CN114634937A

CN114634937A - 一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用

Info

Publication number: CN114634937A
Application number: CN202210042536.4A
Authority: CN
Inventors: 袁凌云; 吴颖; 汪承刚; 侯金锋; 朱世东; 陈国户; 唐小燕
Original assignee: Anhui Wanjiang Vegetable Industry Technology Research Institute Co ltd; Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Wanjiang Vegetable Industry Technology Research Institute Co ltd; Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114634937B

Abstract

本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，提供了一种促进不结球白菜开花的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种包括上述促进不结球白菜开花的基因的载体与包括上述基因的重组菌。同时，本发明还提供了一种上述促进不结球白菜开花的基因在培育早开花的转基因植株方面的应用。本发明提供的DREB2B基因能够促进不结球白菜植株提早抽薹开花，从而缩短育种周期，为培育早开花不结球白菜品种提供理论依据。

Description

一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用。

背景技术

不结球白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis var.rosularis Tsen)是十字花科芸薹属白菜的一个变种，有着丰富的遗传资源，不同品种的开花时间存在广泛差异。

开花是植物生长发育过程中重要的转折点，也是植物由营养生长向生殖生长转化的重要标志。对于一些不结球白菜晚花品种而言，其花期严重影响其育种周期。在杂交育种过程中，若花期不能相遇，会导致育种失败。

据此，目前急需展开对促进不结球白菜提早开花的研究，从而为培育出早花的不结球白菜品种提供理论依据，而这对缩短不结球白菜的育种周期具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

本发明首先提供一种促进不结球白菜开花的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

作为本发明的优选方式之一，所述基因的克隆步骤如下：提取不结球白菜总RNA并反转录成cDNA；设计特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R；以cDNA为模板进行PCR扩增，得目的基因DREB2B；其中，特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种上述促进不结球白菜开花的基因在培育早开花的转基因植株方面的应用。

本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包括上述促进不结球白菜开花的基因。

作为本发明的优选方式之一，所述重组载体具体为pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC。

作为本发明的优选方式之一，所述重组载体的构建方法如下：将促进不结球白菜开花的基因DREB2B***到载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC的酶切位点，再通过连接酶连接。

作为本发明的优选方式之一，所述载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC的酶切位点是BamHI和XbaI。

本发明还提供一种重组菌，所述重组菌包括上述促进不结球白菜开花的基因。

作为本发明的优选方式之一，所述重组菌的构建方法如下：将促进不结球白菜开花的基因构建的重组载体pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC导入菌体。

本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供的DREB2B基因能够促进不结球白菜植株提早抽薹开花，从而缩短育种周期，为培育早开花不结球白菜品种提供理论依据。

附图说明

图1是实施例4中筛选出的野生型植株与转基因植株在培养皿中的培养状态图(图1a为野生型对照植株，图1b为抗性板上筛选得到的转基因植株)；

图2是实施例4中拟南芥植物的野生型和过表达转基因系中BrDREB2B基因表达量对比图；

图3是实施例4中经低温胁迫试验后正常培养一段时间的野生型植株与转基因植株的生长状态图(图3a为转基因植株，图3b为野生型对照植株)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种促进不结球白菜开花的基因DREB2B：

DREB2B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

DREB2B基因的克隆步骤为：

(1)将不结球白菜品种“WS-1”播种于穴盘中，于玻璃温室正常培养；待到8片真叶，剪取功能叶片，置于液氮速冻，放-80℃保存。

(2)不结球白菜RNA提取及cDNA第1链的合成均采用相应试剂盒(购自现有市场)，按照试剂盒配套的说明书进行操作，并用凝胶电泳进行检测。

(3)DREB2B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据目的基因的序列，使用Oligo7软件设计特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R；引物的设计原则是“长度在18～24bp之间，退火温度50～60℃之间，GC含量40％～60％为宜”，最终获得的特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

(4)以cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增；PCR反应体系(25μL)为：EasyTaq DNA Polymerse 12.5μL，ddH₂O 9.5μL，cDNA 1μL，特异性扩增引物DREB2B-F、DREB2B-R各1μL；PCR仪扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火温度为53.6℃，延伸时间为1min，循环36次。

(5)对所获得的PCR扩增产物进行纯化处理，纯化采用纯化试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，步骤按照说明书进行，最终获得目标所需的目的基因DREB2B片段。

实施例2

本实施例的一种重组载体pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC的构建：

(1)通过CE Design V1.04软件，采用单片段克隆，利用双酶切线性化设计重组引物BamHI F与重组引物XbaI R；所述重组引物BamHI F与重组引物XbaI R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。利用TA克隆菌液作为模板，在重组引物BamHI F与重组引物XbaI R等作用下进行PCR扩增，然后利用回收纯化试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)进行胶回收纯化，琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用核酸定量仪测定胶回收产物浓度。

(2)采用试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)提取表达载体的质粒pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC，实验步骤按说明书进行操作。接着，将提取的质粒进行双酶切，酶切体系如下：10×Quickcut Buffer 5μL，XbaI 2.5μL，BamHI 2.5μL，质粒产物15μL，ddH₂O 25μL。然后，利用试剂盒进行胶回收纯化，琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(3)利用连接试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)将纯化之后的载体质粒pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC与目的基因DREB2B片段连接；连接体系为：DREB2B片段1μL，载体质粒pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC 4μL，2×Basic Assembly Mix/2×Assembly Mix5μL，Final Volume 10μL，50℃热浴30min。

实施例3

本实施例的一种重组菌的构建：

将实施例2的连接产物转入大肠杆菌DH5α中，具体方法为：

提前将感受态细胞置于冰上融化；吸取5μL连接产物和50μL感受态细胞于1.5mL的无菌离心管中，用移液枪轻轻吸打混匀，冰浴30min，然后42℃热激45s，再冰浴2min；最后，加入1mL液体LB培养基于离心管中，放入振荡培养箱37℃，180r/min培养1h；待菌液浑浊后，4000r/min，5min离心；最后，在含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上过夜培养。

实施例4

本实施例的一种DREB2B表达拟南芥株系的构建及低温胁迫试验：

(1)首先，将农杆菌感受态GV3101在冰上融化；吸取5μL重组载体pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC质粒和100μL农杆菌感受态于1.5mL的无菌离心管中，用移液枪轻轻吸打混匀，在冰上静置5min后在液氮速冻5min，然后37℃热浴5min后在冰上静置5min；最后，加入1mL液体LB培养基，置于震荡培养箱28℃，220r/min培养3h；待菌液浑浊后，5000r/min离心3min；弃掉上清液900μL，将剩下的菌液用移液枪轻轻吸打混匀，在超净工作台中用无菌涂布棒均匀涂在固体LB培养基上(含抗生素卡那霉素和利福平)培养48小时，挑取单克隆菌落于液体LB培养基中培养，利用50％的甘油保菌，置于-80℃保存，便于后续实验。

(2)采用花序侵染的方法侵染拟南芥，主要方法为：

首先，将农杆菌菌液复苏，将4mL液体LB培养基、4μL可那霉素、8μL利福平和40μL甘油菌置于10mL离心管中，28℃，220r/min震荡培养箱中培养2d；复苏之后的菌液按照同等体系进行扩繁，利用紫外分光光度计测其OD560值为1～2；然后，配制缓冲液，体系如下：1/2MS(200mL)，5％蔗糖(10g)，Silwet-77(50μL)；将菌液移至50mL离心管中，8000r/min，4℃离心5min，重复至菌液洗完，弃除上清液，菌斑用缓冲液稀释，测其OD₅₆₀值为0.8～1。

将拟南芥花序浸泡在重悬好的菌液中2min，使菌液能够附着在花序上，侵染完后，将拟南芥置于黑暗处避光处理24h，然后放在培养箱中正常培养。

(3)筛选野生型植株与转基因植株，并通过实时荧光定量PCR进行验证。图1为筛选出的野生型植株与转基因植株，图1a为野生型对照植株，图1b为抗性板上筛选得到的转基因植株。图2为拟南芥植物的野生型和过表达转基因系中BrDREB2B基因表达量对比结果。由图2可知：在过表达转基因拟南芥株系中，BrDREB2B基因的转录水平是野生型(WT)的543.58倍，表明转基因拟南芥遗传转化成功，可利用转基因株系进行后续试验。

(4)将上述步骤筛选到的转基因植株与野生型植株在24℃，16h/8h(昼/夜)条件下种植，相对湿度为75％，光强设定为200mmol m^-2s^-1正常培养5周，然后将转基因植株与野生型植株移至6℃下进行低温胁迫试验2周后正常培养，分别统计转基因植株与野生型植株开花的时间，生长状态，种子质量等。在本试验中使用的是拟南芥T3代转基因植株，实验数据重复3次。

试验结果：经低温胁迫后正常培养一段时间的植株生长状态如图3所示(图3a为转基因植株，图3b为野生型对照植株)，我们发现，转基因植株在低温之后可以提早抽薹开花，而野生型的植株则明显的延迟抽薹开花。另外，如表1所示，我们测定了其株高和开花时间，发现低温胁迫之后野生型植株的株高明显低于转基因植株，而开花时间较转基因植株相比，野生型植株明显延迟；同时，通过比较野生型植株与转基因植株的种子质量发现，野生型种子的角果长和千粒重均低于转基因种子。

表1拟南芥成熟期性状

处理	开花时间/d	株高/cm	角果长/cm	千粒重/mg
					野生型	33	28.83±3	1.01±0.15	20±1
转基因	26	33.38±2	1.26±0.12	26±2

综上所述，本实施例提供的促进不结球白菜开花相关的基因能够提高植物在低温春化之后促进转基因植株提早抽薹开花，从而缩短育种周期。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学、安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司

<120> 一种促进不结球白菜开花的基因及其载体、重组菌和应用

<130> 2022

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 945

<212> DNA

<213> 白菜种

<400> 1

atggcagttt atgaccaaac aggaacccat acagtgtcga tatcaaggaa gaggaagtca 60

agagctagag cagacggtac aacagtagcc gatagactaa agaagtggaa agagtacaac 120

gactctgtta atgcttcctc tataaaacaa ggagagaaac cgaaacgtaa acctcccgct 180

aaagggtcga agaaaggctg tatgaaaggc aaaggtggac cggagaactc tcactctagc 240

ttcagaggag ttagacaaag agtttggggt aaatgggttg ctgagatccg tgagcctaat 300

aaagtaagca ggctttggct cggcactttc cctacggccg aagaagctgc ttctgcttat 360

gatgaagctg ctatggctat gtacggtcct ttagctaggc ttaactttcc tcagcagtgt 420

gttggctctg agtctcttac tagtacatca agtcagtctg aggtgtgtag ggatgagaat 480

aaggcggttc ttgatgtgaa gcaagaggat gttgattgta aaactagacc agttagtgag 540

attaaatatg tcaaggaagt atgtggtgat catgcgtata caaggctgaa tgagtttgat 600

gaggagtatt ggagcagact atcgaacggg gtagagaaac cgaaggagga agaagtgata 660

cagccgcagc aggagttaga tatgcttact gttgcggatt atggttggct tagtgatatg 720

caaaacgagc agggtttttg ggatccggat gattcttttg atattgatga actccttcgt 780

gatattgatg taggcctgtt aaccggtcat gatccgtccc aaaaccaaag ccaggtagta 840

caccctggtg gatatgattc acatcctctg cagatggagc cacaagacaa taatcatgag 900

ttattcaact tgagttctct ggatggatct ttgacaaagt tctga 945

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcagttt atgaccaaac ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcagaacttt gtcaaagatc ca 22

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacgatgacg ataagggatc catggcagtt tatgaccaaa cagg 44

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgcctgcagg tcgactctag atcagaactt tgtcaaagat ccatcc 46

Claims

1.一种促进不结球白菜开花的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的促进不结球白菜开花的基因，其特征在于，所述基因的克隆步骤如下：提取不结球白菜总RNA并反转录成cDNA；设计特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R；以cDNA为模板进行PCR扩增，得目的基因DREB2B；其中，特异性扩增引物DREB2B-F和DREB2B-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

3.一种如权利要求1～2任一所述的促进不结球白菜开花的基因在培育早开花的转基因植株方面的应用。

4.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求1～2任一所述的促进不结球白菜开花的基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体具体为pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC的构建方法如下：将促进不结球白菜开花的基因DREB2B***到载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC的酶切位点，再通过连接酶连接。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述载体pCambia1305-35S-nFLAG-cMYC的酶切位点是BamHI和XbaI。

8.一种重组菌，其特征在于，包括如权利要求1～2任一所述的促进不结球白菜开花的基因。

9.根据权利要求8所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法如下：将所述促进不结球白菜开花的基因构建的重组载体pCambia1305-35S-BrDREB2B-nFLAG-cMYC导入菌体。