，RAPD分子标记技术是利用9-10bp的随机脱氧核糖核苷酸序列为引物，以所研究的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，染色后进行多态性检测，具有检测简单、所需DNA量少、成本较低等优点。但是RAPD技术不能区分杂合与纯合个体，且影响实验与结果的因素很多，所以其稳定性和重复性较差。RFLP分子标记技术是基于单个碱基突变或DNA序列发生***、缺失、倒位、易位等变异导致限制性内切酶酶切位点的增减或酶切位点距离改变的原理，用已知的限制性内切酶酶切目标DNA，经电泳分离条带后，再用DNA探针杂交并放射自显影，从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP所需DNA用量大，且纯度要求高，实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂。AFLP分子标记技术是RFLP与PCR的结合，其基本原理是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性核酸内切酶切割，然后将人工双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物进行扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，由于不同材料的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态性。AFLP技术具有RFLP技术的可靠性与PCR技术的高效性，且与RFLP技术相比，AFLP不需要Southern杂交等步骤，只需少量DNA，实验结果稳定可靠，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但该技术的检测费用较高，对DNA纯度和内切酶的质量要求很高。SSR分子标记技术是一类由几个核苷酸(一般为2-5bp)为重复单位组成的简单串联重复序列，其重复次数在物种间、品种间、甚至个体间具有非常大的变异性，重复序列两侧往往有一小段保守的序列，根据重复序列两侧的保守序列设计特异性引物进行DNA扩增，再经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段，由于不同大小片段的迁移率不同，因此可产生多个条带，呈现出多态性。目前已在许多动植物和人类中进行了开发应用，如在玉米、水稻、大豆等作物品种的纯度鉴定和遗传多样性研究中已广泛使用SSR分子标记技术。SSR标记分布于整个基因组，具有数量丰富、等位变异高、共显性、检测方法简单、结果稳定可靠等优点。
多倍体草莓中显性标记呈现剂量效应，SSR作为草莓分子标记技术较为理想，可用于遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面。其中，遗传图谱是人类遗传科学研究的主要内容，同时也是种质资源选育、遗传克隆等领域研究工作的重要理论依据和基石。DNA指纹图谱是构建在DNA标记基础上的某一品种与其他品种产生差异的特异性DNA片段。目前已在烟草、黄瓜、樱桃、辣椒等植物中广泛应用SSR分子标记技术构建DNA指纹图谱，主要用于品种纯度及真实性鉴定。
中国专利CN107190089B公开了一种利用3对SSR标记引物对3个草莓品种(紫莓1号、紫莓3号和太空1号)进行快速鉴定的方法，包括：提取草莓总DNA，SSR标记引物PCR扩增，扩增产物电泳及染色，根据电泳结果鉴定草莓品种。该方法可以构建3个草莓品种间的特征指纹图谱，筛选出不同于当地长期种植的传统品种的引进品种。中国专利CN107663548B公开了一种“申阳”草莓SSR分子指纹图谱的构建方法，从覆盖草莓全基因组的140对SSR标记引物中筛选出8对引物，利用其建立草莓杂交种“申阳”的SSR分子指纹图谱，用于快速微繁出品种纯度完整的“申阳”草莓原种苗。但是，上述专利方法能够鉴定出的草莓品种均较少，难以满足对不同品种纯度及真实性鉴定与遗传多样性研究的需要。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组，利用该SSR标记引物组能够构建出已区分多达60个草莓品种的特征指纹图谱，实现对不同品种草莓的初步区分。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组，包括以下9对SSR标记引物：C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-18所示。
一种SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用。
作为本发明一种优选的实施方案，所述应用包括：提取不同品种草莓的DNA作为模板，利用SSR标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，构建得到不同品种草莓的特征指纹图谱。
作为本发明一种优选的实施方案，所述应用还包括：提取待测品种草莓的DNA作为模板，利用SSR标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，并与构建得到的不同品种草莓的特征指纹图谱进行比较，鉴定待测品种草莓的纯度和真实性。
作为本发明一种优选的实施方案，所述提取草莓的DNA采用CTAB法。
作为本发明一种优选的实施方案，所述PCR扩增的反应体系为：50-100ng/μL草莓DNA 1μL，5U/μL Taq酶0.05μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 0.8μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)1μL，10μmol/L正反引物各0.25μL，水6.65μL。
作为本发明一种优选的实施方案，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，52-59℃退火30秒(可根据不同的引物调整不同的退火温度，如55℃或57℃)，72℃延伸30秒，72℃终延伸10分钟，设置35个循环。
作为本发明一种优选的实施方案，所述分析为：对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后显色，分析带型。
作为本发明一种优选的实施方案，所述电泳采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，跑胶条件为：120V恒定电压1.5小时。
作为本发明一种优选的实施方案，所述SSR标记引物组中引物对C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149对应分别有20、4、3、14、6、10、3、2、9种带型。
发明的有益效果：
本发明提供了一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组，包括以下9对SSR标记引物：C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149。利用该SSR标记引物组能够构建出已区分多达60个草莓品种的特征指纹图谱，实现了对不同品种草莓的初步区分，可用于鉴定草莓品种的纯度及真实性。
本发明还提供了一种利用SSR标记引物组鉴定草莓品种的方法，先构建得到不同品种草莓的特征指纹图谱，利用SSR标记引物组对待测品种草莓的DNA进行PCR扩增，扩增产物经分析后与不同品种草莓的特征指纹图谱进行比较，鉴定待测品种草莓的纯度和真实性。本发明的方法操作简单，扩增条带清晰、多态性好，对设备要求低，检测成本可控，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为试验例中9对SSR标记引物在60份草莓品种中的扩增带型图；
图2为试验例中引物P33在60份草莓品种中的扩增结果；
图3为试验例中引物ZP27在60份草莓品种中的扩增结果；
图4为试验例中引物YS22在60份草莓品种中的扩增结果；
图5为试验例中60份草莓品种的聚类分析树状图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例方案，例如修改、简单替换后得到的实施方案，均属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
本实施例提供的用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组，由9对SSR标记引物组成：C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-18所示。
实施例2
本实施例提供的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用为：
(1)提取不同品种草莓的DNA作为模板，利用实施例1的SSR标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，构建得到不同品种草莓的特征指纹图谱，如表2所示。
(2)提取待测品种草莓的DNA作为模板，利用实施例1的SSR标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，并与构建得到的不同品种草莓的特征指纹图谱进行比较，鉴定待测品种草莓的纯度和真实性。
结果显示，待测品种草莓为樱花。
本实施例中涉及DNA提取、PCR扩增、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等操作均同试验例。
试验例
1、试验材料
60份草莓品种材料均由中国农业科学院郑州果树研究草莓种质改良课题组新乡草莓基地提供，于基地采摘草莓叶片(新鲜嫩叶1cm2左右)后当即放入2mL试管内，置于-80℃液氮中冷冻保存。草莓品种具体名称为：1-哈尼、2-宝交早生、3-晶玉、4-里瓦、5-越心、6-蜜宝、7-荷香、8-红太后、9-牡丹江2号、10-鲁迅公园、11-马刚、12-中莓3号、13-宁玉、14-白雪公主、15-隋珠、16-爱莎、17-淡雪、18-通州公主、19-天使AE雪兔、20-露之水滴、21-粉红公主、22-京留香、23-林果四季、24-星都一号、25-怀柔公主、26-赛娃、27-卡尔特、28-樱花、29-石头河子、30-女峰、31-春蜜、32-sumas、33-星都二号、34-奈良1号、35-日升、36-罗伯逊、37-奈良8、38-盛岗16、39-阿尔宾美国、40-荷兰巨型、41-贺登、42-姆托、43-泰力、44-都佛、45-MDus-4359、46-小桃红、47-因都卡、48-加拿大、49-森加森加拉、50-硕露、51-波波拉特长、52-mohowk、53-剑桥之娇、54-西班牙、55-northeastern、56-意大利②、57-索菲亚、58-日本多倍体、59-都卡、60-康费吐拉。
CTAB提取试剂购自北京索莱宝科技有限公司，Cat#LS0006；PCR扩增试剂购自TaKaRa公司，Code No：R001A。
2、DNA提取
利用CTAB法提取草莓的DNA，DNA提取后加入20-50μL蒸馏水稀释，并用紫外分光光度计测定浓度和纯度，之后将DNA稀释至50-100ng/μL之间，保存于-20℃冰箱中备用。
CTAB提取DNA步骤如下：
(1)取0.1g左右新鲜幼嫩的草莓叶片放入2mL的离心管中(叶片大小约为指甲盖大)，随即在通风口处加入250μL的CTAB提取液，加入钢珠，使用研磨机，设置6个循环，12000r/min研磨5分钟，使叶片得到充分研磨。
(2)研磨充分后加入500μL的CTAB提取液，放入水浴锅中65℃恒温水浴50分钟，每隔10分钟摇晃一次，使试管内容物受热均匀。
(3)水浴之后在通风处加入等体积的氯仿：异戊醇溶液(体积比24：1)，即750μL，上下颠倒摇晃100次使其充分混匀，之后静置2分钟。
(4)12000r/min离心10分钟，取上清液，约400-600μL，不可取到中层沉淀。
(5)加入与上清液等倍体积的异丙醇溶液(需提前遇冷30分钟)，轻轻上下颠倒摇晃，混合均匀后于-20℃放置20分钟。
(6)12000r/min离心5分钟，弃上清液。
(7)加入1mL无水乙醇清洗沉淀数次，静置20分钟自然晾干。
(8)加入20μL蒸馏水溶解DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。
3、SSR引物
设计178对SSR标记引物。
4、PCR扩增
PCR扩增的反应体系(10μL)为：50-100ng/μL草莓DNA 1μL，5U/μL Taq酶0.05μL，2.5mmol/L dNTP Mixture 0.8μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)1μL，10μmol/L正反引物各0.25μL，蒸馏水6.65μL。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，52-59℃退火30秒(可根据不同的引物调整不同的退火温度)，72℃延伸30秒，72℃终延伸10分钟，设置35个循环。
扩增产物保存于4℃冰箱中备用。
5、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
在PCR扩增产物中加入10×Loading Buffer 2.5μL(购自北京宝日医生物技术有限公司)，混匀后保存于4℃冰箱中备用。之后经6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以DNA Marker DL2000作为分子量大小标记。凝胶配置如下(约50mL)：30％胶母液10mL，TEMED促凝剂50μL，10％过硫酸铵150μL，5×TBE 5mL，去离子水35mL。跑胶条件：120V恒定电压1.5小时。跑胶后用0.1％硝酸银溶液银染，显色液(组成为：氢氧化钠固体8g，甲醛溶液4mL，去离子水500mL)显色，拍照记录。
6、SSR标记引物的筛选与结果
SSR标记引物的筛选方法为：选用甘露、华硕、甜查理和红颜4个表型差异较大的草莓品种对178对引物进行初筛，产物经6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，淘汰扩增不出条带，不具多态性或条带不清晰，杂带多的引物对。然后增加都卡、星都一号、胭脂红和加拿大4个草莓品种，共计8个品种进行复筛，产物同样经6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选出多态性高、条带清晰、等位变异位点易区分的9对SSR标记引物(如表1所示)为构建指纹图谱的核心引物，对60个草莓品种进行扩增统计，共检测到71个带型，每对引物检测到带型数2-20个，每对引物平均7.8个，能够初步区分60个草莓品种。
表1 9对SSR标记引物
7、草莓指纹图谱的建立及结果分析
根据9对核心引物的扩增情况，对它们在60个草莓品种中扩增的多态性带型进行总结，构建得到60个草莓品种的特征指纹图谱。将9对核心引物(C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245和8149)分别标记为A-I，对应分别有20、4、3、14、6、10、3、2、9种带型，带型图如图1所示。其中，引物P33、ZP27、YS22的扩增结果如图2-4所示。
从扩增结果可以看出，利用9对核心引物能够区分出60个草莓品种，每对引物都能够将60份品种区分为几个类型，但其中只有个别引物能将个别品种单独区分出，即利用这些引物能够扩增出部分品种的特异性带型。根据扩增及统计结果，60个草莓品种的指纹图谱如表2所示。
表2 60个草莓品种编号和特征指纹代码
根据引物C50的扩增结果可知，有特异性带型的草莓品种为“红太后”、“中莓3号”、“白雪公主”、“淡雪”、“樱花”、“小桃红”、“西班牙”、“northeastern”、“都卡”。另外“哈尼”、“越心”、“蜜宝”、“牡丹江2号”、“京留香”、“林果四季”、“日升”带型相同。“石头河子”、“春蜜”带型相同。“晶玉”、“鲁迅公园”带型相同。“宝交早生”、“隋珠”、“粉红公主”、“姆托”、“都佛”、“意大利②”、“日本多倍体”、“康费吐拉”带型相同。“里瓦”、“宁玉”、“天使AE雪兔”、“星都一号”、“卡尔特”、“sumas”、“星都二号”、“奈良8”、“阿尔宾美国”、“荷兰巨型”、“泰力”带型相同。“荷香”、“怀柔公主”带型相同。“露之水滴”、“赛娃”、“罗伯逊”带型相同。“马刚”、“爱莎”、“女峰”、“盛岗16”带型相同。“通州公主”、“奈良1号”带型相同。“贺登”、“MDus-4359”带型相同。“因都卡”、“加拿大”、“森加森加拉”、“硕露”、“波波拉特长”、“mohowk”、“剑桥之娇”、“索菲亚”带型相同。
根据引物P33的扩增结果可知，草莓品种“日升”、“盛岗16”、“贺登”、“小桃红”、“mohowk”、“剑桥之娇”、“索菲亚”、“都卡”带型相同。“哈尼”、“宝交早生”、“里瓦”、“石头河子”、“女峰”、“罗伯逊”、“奈良8”、“阿尔宾美国”、“姆托”、“都佛”、“MDus-4359”、“森加森加拉”、“硕露”、“西班牙”、“northeastern”、“日本多倍体”、“康费吐拉”带型相同。品种“晶玉”、“越心”、“蜜宝”、“荷香”、“牡丹江2号”、“鲁迅公园”、“马刚”、“中莓3号”、“宁玉”、“爱莎”、“淡雪”、“通州公主”、“露之水滴”、“粉红公主”、“京留香”、“林果四季”、“星都一号”、“卡尔特”、“sumas”、“星都二号”、、“荷兰巨型”、“泰力”、“因都卡”、“加拿大”、“波波拉特长”、“意大利②”带型相同。“红太后”、“白雪公主”、“隋珠”、“天使AE雪兔”、“怀柔公主”、“赛娃”、“樱花”、“春蜜”、“奈良1号”带型相同。
根据引物ZP27的扩增结果可知，有特异性带型的草莓品种为“樱花”。“哈尼”、“宝交早生”、“晶玉”、“里瓦”、“越心”、“蜜宝”、“荷香”、“红太后”、“牡丹江2号”、“鲁迅公园”、“马刚”、“中莓3号”、“宁玉”、“白雪公主”、“隋珠”、“爱莎”、“淡雪”、“通州公主”、“天使AE雪兔”、“露之水滴”、“粉红公主”、“京留香”、“林果四季”、“星都一号”、“怀柔公主”、“赛娃”、“卡尔特”、“春蜜”、“sumas”、“星都二号”、“奈良1号”、“罗伯逊”、“奈良8”、“盛岗16”、“阿尔宾美国”、“荷兰巨型”、“贺登”、“泰力”、“都佛”、“MDus-4359”、“小桃红”、“加拿大”、“硕露”、“波波拉特长”、“剑桥之娇”、“西班牙”、“northeastern”、“索菲亚”、“都卡”带型相同。品种“石头河子”、“女峰”、“日升”、“姆托”、“因都卡”、“森加森加拉”、“mohowk”、、“意大利②”、“日本多倍体”、“康费吐拉”带型相同。
根据引物YS19的扩增结果可知，有特异性带型的草莓品种为“粉红公主”、“樱花”、“荷兰巨型”、“小桃红”、“森加森加拉”、“日本多倍体”。“哈尼”、“宝交早生”、“晶玉”、“里瓦”、“红太后”、“鲁迅公园”、“宁玉”、“白雪公主”、“隋珠”、“淡雪”、“通州公主”、“天使AE雪兔”、“露之水滴”、“林果四季”、“星都一号”、“怀柔公主”、“卡尔特”、“石头河子”、“女峰”、“奈良1号”、“泰力”、“加拿大”、“波波拉特长”、“mohowk”、“northeastern”、“意大利②”、“都卡”、“康费吐拉”带型相同。“越心”、“蜜宝”、“荷香”、“中莓3号”、“爱莎”、“京留香”、“日升”、“贺登”、“MDus-4359”、“剑桥之娇”、“西班牙”、“索菲亚”带型相同。“赛娃”、“星都二号”带型相同。“罗伯逊”、“因都卡”、“硕露”带型相同。品种“牡丹江2号”、“春蜜”、“都佛”带型相同。“马刚”、“盛岗16”带型相同。“sumas”、“阿尔宾美国”带型相同。“奈良8”、“姆托”带型相同。
根据引物FSS143的扩增结果可知，草莓品种“蜜宝”、“天使AE雪兔”、“赛娃”、“樱花”、“石头河子”、“春蜜”、“sumas”、“奈良1号”、“盛岗16”、“姆托”、“都佛”、“小桃红”、“西班牙”、“northeastern”、“都卡”、“康费吐拉”带型相同。“马刚”、“京留香”、“怀柔公主”、“荷兰巨型”、“森加森加拉”带型相同。“哈尼”、“宝交早生”、“晶玉”、“越心”、“荷香”、“红太后”、“牡丹江2号”、“鲁迅公园”、“中莓3号”、“宁玉”、“白雪公主”、“隋珠”、“爱莎”、“淡雪”、“通州公主”、“露之水滴”、“星都一号”、“卡尔特”、“星都二号”、“奈良8”、“阿尔宾美国”、“泰力”、“因都卡”、“加拿大”、“硕露”、“波波拉特长”、、“意大利②”、“索菲亚”、“日本多倍体”带型相同。品种“里瓦”、“日升”、“mohowk”带型相同。品种“粉红公主”、“林果四季”带型相同。品种“女峰”、“罗伯逊”、“贺登”、“MDus-4359”、“剑桥之娇”带型相同。
根据引物YS9的扩增结果可知可知，有特异性带型的草莓品种为“日升”、“荷兰巨型”、“姆托”。“晶玉”、“里瓦”、“越心”、“白雪公主”、“隋珠”、“爱莎”、“淡雪”、“粉红公主”、“京留香”、“樱花”、“星都二号”、“奈良8”、“northeastern”、带型相同。品种“红太后”、“石头河子”、“sumas”、“森加森加拉”、“康费吐拉”带型相同。“哈尼”、“宝交早生”、“蜜宝”、“荷香”、“马刚”、“中莓3号”、“宁玉”、“林果四季”、“星都一号”、“赛娃”、“盛岗16”、“阿尔宾美国”、“贺登”、“MDus-4359”、“小桃红”、“波波拉特长”、“剑桥之娇”、“西班牙”、“意大利②”、“索菲亚”带型相同。“罗伯逊”、“硕露”带型相同。“牡丹江2号”、“鲁迅公园”、“通州公主”、“怀柔公主”、“mohowk”带型相同。“天使AE雪兔”、“露之水滴”、“卡尔特”、“女峰”、“奈良1号”、“都佛”、“因都卡”、“都卡”带型相同。“春蜜”、“泰力”、“加拿大”、“日本多倍体”带型相同。
根据引物YS22的扩增结果可知，草莓品种“宝交早生”、“晶玉”、“里瓦”、“荷香”、“红太后”、“鲁迅公园”、“马刚”、“中莓3号”、“爱莎”、“通州公主”、“露之水滴”、“粉红公主”、“林果四季”、“星都一号”、“赛娃”、“石头河子”、“女峰”、“sumas”、“星都二号”、“日升”、“罗伯逊”、“奈良8”、“盛岗16”、“阿尔宾美国”、“贺登”、“姆托”、“都佛”、“MDus-4359”、“小桃红”、“因都卡”、“加拿大”、“森加森加拉”、“硕露”、“mohowk”、“剑桥之娇”、“意大利②”、“索菲亚”、“日本多倍体”、“康费吐拉”带型相同。“哈尼”、“蜜宝”带型相同。、“越心”、“牡丹江2号”、“宁玉”、“白雪公主”、“隋珠”、“淡雪”、“天使AE雪兔”、“京留香”、“怀柔公主”、“卡尔特”、“樱花”、“春蜜”、“奈良1号”、“荷兰巨型”、“泰力”、“波波拉特长”、“西班牙”、“northeastern”、“都卡”带型相同。
根据引物1245的扩增结果可知，草莓品种“哈尼”、“宝交早生”、“晶玉”、“里瓦”、“越心”、“蜜宝”、“荷香”、“牡丹江2号”、“鲁迅公园”、“马刚”、“中莓3号”、“宁玉”、“白雪公主”、“隋珠”、“爱莎”、“淡雪”、“通州公主”、“天使AE雪兔”、“露之水滴”、“粉红公主”、“京留香”、“林果四季”、“星都一号”、“怀柔公主”、“赛娃”、“卡尔特”、“樱花”、“女峰”、“春蜜”、“sumas”、“星都二号”、“奈良1号”、“日升”、“奈良8”、“盛岗16”、“阿尔宾美国”、“荷兰巨型”、“贺登”、“姆托”、“泰力”、“MDus-4359”、“小桃红”、“因都卡”、“加拿大”、“波波拉特长”、“mohowk”、“剑桥之娇”、“西班牙”、“northeastern”、“意大利②”、“索菲亚”、“日本多倍体”、“都卡”、“康费吐拉”带型相同。品种“红太后”、“石头河子”、“罗伯逊”、“都佛”、“森加森加拉”、“硕露”带型相同。
根据引物8149的扩增结果可知，有特异性带型的草莓品种是“红太后”。、“牡丹江2号”、“粉红公主”、“京留香”、“女峰”、“春蜜”、“sumas”、“都佛”、“森加森加拉”、“硕露”带型相同。品种“日本多倍体”、“康费吐拉”带型相同。“哈尼”、“越心”、“白雪公主”、“通州公主”、“天使AE雪兔”、“露之水滴”、“怀柔公主”、“奈良1号”、“荷兰巨型”、“因都卡”、“西班牙”、“northeastern”、“意大利②”带型相同。“鲁迅公园”、“中莓3号”、“卡尔特”、“星都二号”、“奈良8”、“贺登”、“MDus-4359”、“剑桥之娇”、“索菲亚”、“都卡”带型相同。“宝交早生”、“晶玉”、“蜜宝”、“马刚”、“宁玉”、“林果四季”、“罗伯逊”、“盛岗16”、“阿尔宾美国”、“波波拉特长”、“mohowk”带型相同。“里瓦”、“荷香”、“隋珠”、“爱莎”、“淡雪”、“星都一号”、“樱花”、“泰力”、“加拿大”带型相同。“赛娃”、“日升”、“小桃红”带型相同。“石头河子”、“姆托”带型相同。
8、聚类分析
根据区分出的60份草莓品种的电泳结果进行聚类分析，绘制出60份草莓品种的亲缘关系树状图(如图5所示)。
由图5所示树状图可以看出，在相似系数为0.98时，可将60份草莓品种区分开。60份品种的遗传相似系数在0.66-0.98，多数品种间的相似系数都在0.8以上，说明这60份草莓品种间存在的遗传差异较小。在0.66水平上可分为两大类群，第一类由59份品种组成，第二类只有品种“樱花”，表明“樱花”与其他品种的亲缘关系最远。第一大类在0.78水平上又可分为6个亚类，第一亚类包括33个品种，其中“剑桥之娇”和“索菲亚”，“宁玉”和“波波拉特长”相似度最高，它们的位点谱带在统计时只相差了一个位点；第二亚类只有“荷兰巨型”；第三亚类包括“红太后”、“罗伯逊”、“硕露”；第四亚类包括“里瓦”、“春蜜”、“都佛”、“天使AE雪兔”、“奈良1号”、“northeastern”、“西班牙”、“赛娃”、“sumas”和“都卡”10份品种；第五亚类包括“蜜宝”、“盛岗16”、“小桃红”、“粉红公主”、“林果四季”、“日升”和“mohowk”；第六亚类包括“石头河子”、“康费吐拉”、“姆托”、“森加森加拉”和“日本多倍体”。其中，品种名称相近的“星都一号”和“星都二号”的相似系数高达0.9298，亲缘关系相近；“奈良8”和“奈良1号”虽名称相近，但相似系数为0.7543，并未聚在一起。
9、结论
本发明应用SSR分子标记技术，最终利用9对SSR标记引物能够完全区分60个草莓品种，初步构建了60个草莓品种的特征指纹图谱，为草莓DNA指纹图谱的构建奠定了基础。
综上所述，本发明通过利用SSR分子标记技术，从178对草莓SSR标记引物中筛选出了9对多态性好、条带清晰的引物作为核心引物，采用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳对60个草莓品种进行检测分析，结果显示，9对引物共能够将60个草莓品种全部进行初步区分。利用9对核心引物对60个草莓品种DNA扩增后共检测到71个带型，每对引物检测到带型数2-20个，平均7.8个，并构建出了已区分60个草莓品种的特征指纹图谱，实现了对不同品种草莓的初步区分，可用于鉴定草莓品种的纯度及真实性。
本发明提供的利用SSR标记引物组鉴定草莓品种的方法，先构建得到不同品种草莓的特征指纹图谱，再利用SSR标记引物组对待测品种草莓的DNA进行PCR扩增，扩增产物经分析后，与不同品种草莓的特征指纹图谱进行比较，鉴定出待测品种草莓的纯度和真实性。本发明的方法操作简单，扩增条带清晰、多态性好，对设备要求低，检测成本可控，具有广泛的应用前景。
虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种用于鉴定草莓品种的SSR标记引物组，其特征在于：所述SSR标记引物组由以下9对SSR标记引物组成：C50、P33、ZP27、YS19、FSS143、YS9、YS22、1245、8149，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-18所示。
2.一种如权利要求1所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述应用包括：提取不同品种草莓的DNA作为模板，利用SSR标记引物组进行PCR扩增，对扩增产物进行分析，构建得到不同品种草莓的特征指纹图谱。
4.根据权利要求3所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述提取草莓的DNA采用CTAB法。
5.根据权利要求3所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：50-100ng/μL草莓DNA 1μL，5U/μL Taq酶0.05μL，2.5mmol/L dNTPMixture 0.8μL，10×PCRBuffer 1μL，10μmol/L正反引物各0.25μL，水6.65μL。
6.根据权利要求5所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，52-59℃退火30秒，72℃延伸30秒，72℃终延伸10分钟，设置35个循环。
7.根据权利要求3所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述分析为：对扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色后显色，分析带型。
8.根据权利要求7所述的SSR标记引物组在草莓品种鉴定中的应用，其特征在于：所述电泳采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，跑胶条件为：120V恒定电压1.5小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210811346.4A CN116179736B (zh) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210811346.4A CN116179736B (zh) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116179736A CN116179736A (zh) | 2023-05-30 |
| CN116179736B true CN116179736B (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=86451113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210811346.4A Active CN116179736B (zh) | 2022-07-11 | 2022-07-11 | 用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116179736B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667427A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 |
| KR20150137762A (ko) * | 2014-05-30 | 2015-12-09 | 대한민국(국립종자원장) | 초위성체 마커를 이용한 딸기 품종식별 방법 |
| CN107190089A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-09-22 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法 |
| CN107663548A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 上海市农业科学院 | 草莓杂交种的ssr分子指纹图谱的构建方法及应用 |
-
2022
- 2022-07-11 CN CN202210811346.4A patent/CN116179736B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667427A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 |
| KR20150137762A (ko) * | 2014-05-30 | 2015-12-09 | 대한민국(국립종자원장) | 초위성체 마커를 이용한 딸기 품종식별 방법 |
| CN107663548A (zh) * | 2016-07-29 | 2018-02-06 | 上海市农业科学院 | 草莓杂交种的ssr分子指纹图谱的构建方法及应用 |
| CN107190089A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-09-22 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 利用分子标记对3种草莓品种进行快速鉴别的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Construction of DNA Profile Data Base of Strawberry Cultivars Using Microsatellite Markers;Jee-Hwa Hong等;《Korean Journal of Horticultural Science and Technology》;第32卷(第6期);第853-863页 * |
| Strawberry cultivar identification based on hypervariable SSR markers;Masanori Honjo等;《Breed Sci》;第61卷(第4期);第420-425页 * |
| 草莓EST-SSR引物的开发及四季草莓成花机理的初步研究;杨梦婷;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农药科技辑》(第02期);D048-284 * |
| 草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用;董清华;王西成;赵密珍;宋长年;葛安静;王静;;中国农业科学(17);第3603-3612页 * |
| 草莓抗枯萎病分子标记初定位;史芳芳;《湖北农业科学》;第58卷(第13期);第72-75页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116179736A (zh) | 2023-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113528698B (zh) | 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用 | |
| CN112280881B (zh) | 用于青花菜种质资源和品种鉴定的snp标记组合及应用 | |
| CN112980999B (zh) | 一种果桑品种‘粤椹74’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
| CN113430300B (zh) | 一种果桑品种‘粤椹123’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
| CN112266973B (zh) | 一种与小麦穗发芽抗性相关的snp分子标记及其应用 | |
| KR101011694B1 (ko) | 분자 표지를 이용한 배추 품종 식별 방법 | |
| KR101555972B1 (ko) | 초위성체 마커를 이용한 호박 품종 식별 방법 | |
| CN106591460B (zh) | 一种ssr分子标记鉴定“中茶302”茶树品种的方法及应用 | |
| Pradhan et al. | Development of DNA fingerprinting keys for the identification of radish cultivars | |
| CN105802961A (zh) | 分子标记及其应用 | |
| KR101174409B1 (ko) | 초위성체 마커를 이용한 오이 품종 식별 방법 | |
| CN116179736B (zh) | 用于鉴定草莓品种的ssr标记引物组及其应用 | |
| CN109811085B (zh) | 一种鉴定秋播大白菜珍绿6号种子纯度的引物及应用 | |
| KR101359542B1 (ko) | 복숭아 품종 식별용 초위성체 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| KR101531303B1 (ko) | 초위성체 마커를 이용한 콩 품종 식별 방법 | |
| CN110453007A (zh) | 一种用于红三叶遗传多样性分析的ssr引物组及其应用 | |
| Lee et al. | Analysis of genetic relationships of Ardisia spp. using RAPD markers | |
| KR101444178B1 (ko) | 초위성체 마커를 이용한 고추 품종 식별 방법 | |
| CN108396074B (zh) | 基于白三叶转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用 | |
| Swain et al. | Molecular diversity study on dessert banana genotypes (Musa spp.) from Odisha using ISSR markers | |
| KR101301863B1 (ko) | 초위성체 프라이머 세트를 이용한 상추 품종식별 방법 | |
| Ullah et al. | Geneticalysis of economically important apricot cultivars in gilgit baltistan based on SSR molecular markers | |
| CN114634991B (zh) | 一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用 | |
| CN114438253B (zh) | 用于鉴别马哇椰子的InDel标记及其应用 | |
| CN109811086B (zh) | 一种检测津夏3号大白菜种子纯度的引物及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |