CN114591952B - 一种组织特异性表达的环状rna分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开属于生物医药技术领域，具体来说，本公开涉及一种组织特异性表达的环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞、组合物、药物制剂及其在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，以及一种预防或治疗疾病的方法。本公开提供的环状RNA分子，将编码区与表达调控元件可操作地连接，实现了目标多肽在靶细胞或靶组织中特异性高表达，在非靶细胞或非靶组织中的低表达，具有高的组织表达特异性，为肿瘤等疾病的临床靶向治疗提供了安全、有效的治疗策略。
Description
技术领域
本公开属于生物医药技术领域，具体来说，本公开涉及一种组织特异性表达的环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞、组合物、药物制剂及其在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，以及一种预防或治疗疾病的方法。
背景技术
随着合成mRNA作为一种新兴的体内蛋白表达工具的出现，mRNA治疗为肿瘤、基因缺陷疾病以及流行病预防等领域的诊疗带来了更多可能性。由于mRNA可以进行体外合成，所以相较于目前的其他生物技术治疗手段，mRNA的合成更加的高效、快速、开放以及成本低廉。但是mRNA在成药方面依然面临着很多技术难题，比如mRNA的稳定性、翻译效率、免疫原性以及递送。随着技术的进步，这些技术障碍正在慢慢消除，比如在线性mRNA的5’端加帽、及3’端增加polyA的尾巴可以显著提高mRNA在体内的半衰期、通过密码子优化可以提高的翻译效率、通过特定核苷酸的修饰可以降低mRNA的免疫原性。已有研究报道，当环状的RNA中含有核糖体内部进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)时，环状RNA可以与核糖体小亚基结合进而启动核糖体翻译，即可以编码蛋白的合成。这种可以编码蛋白合成的环状RNA被称为环状mRNA。环状mRNA由于其首尾相接的特性，RNaseR的不能对其进行有效的切除。所以相较于线性mRNA，环状mRNA有超长的半衰期即更稳定的表达。有研究表明编码相同蛋白的mRNA，环形的形态可以稳定表达48小时以上，而线性的形态只能表达不到20个小时。因此，环状mRNA作为一种新型的mRNA治疗工具，在基因治疗领域有极大的发展前景。特别是在疫苗、肿瘤免疫治疗及蛋白补充等相关领域展现出了巨大的优势。
环状RNA可通过T4连接酶、化学法或者核酶的方法将RNA分子由线状连接形成环状。其中，T4 DNA连接酶(T4 Dnl)、T4 RNA连接酶I(T4 Rnl1)以及T4 RNA连接酶II(T4Rnl2)通过催化线状RNA前体的5’端和3’端形成新的磷酸二酯键连接线状RNA的首尾两端。T4连接酶的方法是最早应用的RNA成环方法，但也易于形成聚体副产物。化学法通过对线性RNA两端的修饰再辅以缩合反应从而形成环形的RNA，但化学法由于需引入某些对环境有害且易爆化学物，例如溴化氰、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐等，故而在治疗性环状mRNA的应用中存在较大的局限性。核酶法是通过利用自然界中存在的一些既能特异识别又能特异切割小分子RNA的核酸内切酶，其本身也是RNA，并且能够以可逆的方式切割底物RNA的磷酸二酯键。由于这种特性，核酶也可以催化线状RNA成环。核酶法对一些长的线状RNA成环更有效，但是这种成环方式非常不稳定，所以还需要进一步的改进。此外，天然的I类内含子***也可以通过发生剪切与连接反应形成环状内含子RNA，被称为“倒置的I类内含子-外显子自剪切***”(Group I permuted intron-exon self-splicing system，PIE***)，这种PIE***已被成功地应用于构建真核蛋白表达的环状RNA。
目前，环状RNA分子在临床疾病治疗中展现出重要的应用价值，然而，受给药方式的限制，环状mRNA在递送于体内后在非病变部分也表现出高丰度的表达(例如，肝脏中通常具有高丰度倾向)，对机体正常组织、器官造成一定损伤。因此，如何实现针对环状RNA分子的组织特异性表达调控，是本领域亟需解决的重要问题。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，例如，环状RNA分子无法实现在不同组织之间的差异性表达，在递送于体内后易在未患病组织中产生高丰度表达，对健康的组织、器官造成损伤的缺陷。为此，本公开提供了一种组织特异性表达的环状RNA分子，将编码区与表达调控元件可操作地连接，实现了目标多肽在靶细胞或靶组织中特异性高表达，在非靶细胞或非靶组织中的低表达，进而实现环状RNA分子的组织特异性表达，为肿瘤等疾病的临床靶向治疗提供了安全、有效的治疗策略。
用于解决问题的方案
(1)一种环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包括编码目标多肽的编码区，和与所述编码区可操作地连接的表达调控元件；所述表达调控元件具有如下(i)-(ii)组成组中任一项所示的特性：
(i)使所述目标多肽在靶细胞或靶组织中的表达增强，
(ii)使所述目标多肽在非靶细胞或非靶组织中的表达减弱。
(2)根据(1)所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包含如(ii)所示的表达调控元件；其中，所述表达调控元件包含一个或多个与miRNA的序列杂交的miRNA识别区；优选地，所述miRNA在所述非靶细胞或非靶组织中的表达水平高于所述miRNA在所述靶细胞或靶组织中的表达水平；更优选地，所述miRNA在非肿瘤细胞或非肿瘤组织中的表达水平高于所述miRNA在肿瘤细胞或肿瘤组织中的表达水平。
(3)根据(1)或(2)所述的环状RNA分子，其中，所述表达调控元件包含与如下一种或多种miRNA的序列杂交的一个或多个的miRNA识别区：
miR-122、miR-152、miR-148、miR-194、miR-199、miR-215、miR-18、miR-20、miR-24、miR-30b、miR-30c、miR-32、miR-141、miR-192、miR-193、miR-194、miR-200b、miR-204、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-24、miR-32、miR-126、miR-133、miR-141、miR-193、miR-200b、miR-213、miR-1、miR-133、miR-143、miR-149、miR-206、miR-208、miR-7、miR-9、miR-124、miR-125、miR-128、miR-132、miR-135、miR-137、miR-139、miR-149、miR-153、miR-183、miR-190、miR-219、miR-16、miR-21、miR-24、miR-27、miR-99a、miR-127、miR-132、miR-142、miR-151、miR-181、miR-189、miR-212、miR-223、miR-17、miR-92；
优选地，所述miRNA识别区包含如下(a1)-(a2)任一项所示的序列：
(a1)如SEQ ID NO：2-66任一序列所示的核苷酸序列；
(a2)与(a1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
可选地，所述表达调控元件包含一个或多个如(a1)或(a2)任一项所示的miRNA识别区；优选地，所述表达调控元件选自如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中***一个或多个如(a1)或(a2)任一项所示的miRNA识别区的序列；优选地，所述表达调控元件的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中***1个、2个或3个如(a1)或(a2)任一项所示的miRNA识别区的序列；更优选的，当所述miRNA识别区的***如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间，或第9位和第10位的核苷酸之间。
(4)根据(1)-(3)任一项所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包含与所述编码区可操作地连接的翻译起始元件，和所述(ii)所示的表达调控元件；可选地，所述翻译起始元件位于所述编码区的上游，所述(ii)所示的表达调控元件位于所述编码区的下游；优选地，所述翻译起始元件为IRES元件；
优选地，所述IRES元件包含如下(iii)-(v)组成的组中的任一项：
(iii)包含如SEQ ID NO：78-81任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列；
(iv)包含如SEQ ID NO：78-81任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(v)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(vi)与(iii)或(iv)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
优选地，所述IRES元件选自如下(b1)-(b7)中的任一项：
(b1)包含如SEQ ID NO：78所示序列的核苷酸序列；
(b2)包含如SEQ ID NO：79所示序列的核苷酸序列；
(b3)包含如SEQ ID NO：80所示序列的核苷酸序列；
(b4)包含如SEQ ID NO：81所示序列的核苷酸序列；
(b5)包含如SEQ ID NO：82所示序列的核苷酸序列；
(b6)包含如SEQ ID NO：83所示序列的核苷酸序列；
(b7)包含如SEQ ID NO：84所示序列的核苷酸序列。
(5)根据(4)所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子、所述(i)所示的表达调控元件。
(6)根据(5)所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述表达调控元件下游的3’间隔区；
优选地，所述5’间隔区包含如下(c1)-(c2)中任一项所示的序列：
(c1)如SEQ ID NO：85-86任一序列所示的核苷酸序列；
(c2)与(c1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
优选地，所述3’间隔区包含如下(d1)-(d2)中任一项所示的序列：
(d1)如SEQ ID NO：87-89任一序列所示的核苷酸序列；
(d2)与(d1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(7)根据(5)所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子；
优选地，所述第二外显子包含如下(e1)-(e2)中任一项所示的序列：
(e1)如SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列；
(e2)与(e1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列；
优选地，所述第一外显子包含如下(f1)-(f2)中任一项所示的序列：
(f1)如SEQ ID NO：90所示的核苷酸序列；
(f2)与(f1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(8)根据(1)-(7)任一项所述的环状RNA分子，其中，所述目标多肽为具有疾病预防或治疗活性的多肽，优选为具有肿瘤预防或治疗活性的多肽；可选地，所述具有肿瘤预防或治疗活性的多肽选自如下的一种或多种：细胞因子、抗原结合片段、免疫检查点抑制剂；
可选地，所述细胞因子选自IL、IFN、TNF、GM-CSF、M-CSF中的一种或多种；
可选地，所述抗原结合片段与如下的一种或多种肿瘤抗原特异性结合：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、AFP、CEA、PSCA、GD2、NKG2D、BCMA、EGFR、Her2、EGFRvⅢ、CD171、FAP、IL13Rα2、VEGFR1、VEGFR2、GPC-3、Mesothelin、claudin 18.2、EpCAM、MUC1、MUC16、EPHA2、EPHA3、CD133、PSMA；
可选地，所述免疫检查点抑制剂为如下一种或多种免疫检查点蛋白抑制剂：PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
(9)根据(1)-(7)任一项所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包含如下(g1)-(g2)中任一项所示的序列：
(g1)如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：76-77所示的核苷酸序列；
(g2)与(g1)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(10)一种环化前体RNA分子，其中，所述环化前体RNA分子环化形成根据(1)-(9)任一项所述的环状RNA分子；
可选地，所述环化前体RNA分子包含如下的一种或多种元件：
5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、翻译起始元件、表达调控元件、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。
(11)一种重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子转录形成根据(10)所述的环化前体RNA分子。
(12)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据(11)所述的重组核酸分子。
(13)一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据(1)-(9)任一项所述的环状RNA分子，根据(10)所述的环化前体RNA分子，根据(11)所述的重组核酸分子，或根据(12)所述的重组表达载体。
(14)一种药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂或组合物包括根据(1)-(9)任一项所述的环状RNA分子，根据(10)所述的环化前体RNA分子，根据(11)所述的重组核酸分子，根据(12)所述的重组表达载体，或根据(13)所述的重组宿主细胞；可选地，所述药物制剂或组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体；优选地，所述药学上可接受的载体为包裹所述环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、或重组宿主细胞的脂质体材料。
(15)根据(14)所述的药物制剂或组合物，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、丸剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、口服溶液、吸入剂、混悬剂或干悬剂；
优选地，所述药物制剂为注射剂；
优选地，所述药物制剂为向肿瘤的瘤内递送的药物制剂。
(16)根据(1)-(9)任一项所述的环状RNA分子，根据(10)所述的环化前体RNA分子，根据(11)所述的重组核酸分子，根据(12)所述的重组表达载体，根据(13)所述的重组宿主细胞，或根据(14)-(15)任一项所述的组合物或药物制剂在制备预防或治疗疾病的药物中的应用；
优选为制备预防或***的药物中的应用，更优选为制备预防或***的瘤内注射剂中的应用。
(17)一种预防或治疗疾病的方法，其中，包括向受试者施用根据(1)-(9)任一项所述的环状RNA分子，根据(10)所述的环化前体RNA分子，根据(11)所述的重组核酸分子，根据(12)所述的重组表达载体，根据(13)所述的重组宿主细胞，根据(14)-(15)任一项所述的组合物或药物制剂；
可选地，所述施用选自口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤瘤内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或***性施用；优选为肿瘤瘤内注射。
发明的效果
在一些实施方式中，本公开提供的环状RNA分子，通过将编码区与表达调控元件可操作地连接，实现了目标多肽在靶细胞或靶组织中特异性高表达，在非靶细胞或非靶组织中的低表达，进而实现环状RNA分子的组织特异性表达，有效提高了环状RNA分子的靶向表达和治疗效果，在临床疾病治疗中具有广阔的应用前景。
在一些实施方式中，本公开提供的环状RNA分子，通过引入一个或多个miRNA识别区，实现了环状RNA分子的组织特异性表达。本公开首次证实了在引入miRNA识别区后，在不影响环状RNA分子的成环反应效率的条件下，可有效抑制环状mRNA的表达。本公开的环状RNA分子可实现对靶细胞或靶组织(例如，肿瘤细胞或肿瘤组织)中的高表达，而在非靶细胞或非靶组织(例如，健康组织或健康组织细胞)中表达抑制，从而减小由于环状RNA分子在健康组织中表达可能导致的不良反应和副作用。
在一些实施方式中，本公开提供的环状RNA分子，包裹于脂质体材料内被递送于体内，能够在特定组织器官内特异性表达，而在其他组织无表达或极低表达，有效解决了目前LNP递送mRNA分子时存在的易在肝脏细胞中高丰度表达、造成强烈肝脏毒性的问题，为肿瘤等疾病的临床靶向治疗提供了安全、有效的治疗策略。
在一些实施方式中，本公开提供的环状RNA分子，包裹于脂质体材料内被递送于肿瘤的瘤体内，环状RNA分子可以在肿瘤组织内靶向表达具有治疗效果的目标多肽，而在肝脏等其他正常组织器官极低表达或不表达，从而做到肿瘤靶向。进一步的，环状RNA分子，包裹于脂质体材料内，适合作为肿瘤瘤内注射的注射剂，能够在瘤内局部高表达细胞因子、抗原结合片段、免疫检查点抑制剂等治疗性多肽，而在肝脏细胞、组织等健康细胞、组织中低水平表达或不表达，具有高的肿瘤靶向性和低的毒副作用，是一种极具应用潜力的肿瘤免疫治疗分子。
附图说明
图1示出了质粒模板DNA，及由质粒模板DNA转录得到的环化前体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图中1：pUC-EV29-LUC线性化质粒模板DNA，2：pUC-EV29-LUC环化前体RNA，3：pUC-EV29-LUC-3’UTR线性化质粒模板DNA，4：pUC-EV29-LUC-3’UTR环化前体RNA，5：pUC-EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122线性化质粒模板DNA，6：pUC-EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA。
图2示出了环化前体RNA，及由环化前体RNA环化得到的环状RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；图中1：EV29-LUC环化前体RNA，2：EV29-LUC环状RNA，3：EV29-LUC-3’UTR环化前体RNA，4：EV29-LUC-3’UTR环状RNA，5：EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA，6：EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环状RNA。
图3示出了EV29-LUC环状RNA、EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA在细胞中的表达Luciferase蛋白的含量检测结果。
图4示出了EV29-LUC环状RNA、EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122环化前体RNA在细胞中的表达Luciferase蛋白的含量检测结果。
图5示出了环状RNA分子介导的Luciferase蛋白在小鼠特定部位的表达检测结果，其中，A-C依次代表EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122介导的Luciferase蛋白表达情况。
图6示出了环状RNA分子介导的Luciferase蛋白在小鼠肿瘤原位及肝脏的表达检测结果，其中，A-C依次代表EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122介导的Luciferase蛋白在小鼠肿瘤原位的表达检测结果，D-F依次代表EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122介导的Luciferase蛋白在小鼠肝脏的表达检测结果。
图7示出了环状RNA分子介导的Luciferase蛋白在小鼠肿瘤原位及肝脏的表达的定量检测结果。其中，图A代表EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122介导的Luciferase蛋白在小鼠肿瘤原位表达的定量检测结果，图B代表EV29-LUC-3’UTR环状RNA、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122环化前体RNA、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122介导的Luciferase蛋白在小鼠肝脏表达的定量检测结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
如本公开所使用的，“miRNA”是是一种小的单链分子非编码RNA，一般是由大约22个核苷酸序列构成，广泛的存在于植物、动物以及一些病毒当中。microRNA主要是通过RNA的沉默对基因进行转录后调控，由于miRNAs是通过与mRNA碱基的互补配对来发挥作用，所以靶标mRNA分子会通过以下几种方式被沉默：1)将mRNA剪切成两段不同的序列；2)通过缩短mRNA的polyA的尾巴降低mRNA的稳定性；3)降低mRNA与核糖体的结合进而降低mRNA的翻译。
miRNA在哺乳动物细胞中广泛存在，并且在不同的组织间存在不同的miRNA的高丰度表达，比如miR-122在肝脏细胞中上调表达，miR-133、miR-206、miR-208在肌肉细胞中的上调表达，miR-17-92、miR-126在内皮细胞中的上调表达，miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27等在髓细胞中的上调表达，let-7、miR-30c在脂肪细胞中的上调表达，miR-ld、miR-149在心脏细胞中的上调表达，miR-192,miR-194,miR-204在肾脏细胞中的上调表达，以及let-7，miR-133，miR-126在肺上皮细胞中的上调表达。
如本公开所使用的，术语“环状RNA”是一种呈封闭环形RNA分子。在一些实施方式中，本公开中的环状RNA分子由线状RNA分子的上游的5’端与下游的3’端连接形成环状。在一些实施方式中，本公开中的环状RNA分子由线状RNA分子的上游的5’端与下游的3’端连接形成环状。本公开中的环状RNA分子由环化前体RNA分子通过剪切和环化反应形成环状。
如本公开所使用的，术语“环化前体RNA分子”是指能够环化形成环状RNA的RNA前体，其一般由环化前体的DNA分子转录形成。在本公开中，“环化前体RNA分子”与“线状RNA分子”可互换的使用。在一些实施方案中，环化前体RNA中包括如下元件：5’同源臂、3’内含子、第二外显子E2、间隔区、IRES元件、编码区、间隔区、第一外显子E1、5’内含子、3’同源臂。在一些实施方案中，5’同源臂、3’内含子、5’内含子、3’同源臂在环化前体RNA剪切形成环状RNA的过程中发挥作用。其中，内含子具有核酶特性，例如，利用5’内含子的核酶特性，使5’内含子与第一外显子E1的连接处在GTP引发下断裂，断裂位点又可以进一步引发3’内含子与第二外显子E2的连接处断裂，第二外显子E2与第一外显子E1连接形成环状RNA。
如本公开所使用的，术语“IRES”(Internal ribosome entry site，IRES)又称内部核糖体进入位点，“内部核糖体进入位点”(IRES)属于翻译控制序列，通常位于所关注基因的5’端，并使得以帽非依赖性方式翻译RNA。经转录的IRES可直接结合核糖体亚单位，以使得mRNA起始密码子在核糖体中适当地取向以进行翻译。IRES序列通常位于mRNA的5’UTR中(起始密码子的正上游)。IRES在功能上取代对各种与真核生物翻译机制相互作用的蛋白因子的需求。
如本公开所使用的，术语“编码区”(Coding Region)是指能够转录信使RNA，并最终翻译为目标多肽、蛋白的基因序列。
如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
如本公开所使用的，术语“上游”或“下游”是指沿编码区的蛋白翻译方向的上游及下游。
如本公开所使用的，术语“互补的”或“杂交的”用于指与碱基配对规则相关的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(它们是可互换的术语，指的是核苷酸序列)。例如，序列“CAGT”与序列“GTCA”互补。互补或杂交可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补或杂交是指一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则错配，核酸之间的“全部”或“完全”互补或杂交是指每个核酸碱基在碱基配对下均与另一个碱基匹配规则。核酸链之间的互补或杂交程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中特别重要。
如本公开所使用的，术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸***或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸的“序列同一性”或“同一性百分比”。在某些实施方式中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(例如，多核苷酸)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。
如本公开所使用的，术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。
如本公开所使用的，术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如病毒质粒、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如慢病毒、逆转录病毒、牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
如本公开所使用的，术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞***，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。术语“重组宿主细胞”涵盖导入环状RNA分子、环化前体RNA、分子重组核酸分子或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。本公开的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本公开的环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子或重组表达载体的细胞即可。
如本公开所使用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
如本公开所使用的，术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
如本公开所使用的，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的赋形剂、组合物和/或剂型。
如本公开所使用的，术语“靶细胞”是指期望外源分子(例如，环状RNA分子)被递送到，并且外源分子在细胞中特异性高表达或特异性低表达的细胞类型。靶细胞可以是离体细胞，或包含在受试者体内的细胞。在一些实施方式中，靶细胞为发生病变的细胞，例如，肿瘤细胞。
如本公开所使用的，术语“靶组织”为包含靶细胞的组织。在一些实施方式中，靶组织为发生病变的组织，例如，肿瘤组织。
如本公开所使用的，术语“非靶细胞”是指不期望外源分子(例如，环状RNA分子)被递送到，或者外源分子在其中的表达与在靶细胞中的表达呈相反趋势的细胞类型。在一些实施方式中，非靶细胞是未病变细胞，例如正常组织细胞。
如本公开所使用的，术语“非靶组织”为不包含靶细胞的组织。在一些实施方式中，非靶组织为未发生病变的组织，例如，各类健康组织。
技术方案
在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
SEQ ID NO.1所示的序列为3'UTR Control的核苷酸序列
SEQ ID NO.2所示的序列为miR-122识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.3所示的序列为miR-152识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.4所示的序列为miR-148识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.5所示的序列为miR-194识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.6所示的序列为miR-199识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.7所示的序列为miR-215识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.8所示的序列为miR-18识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.9所示的序列为miR-20识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.10所示的序列为miR-24识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.11所示的序列为miR-30b识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.12所示的序列为miR-30c识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.13所示的序列为miR-32识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.14所示的序列为miR-141识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.15所示的序列为miR-192识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.16所示的序列为miR-193识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.17所示的序列为miR-194识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.18所示的序列为miR-200b识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.19所示的序列为miR-204识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.20所示的序列为miR-18识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.21所示的序列为miR-19a识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.22所示的序列为miR-20识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.23所示的序列为miR-24识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.24所示的序列为miR-32识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.25所示的序列为miR-126识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.26所示的序列为miR-133识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.27所示的序列为miR-141识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.28所示的序列为miR-193识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.29所示的序列为miR-200b识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.30所示的序列为miR-213识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.31所示的序列为miR-1识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.32所示的序列为miR-133识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.33所示的序列为miR-143识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.34所示的序列为miR-149识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.35所示的序列为miR-206识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.36所示的序列为miR-208识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.37所示的序列为miR-7识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.38所示的序列为miR-9识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.39所示的序列为miR-124识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.40所示的序列为miR-125识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.41所示的序列为miR-128识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.42所示的序列为miR-132识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.43所示的序列为miR-135识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.44所示的序列为miR-137识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.45所示的序列为miR-139识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.46所示的序列为miR-149识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.47所示的序列为miR-153识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.48所示的序列为miR-183识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.49所示的序列为miR-190识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.50所示的序列为miR-219识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.51所示的序列为miR-16识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.52所示的序列为miR-21识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.53所示的序列为miR-24识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.54所示的序列为miR-27识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.55所示的序列为miR-99a识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.56所示的序列为miR-127识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.57所示的序列为miR-132识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.58所示的序列为miR-142识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.59所示的序列为miR-151识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.60所示的序列为miR-181识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.61所示的序列为miR-189识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.62所示的序列为miR-212识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.63所示的序列为miR-223识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.64所示的序列为miR-17识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.65所示的序列为miR-92识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.66所示的序列为miR-126识别区的核苷酸序列
SEQ ID NO.67所示的序列为3'UTR 1x miRNA-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.68所示的序列为3'UTR 3x miRNA-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.69所示的序列为EV29-LUC-3UTR的核苷酸序列
SEQ ID NO.70所示的序列为EV29-LUC-3UTR+1xmiR-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.71所示的序列为EV29-LUC-3UTR+3xmiR-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.72所示的序列为EV29-IL-2-3UTR的核苷酸序列
SEQ ID NO.73所示的序列为EV29-IL-2-3UTR+3xmiR-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.74所示的序列为EV29-CTLA-4(HC)-3UTR的核苷酸序列
SEQ ID NO.75所示的序列为EV29-CTLA-4(LC)-3UTR的核苷酸序列
SEQ ID NO.76所示的序列为EV29-CTLA-4(HC)-3UTR+3xmiR-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.77所示的序列为EV29-CTLA-4(LC)-3UTR+3xmiR-122的核苷酸序列
SEQ ID NO.78所示的序列为CVB3 IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.79所示的序列为EV24 IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.80所示的序列为EV29 IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.81所示的序列为EV33 IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.82所示的序列为EV24与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.83所示的序列为EV29与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.84所示的序列为EV33与CVB3嵌合IRES的核苷酸序列
SEQ ID NO.85所示的序列为5’间隔区序列1的核苷酸序列
SEQ ID NO.86所示的序列为5’间隔区序列2的核苷酸序列
SEQ ID NO.87所示的序列为3’间隔区序列1的核苷酸序列
SEQ ID NO.88所示的序列为3’间隔区序列2的核苷酸序列
SEQ ID NO.89所示的序列为3’间隔区序列3的核苷酸序列
SEQ ID NO.90所示的序列为I类PIE***的外显子原件1(E1)的核苷酸序列
SEQ ID NO.91所示的序列为I类PIE***的外显子元件2(E2)的核苷酸序列
SEQ ID NO.92所示的序列为I类PIE***的5’内含子的核苷酸序列
SEQ ID NO.93所示的序列为I类PIE***的3’内含子的核苷酸序列
SEQ ID NO.94所示的序列为5’同源臂序列1(H1)的核苷酸序列
SEQ ID NO.95所示的序列为5’同源臂序列2(H2)的核苷酸序列
SEQ ID NO.96所示的序列为3’同源臂序列1的核苷酸序列
SEQ ID NO.97所示的序列为3’同源臂序列2的核苷酸序列
环状RNA分子
本公开提供的环状RNA分子包括编码目标多肽的编码区，和与所述编码区可操作地连接的表达调控元件；所述表达调控元件具有如下(i)-(ii)组成组中任一项所示的特性：(i)使所述目标多肽在靶细胞或靶组织中的表达增强，(ii)使所述目标多肽在非靶细胞或非靶组织中的表达减弱。利用表达调控元件对环状RNA分子表达目标多肽的水平进行调节，使环状RNA分子在靶细胞、靶组织中特异性高表达，在非靶细胞、非靶组织中特异性低表达，从而实现对环状RNA分子在不同细胞、组织之间的差异性表达，为疾病相关细胞、组织中靶向药物递送提供了一种安全、有效的治疗手段。
在一些实施方式中，环状RNA分子中的表达调控元件使目标多肽在非靶细胞或非靶组织中的表达减弱。其中，表达调控元件包含一个或多个与miRNA序列杂交的miRNA识别区。本公开首次发现了在环状RNA分子中添加miRNA识别区，在不影响环状RNA成环效率的情况下，可以特异性降低环状RNA分子在非靶细胞或非靶组织中的蛋白表达水平，首次证实了miRNA能够用于调控环状RNA分子的蛋白翻译和表达水平。
在本公开中，miRNA识别区与miRNA的序列杂交，也即miRNA识别区具有miRNA序列的反向互补序列。在一些实施方式中，miRNA识别区的序列与miRNA的序列完全互补。在另外一些实施方式中，miRNA识别区的序列与miRNA的序列为部分互补，也即，在miRNA识别区序列与miRNA序列之间允许存在一个或多个的错配或未配对碱基。具体而言，只要miRNA识别区能够与miRNA结合，使环状RNA分子表达目标多肽的水平被抑制即可。
在本公开中，表达调控元件中包含的miRNA识别区的为一个或多个，示例性的，表达调控元件中包含1、2、3、4、5、6、7等等的miRNA识别区。进一步的，当miRNA识别区的个数为两个及以上时，每个miRNA识别区的序列与其他miRNA识别区的序列可以相同或不同，也即，表达调控元件中可以包含结合同一种miRNA的多个miRNA识别区，也结合包含结合不同种类的miRNA的多个miRNA识别区；并且，对于结合同一种的miRNA识别区的数量也可以是1个或是多个。
在一些优选的实施方式中，与miRNA识别区相杂交的miRNA在所述非靶细胞或非靶组织中的表达水平高于所述miRNA在所述靶细胞或靶组织中的表达水平。利用miRNA在不同细胞、组织之间的差异性表达，从而阻止或减少环状RNA分子在非靶细胞或非靶组织中的表达，但维持环状RNA分子在靶细胞和靶组织中的正常表达。当环状RNA分子在施用于受试者体内时，其表达呈现显著的组织特异性，利用环状RNA分子的组织特异性表达，从而实现针对特定组织、细胞的靶向蛋白表达和药物递送，并且不使非目标的细胞、器官、组织内表达目标蛋白，有效提高药物递送的靶向性和安全性。
在一些优选的实施方式中，靶细胞或靶组织为患病的细胞或组织，非靶细胞或非靶组织为未患病的细胞或组织。环状RNA分子在非靶细胞或靶组织中的表达被抑制，避免由于目标多肽在健康细胞或组织中的表达导致的器官、组织损伤，具有较高的临床安全性。在一些更为优选的实施方式中，靶细胞或靶组织为肿瘤细胞或肿瘤组织，miRNA在非肿瘤细胞或非肿瘤组织中的表达水平高于所述miRNA在肿瘤细胞或肿瘤组织中的表达水平，在维持环状RNA分子在肿瘤细胞或肿瘤组织中高表达水平的同时，环状RNA分子在健康细胞或组织中的表达被抑制或消除，提高了环状RNA分子向肿瘤细胞、组织递送目标多肽的特异性，在实现针对肿瘤等疾病的治疗的同时，有效减少不良反应和对健康组织、器官的损伤，对于肿瘤等疾病的治疗具有重要的临床应用价值。
在一些实施方式中，表达调控元件中仅包含与miRNA序列杂交的miRNA识别区。在另外一些实施方式中，表达调控元件中还可以包含其他的核苷酸序列，例如UTR序列等。当表达调控元件中包含其他的核苷酸序列时，miRNA识别区可以位于表达调控元件的内部、5’端或3’端。示例性的，miRNA识别区是位于3'UTR序列内部的1个、2个、3个等等的与miRNA序列反向互补的序列区。进一步的，miRNA识别区的个数为2个及以上时，任意2个miRNA识别区可以是直接相连，也可以是间隔***3'UTR序列内。
在一些实施方式中，表达调控元件包含与如下一种或多种miRNA的序列杂交的一个或多个的miRNA识别区：
miR-122、miR-152、miR-148、miR-194、miR-199、miR-215、miR-18、miR-20、miR-24、miR-30b、miR-30c、miR-32、miR-141、miR-192、miR-193、miR-194、miR-200b、miR-204、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-24、miR-32、miR-126、miR-133、miR-141、miR-193、miR-200b、miR-213、miR-1、miR-133、miR-143、miR-149、miR-206、miR-208、miR-7、miR-9、miR-124、miR-125、miR-128、miR-132、miR-135、miR-137、miR-139、miR-149、miR-153、miR-183、miR-190、miR-219、miR-16、miR-21、miR-24、miR-27、miR-99a、miR-127、miR-132、miR-142、miR-151、miR-181、miR-189、miR-212、miR-223、miR-17、miR-92；
在一些实施方式中，本公开提供的miRNA识别区选自如下(a1)-(a2)的任一项：
(a1)核苷酸序列为如SEQ ID NO：2-66任一序列所示的序列，
(a2)核苷酸序列为与SEQ ID NO：2-66任一项所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，且能够结合miRNA调控目标多肽的表达的序列。
在一些实施方式中，本公开提供的表达调控元件包含一个或多个(a1)或(a2)所示的miRNA识别区。示例性的，表达调控元件中包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等等的(a1)或(a2)(a1)或(a2)所示的miRNA识别区。
上述表达调控元件中的miRNA识别区能够与肝脏细胞/组织、肾脏细胞/组织、肺部细胞/组织、心肌细胞/组织、神经细胞/组织、人造血干细胞/组织、内皮细胞/组织中高丰度表达的miRNA相结合，使环状RNA分子在健康细胞、组织中的表达被抑制，避免造成对未患病器官、组织的损伤。与此同时，患病细胞、组织(例如，肿瘤细胞或肿瘤组织)中相关miRNA的表达丰度相对低，不影响环状RNA分子在肿瘤细胞、组织中高效表达目标多肽，实现对肿瘤等疾病的治疗。
在一些优选的实施方式中，表达调控元件的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中***1个或多个如(a1)或(a2)所示的miRNA识别区。示例性的，表达调控元件的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中***1个、2个、3个、4个等等的如(a1)或(a2)所示的miRNA识别区。miRNA识别区的***数量和***位置可依据实际需要决定。
在一些具体的实施方式中，miRNA识别区的***个数为1个，其***的位置为SEQID NO：1所示核苷酸序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间，或第9位和第10位的核苷酸之间。在另外一些具体的实施方式中，miRNA识别区的***个数为3个，在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间，以及第9位和第10位的核苷酸之间同时***miRNA识别区，得到目标的表达调控元件。在一些更为具体的实施方式中，在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间，以及第9位和第10位的核苷酸之间同时***miRNA识别区，与同一种miRNA杂交。
示例性的，本公开以包含miR-122识别区的表达调控元件进行解释，当表达调控元件中包含SEQ ID NO.2所示序列的miR-122识别区时，表达调控元件的序列可以为如下的任意一种：
1)通过在SEQ ID NO：1所示序列的第88和第89位的核苷酸之间***一个SEQ IDNO.2序列，得到SEQ ID NO.67所示的核苷酸序列；
2)通过在SEQ ID NO：1所示序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间，以及第9位和第10位的核苷酸之间各***一个SEQ ID NO.2序列，得到SEQ IDNO.68所示的核苷酸序列。
对于包含SEQ ID NO：3-66所示序列的miRNA识别区的表达调控元件，其表达调控元件可通过上述1)或2)任一种的方式得到，本公开对此不进行一一示例。
在一些实施方式中，表达调控元件包含如SEQ ID NO：2-68任一项所示的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性，且能够实现miRNA识别区与miRNA杂交的序列。
细胞内miRNA的产生一般具有如下过程：pri-miRNA在核内由Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs(pre-miRNAs)，这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs。本领域公认的成熟miRNA命名法通常涵盖以下内容：
1)指定成熟的miRNA所来源的pre-miRNA的臂，“5p”意味着miRNA来自pre-miRNA发夹的5’臂，并且“3p”意味着miRNA来自pre-miRNA发夹的3’臂。本公开除非由3p或5p名称特别指定，否则通过数字提及的miR可指源自同一pre-miRNA的相对臂的两种miRNA中的任一种(例如，miR-122代表为miR-122-5p、miR-122-3p中的任意一种或两种的组合)。
2)miRNA几乎全是独一的编码顺序，但对于拥有数个碱基不同的则会被标上字母以示，例如，miR-124a与miR-124b。本公开除非由a、b、c等名称特别指定，否则通过数字提及的miR可指具有高度同源的几种miRNA中的任一种。
3)若成熟的miRNA相同，但pre-miRNA和pri-miRNA和编码他们的基因来自于不同的基因组，则使用数字来表示，例如，miR-194-1和miR-194-2表示两个pre-，pri-miRNA剪切后的成熟miRNA是完全相同的，但却是两个不同的来源。
在一些具体的实施方式中，如(ii)所示的使所述目标多肽在非靶细胞或非靶组织中的表达减弱的表达调控元件连接于编码区的下游。
在一些实施方式中，环状RNA分子还包括与编码区可操作地连接的翻译起始元件。在本公开中，翻译起始元件可以是能够招募核糖体，起始环状RNA分子的翻译过程的任意的序列元件。示例性的，翻译起始元件为IRES元件、m6A修饰序列，或滚环翻译的起始序列等等。
在一些具体的实施方式中，翻译起始元件为IRES元件，IRES元件连接于编码区的上游，能够有效起始编码区翻译表达目标多肽。
在一些优选地实施方式中，IRES序列包含如SEQ ID NO：78-81任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IRES序列为SEQ ID NO：78所示核苷酸序列的CVB3 IRES、SEQ ID NO：79所示核苷酸序列的EV24 IRES、SEQ ID NO：80所示核苷酸序列的EV29 IRES、SEQ ID NO：81所示核苷酸序列的EV33 IRES。在一些实施方案中，IRES序列包含CVB3v IRES与EV24 IRES、EV29 IRES和EV33 IRES中任意一种的嵌合体序列。在一些实施方式中，IRES序列包含CVB3v与EV24 IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：82所示。在一些实施方式中，IRES序列包含CVB3v与EV29IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：83所示。在一些实施方式中，IRES序列包含CVB3v与EV33 IRES的嵌合体序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：84所示。本公开的IRES序列能够实现目标多肽在靶细胞、靶组织的高效、持久表达，提高环状RNA分子在靶细胞、靶组织中表达目标多肽的效率。
在一些实施方式中，环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子、所述(i)所示的表达调控元件。通过设置其他的一种或多种的表达元件，可以通过多种环化方式得到环状RNA分子，并进一步提高环状RNA分子表达目标多肽的组织特异性和表达效率。
在一些实施方式中，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述表达调控元件下游的3’间隔区。在一些优选地实施方式中，5’间隔区序列为与SEQ ID NO：85-86任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些优选地实施方式中，3’间隔区序列为与SEQ ID NO：87-89任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子。在一些优选地实施方式中，第二外显子序列为与SEQID NO：91所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。在一些优选地实施方式中，第一外显子序列为与SEQ ID NO：90所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些实施方式中，环状RNA分子还包括如(i)所示的使所述目标多肽在靶细胞或靶组织中的表达增强的表达调控元件，示例性的，表达调控元件为具有组织特异性的启动子、用于提高编码区的翻译水平的kozak序列等等。
在一些优选地实施方式中，环状RNA分子包含顺次连接的如下所示元件：第二外显子、5’间隔区、IRES元件、编码区、表达调控元件、3’间隔区和第一外显子。
本公开中通过选择的5’间隔区、3’间隔区、表达调控元件、IRES元件、第二外显子以及第一外显子，能够实现环状RNA分子在靶组织、靶细胞的特异性高表达，而在非靶细胞、非靶组织内的特异性低表达，为肿瘤等疾病的临床治疗提供了一种安全、有效的治疗策略。
在一些实施方式中，环状RNA分子编码的目标多肽为具有疾病预防或治疗活性的多肽。环状RNA分子可在患病的组织、细胞中特异性表达目标多肽，实现对疾病的针对性治疗，并降低由于目标多肽在健康细胞、组织中表达可能造成的毒副作用。
在一些优选的实施方式中，目标多肽为具有肿瘤预防或治疗活性的多肽，在本公开中，具有肿瘤免疫治疗活性的多肽，可以是具有肿瘤免疫治疗活性的任意类型的多肽，本公开对具有肿瘤免疫治疗活性的多肽的序列不进行具体限定。
在一些实施方式中，具有肿瘤免疫治疗活性的多肽为细胞因子。示例性的，细胞因子包括但不限于白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。环状RNA分子通过在肿瘤细胞、肿瘤组织中特异性表达细胞因子，使细胞因子富集于肿瘤组织内，更有利于激发机体抗肿瘤的免疫反应，有效杀伤肿瘤细胞，并且避免细胞分子在健康组织、器官中的高表达，降低不良反应的发生概率。
在一些实施方式中，具有肿瘤免疫治疗活性的多肽为抗原结合片段。更具体的，具有肿瘤免疫治疗活性的多肽为与肿瘤抗原特异性结合的抗原结合片段。示例性的，肿瘤抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、AFP、CEA、PSCA、GD2、NKG2D、BCMA、EGFR、Her2、EGFRvⅢ、CD171、FAP、IL13Rα2、VEGFR1、VEGFR2、GPC-3、Mesothelin、claudin 18.2、EpCAM、MUC1、MUC16、EPHA2、EPHA3、CD133、PSMA。环状RNA分子通过在肿瘤细胞、肿瘤组织中特异性表达与肿瘤抗原特异性结合的抗原结合片段，从而阻断肿瘤生长因子信号通路，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。
在本公开中，抗原结合片段包括与肿瘤抗原特异性结合的抗体，或是包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。
进一步的，抗原结合片段包括涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体(例如，scFv)、完整抗体、Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；线性抗体；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些实施方式中，环状RNA分子包含如SEQ ID NO：73所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：73所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。SEQ ID NO：73所示的环状RNA分子的编码区表达细胞因子IL-2，其表达调控元件包含3个miR-122识别区；与未设置表达调控元件的环状RNA分子相比，SEQ ID NO：xx所示的环状RNA分子在肝脏细胞中表达IL-2的含量显著降低，而在肿瘤细胞中IL-2的表达含量未发生明显变化；而两种环状RNA分子在递送于肿瘤模型小鼠体内后，SEQ ID NO：73所示的环状RNA分子在瘤内表达IL-2的水平提高，血浆中IL-2的含量显著降低，说明设置表达调控元件的环状RNA分子能够实现在肿瘤细胞、组织中的特异性高表达，以及在肝脏等健康细胞、组织中的特异性低表达。
在另外一些实施方式中，环状RNA分子是将SEQ ID NO：73所示序列的第1380-1401位、第1441-1462位，以及第1503-1524位的核苷酸序列同时替换为如SEQ ID NO：2-66任一项所示的序列得到的核苷酸分子。
在一些实施方式中，环状RNA分子包含如SEQ ID NO：xx所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO：xx所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。SEQ ID NO：76-77任一项所示的环状RNA分子的编码区表达免疫检查点抑制剂CTLA，其表达调控元件包含3个miR-122识别区；在递送于肿瘤小鼠模型内后，与未设置表达调控元件的环状RNA分子相比，SEQ ID NO：76-77任一项所示的环状RNA分子在肝脏细胞中表达CTLA的含量显著降低，而在肿瘤细胞中CTLA的表达含量未发生明显变化；而两种环状RNA分子在递送于肿瘤模型小鼠体内后，SEQ ID NO：76-77任一项所示的环状RNA分子在瘤内表达CTLA的水平提高，血浆中CTLA的含量显著降低，说明设置表达调控元件的环状RNA分子能够实现在肿瘤细胞中的特异性高表达，以及在肝脏等健康细胞中的特异性低表达。
在另外一些实施方式中，环状RNA分子是将SEQ ID NO：76所示序列的第2217-2238位、第2278-2299位，以及第2340-2361位的核苷酸序列同时替换为如SEQ ID NO：3-66任一项所示的序列得到的核苷酸分子。
在另外一些实施方式中，环状RNA分子是将SEQ ID NO：77所示序列的第1518-1539位、第1579-1600位，以及第1641-1662位的核苷酸序列同时替换为如SEQ ID NO：3-66任一项所示的序列得到的核苷酸分子。
环化前体RNA分子
本公开提供的环化前体RNA分子，能够环化形成上述的环状RNA分子。环化前体RNA分子可以通过多种方法进行环化，在一些实施方式中，环化前体RNA分子通过T4连接酶(T4DNA连接酶、T4 RNA连接酶I、T4 RNA连接酶II)连接形成本公开中的环状RNA分子。在另外一些实施方式中，环化前体RNA分子利用PIE***的剪切和连接反应环化形成本公开的环状RNA分子。
在一些优选地实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第二外显子上游的5’同源臂，5’同源臂序列为与SEQ ID NO：94-95任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些优选地实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第一外显子下游的3’同源臂。3’同源臂序列为与SEQ ID NO：96-97任一序列所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些优选地实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第二外显子与5’同源臂之间的3’内含子，3’内含子为与SEQ ID NO：93所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些优选地实施方式中，环化前体RNA分子还包括位于第一外显子与3’同源臂之间的5’内含子，5’内含子为与SEQ ID NO：:92所示的核苷酸序列相比具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的序列。
在一些具体地实施方式，环化前体RNA分子包括顺次连接的如下所示元件：
5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、IRES元件、编码区、表达调控元件、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。
环化前体RNA分子通过如下过程成环：利用内含子的核酶特性，在GTP的引发下，5’内含子与第一外显子的连接处发生断裂；第一外显子的核酶裂口进一步攻击3’内含子与第二外显子的连接处，使该处发生断裂，3’内含子解离，第一外显子和第二外显子连接形成环状RNA分子。
在一些实施方式中，本公开提供了一种重组核酸分子，能够转录形成上述的环化前体RNA分子。为使重组核酸分子能够进一步转录形成RNA分子，在重组核酸分子中还可以包含调控序列。示例性的，调控序列为连接于5’同源臂上游的T7启动子。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组表达载体，包含上述的重组核酸分子。其中，连接重组核酸分子的载体可以是本领域常用的各类载体，例如pUC57质粒等。进一步的重组核酸分子中包含限制性酶切位点，使重组表达载体经酶切后得到适于转录的线性化载体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组宿主细胞，包含环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子和重组表达载体中的至少一种。
药物制剂或组合物
本公开中的环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组核酸分子、重组表达载体或重组宿主细胞，可以与一种或多种药学上可接受的载体混合，被制作为任何临床上可施用的剂型。示例性的，药物制剂为片剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、丸剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、口服溶液、吸入剂、混悬剂或干悬剂等。
在一些实施方式中，环状RNA分子被包裹于脂质体材料中，被制作为药物制剂。示例性的，脂质体材料包括脂质体聚合物(lipopolyplex，LPR)、阳离子脂质体复合物(lipoplex，LP)、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle，LNP)等。利用脂质体材料包裹环状RNA分子，可进一步提高药物递送的靶向性和递送效率，实现在靶细胞和靶组织中的特异性表达。
本领域公知，脂质体材料作为药物递送载体，向受试者体内递送小分子、抗体、蛋白等药物分子时，表现出靶向、缓控释、良好的生物相容性和低毒副作用等优点。然而，研究发现，当以脂质体材料递送mRNA的核酸分子时，mRNA分子在肝脏细胞内普遍表现出高丰度表达的倾向。特别地，无论是以瘤内递送还是其他的体内药物施用方式，脂质体材料包裹的mRNA分子均容易富集于肝脏细胞内，并在肝脏细胞中高丰度表达目标多肽，导致产生强烈的肝毒性。
而本公开中的环状RNA分子，在利用脂质体材料进行递送的条件下，仅在靶细胞和靶组织中高表达目标多肽、在非靶细胞和非靶组织中低表达目标多肽，表现出组织特异性的表达趋势，有效解决了目前以脂质体材料进行递送表达目标多肽的mRNA分子存在易在肝脏细胞中高丰度表达、造成强烈肝脏毒性的问题。
在一些实施方式中，本公开中以脂质体材料包裹环状RNA分子形成的药物制剂或组合物，适于向肿瘤细胞、组织内靶向递送治疗性的目标多肽，而环状RNA分子在肝脏等细胞、组织器官极低表达或不表达，具有高的肿瘤靶向性，能够避免因为由于肝脏中高丰富表达造成的毒副作用。
进一步的，本公开中的药物制剂或组合物适合作为注射剂，以瘤内注射的方式施用于受试者体内，在瘤内局部高表达细胞因子、抗体、免疫检查点抑制剂等目标多肽，具有肿瘤靶向性高、免疫治疗效果显著、毒副作用低等优势。
医药用途
本公开提供了环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组核酸分子、重组表达载体或重组宿主细胞在制备预防或治疗疾病的药物中的应用。利用环状RNA分子的组织特异性表达，实现对患病细胞、组织内靶向递送具有疾病预防或治疗效果的目标多肽。
在一些优选的实施方式中，环状RNA分子等用于制备预防或***的药物，更优选为制备预防或***的瘤内注射剂中。环状RNA分子制备的药物施用于受试者体内后，其表达的细胞因子、抗原结合片段、免疫检查点抑制剂等目标多肽在肿瘤组织中高度富集，而在健康组织、器官中低水平表达或不表达，具有较高的临床药用安全性和肿瘤的治疗效果。
在一些实施方式中，本公开提供了一种预防或治疗疾病的方法，包括向受试者施用环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组核酸分子、重组表达载体、重组宿主细胞、药物制剂或组合物。环状RNA分子适合递送于受试者体内，实现对患病细胞、组织、器官的靶向性治疗。
可选地，所述施用选自口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤瘤内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或***性施用；优选为肿瘤瘤内注射。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1：含有miR-122识别区的环状mRNA的制备及其在A549细胞中的表达
(1)质粒构建
构建含有不同序列的Luciferase目的基因，该步骤委托苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成与克隆。所得基因片段连接到pUC57载体。得到如下质粒：
pUC57-EV29-LUC，
pUC57-EV29-LUC-3’UTR，
pUC57-EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122。
(2)线性质粒模板制备
1)质粒抽提
①将外部合成的穿刺菌活化，条件37℃/220rpm/3～4h。
②取活化菌液扩大培养，培养条件：37℃/220rpm/过夜。
③质粒抽提(天根无内毒素小量中提试剂盒)，测定OD值。
2)质粒酶切
采取XbaI单酶切的方法酶切上述1)制备质粒。
酶切体系如下：
表1
| 试剂 | 体积 |
| 质粒 | 10ug |
| 酶(1000units) | 5ul |
| 10×cutsmart buffer | 50ul |
| Nuclease free，H2O | Total 500ul |
37℃酶切过夜。采用通用型DNA胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物，测定OD值并采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。纯化的线性质粒模板用于体外转录。
(3)体外转录制备线性mRNA
1)体外转录
采用T7体外转录试剂盒(APE×BIO T7 High Yield RNA Synthesis Kit)合成mRNA
转录体系如下：
表2
| 试剂 | 体积 |
| 10×Reaction Buffer | 2μl |
| ATP(20mM) | 2μl |
| CTP(20mM) | 2μl |
| UTP(20mM) | 2μl |
| GTP(20mM) | 2μl |
| 线性化DNA模板 | 1μg |
| T7 RNA Polymerase Mix | 2μl |
| RNA Nuclease free，H2O | Total 20μl |
37℃孵育2.5h，然后用DNase I消化线性DNA模板。消化条件：37℃消化15min。
2)线性mRNA纯化
将上述1)所得转录产物，使用硅膜离心柱法纯化(Thermo，GeneJETRNAPurification Kit),测定OD值及1％变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小。
1％变性琼脂糖凝胶配方如下：
称取1g琼脂糖，至72ml nuclease-free，H2O中，微波炉加热溶解；
上述琼脂糖冷却至55～60℃时，在通风橱加0.1％的gel red，10ml 10xMOPS，18ml甲醛，灌胶。
变性琼脂糖凝胶电泳流程如下：取等体积样本RNA与2xLoading buffe，65～70℃变性5～10min。上样，采用100V/30min条件进行电泳，其后采用凝胶成像***拍照。
(4)mRNA环化
1)环化试剂：
GTP Buffer：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.5左右。
2)环化体系与条件：
表3
| 溶液 | 体积 |
| mRNA | 25μg mRNA |
| GTP solution(20mM) | 50μl |
| GTP buffer | 补足至500μl |
将上述溶液于55℃加热15min，之后置于冰上，环化RNA产物使用硅膜离心柱法纯化(Thermo，GeneJET RNA Purification Kit)，测定OD值及1％变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA大小。
3)环状RNA1％变性琼脂糖凝胶鉴定
A.试剂配制：1g琼脂糖粉加入72ml无核酸酶水中，加热将琼脂塘融化，加入10ml10×MOPS缓冲液。然后在通风柜中加入18ml新鲜37％甲醛，充分混合，将凝胶倒入槽中。
B.mRNA检测：取500ng左右mRNA溶液，加入等体积的2×RNA loading buffer混匀，65℃加热5min，进行琼脂糖凝胶检测。
5)编码Luciferase的环状mRNA转染A549细胞及荧光强度测定
1)细胞培养：
A549接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。细胞每隔2-3天进行传代培养。
2)细胞转染：
转染前将A549细胞以1×105个/孔接种于24孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达到70-90％融合度后，使用Lipofectamine Messenger Max(Invitrogen)转染试剂将mRNA以500ng/孔的量转染A549细胞，具体操作如下：
①稀释Messenger MAXTM Reagent
表4
| 试剂 | 体积/孔 |
| MEM无血清培养基 | 25μl |
| Messenger MAXTM Reagent | 0.75μl |
稀释混合后，室温静置孵育10min。
②稀释mRNA
表5
| 试剂 | 体积/孔 |
| mRNA | 1μg |
| MEM无血清培养基 | 补足至25μl |
③取混合稀释后的Messenger MAXTM Reagent和mRNA(1：1)
表6
| 试剂 | 体积/孔 |
| 稀释的Messenger MAXTM Reagent | 25μl |
| 稀释的mRNA | 25μl |
稀释混合后，室温静置孵育5min。
④吸取上述混合液50ul贴壁缓缓加入24孔板中，37℃、5％CO2培养箱中孵育培养。
3)蛋白表达检测
①细胞收样与计数：待细胞转染24h后，使用胰蛋白酶(Gibco)消化细胞，1000rpm离心5min弃上清，重悬于PBS，将台盼蓝溶液与细胞悬液1:1混合后，使用Countstar细胞计数仪计数。
②细胞裂解：每个转染组取细胞2×104个细胞，将细胞离心后弃上清，加入20ul的细胞裂解液，冰上裂解5min。
③酶标仪检测luciferase蛋白表达：取裂解液置于96孔白板中，每孔加入100ulluciferase反应底物，酶标仪检测发光值。
实验结果：
表7
| 质粒提取 | 浓度 | 体积 | |
| PUC-EV29-LUC | 347.6ng/μl | 240μl | 约83.4μg |
| PUC-EV29-LUC-3UTR | 186.9ng/μl | 240μl | 约44.8μg |
| PUC-EV29-LUC-3UTR+1×miR-122 | 181.2ng/μl | 240μl | 约43.5μg |
| 酶切后产物 | |||
| PUC-EV29-LUC | 209.3ng/μl | 240μl | 约50μg得率约60.0％ |
| PUC-EV29-LUC-3UTR | 231.1ng/μl | 120μl | 约27μg得率约60.3％ |
| PUC-EV29-LUC-3UTR+1×miR-122 | 234.2ng/μl | 120μl | 约28μg得率约64.3％ |
| 转录后产物 | |||
| EV29-LUC | 1008.9ng/μl | 900μl | 约908μg |
| EV29-LUC-3UTR | 1244.4ng/μl | 900μl | 约1.1mg |
| EV29-LUC-3UTR+1×miR-122 | 1178.4ng/μl | 900μl | 约940μg |
| 环化后产物 | |||
| EV29-LUC | 1897.5ng/μl | 450μl | 约853.8μg得率约94.8％ |
| EV29-LUC-3UTR | 1572.3ng/μl | 450μl | 约707.5μg得率约78.6％ |
| EV29-LUC-3UTR+1×miR-122 | 1741.2ng/μl | 450μl | 约783.5μg得率约87.0％ |
如图1和图2结果所示，基于添加1×miR-122识别区的环状mRNA的分子设计，其DNA模板的酶切线性化、RNA体外转录以及mRNA的成环反应均可正常进行，说明添加1×miR-122识别区不影响环状mRNA的正常制备过程。细胞实验结果(图3)表明，添加1×miR-122识别区的环状mRNA可以在A549细胞有效表达其编码的Luciferase蛋白。与对照组野生型EV29-Luc环状mRNA及对照组EV29-Luc-3’UTR相比，EV29-Luc-3’UTR-1×miR-122的Luciferase表达量略低，可能的原因在于A549细胞存在本底水平的的miR-122表达。
实施例2：含有多个miR-122识别区的环状mRNA在A549细胞中的表达
在上述实施例1的基础上，在环状mRNAEV29-LUC-3’UTR+1×miR-122基础上添加更多miR-122识别区,例如添加3×miR-122。质粒DNA线性化，环状前体mRNA体外转录，环状前体mRNA纯化，mRNA的成环反应，环状mRNA的纯化，细胞培养与Luciferase检测等方法均与实施例1的1.1相同。
细胞转染步骤：
转染前将A549细胞以1×105个/孔接种于24孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞达到70-90％融合度后,使用Lipofectamine Messenger Max(Invitrogen)转染试剂将mRNA以500ng/孔的量转染A549细胞，具体操作如下：
①稀释Messenger MAXTM Reagent
表8
| 试剂 | 体积/孔 |
| MEM无血清培养基 | 25μl |
| Messenger MAXTM Reagent | 0.75μl |
稀释混合后，室温静置孵育10min。
②稀释mRNA
表9
| 试剂 | 体积/孔 |
| 环状RNA mRNA | 500ng |
| miR-122/NC miRNA | 125ng |
| MEM无血清培养基 | 补足至25μl |
稀释混合后，室温静置孵育5min。
③吸取上述混合液50ul贴壁缓缓加入24孔板中，37℃、5％CO2培养箱中孵育培养。
实验结果显示(图4)，相比于转染NC miRNA的处理组，转染miR-122的处理组出现显著的Luciferase表达抑制，无论是1x miR-122的环状mRNA还是3×miR-122的环状mRNA，其Luciferase的表达量均下降至接近本底水平。其中又以3×miR-122的环状mRNA的表达抑制效果最为显著。该实验结果说明引入miR-122识别区的环状mRNA受到细胞内miR-122的显著干扰，出现了明显的翻译抑制效应。其中NC组中pUC-EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122和pUC-EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122的Luciferase表达也出现一定程度的下调，其发生原因判断为A549细胞存在本底水平的miR-122表达。
实施例3：环状mRNA包含不同组织特异性的miRNA识别区对Luciferase在特定组织细胞表达的影响
在上述实施例1的基础上，通过构建含有不同micoRNA序列的ev29-Luc环状RNA，并通过其在不同细胞系间的表达情况进行统计。其中质粒DNA的线性化，环状前体mRNA的体外转录，环状前体mRNA的纯化，mRNA的成环反应，环状mRNA的纯化，以及细胞转染与Luciferase检测等方法均与实施例1的1.1相同。
1)MRC-5及IMR-90人肺成纤维细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出MRC-5及IMR-90人肺成纤维细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的MEM培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。观察细胞贴壁生长达70％培养皿底面积后，弃去旧培养液，用4ml PBS清洗2次，吸取1ml胰酶加入。将细胞放入37℃孵箱，约2分钟，倒置显微镜观察细胞消化情况，消化程度合适之后，取1-2ml培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。取适量培养基加入新的培养皿中，加入细胞悬液，镜下观察，摇匀，37℃孵育。每2-3天传代一次。
2)LO2及Chang liver人正常肝脏细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出LO2及Chang liver人正常肝脏细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。细胞传代方法同上。
3)H9C2大鼠心肌细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出H9C2大鼠心肌细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有1％胎牛血清的DMEM培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。细胞传代方法同上。
4)大鼠脊髄神经元和星形胶质细胞的原代培养
a.大鼠脊髄神经元培养
将足月新生内大鼠，消毒后置于平皿内，仰卧位取出脊髓，剥离脑脊膜，并把脊髓组织碎块，用0.25％胰蛋白酶在37°下消化15分钟后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶作用，过滤，吹打后220xg/min离心，弃上清液，用含的胎牛血清的培养液重悬下层细胞沉淀。将上述细胞悬液放入37°孵箱内孵育，接种后移入37℃的培养箱，之后将培养基换为无血清培养基(Neurobasal+2％B27+0.5Mm谷氨酰胺+1％双抗)进行培养。细胞培养第3d加入浓度10umol/L的阿糖胞苷24小时后进行细胞换液，之后3d半量换液1次，所有实验在细胞种植后5至7天开始。
b.星形胶质细胞的培养与纯化：
将足月新生内大鼠，按照以上方法取出脑髓，然后进行剪碎、胰酶消化、过滤以及离心，以细胞接种于多聚赖氨酸包被的细胞培养板或皿中(培养基为10％的胎牛血清的DMEM培养液)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，24h后换液，去除未贴壁的活力差或死亡细胞，以后3d换一次液。将人原代星形胶质细胞，按1：3比例将细胞接种于多聚赖氨酸包被的细胞培养板或皿中，置于37°2％CO2的培养箱中培养，按照此方法传4至5代。
5)HSPC-1人造血干细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出HSPC-1人造血干细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的RPMI-1640培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。细胞传代方法同上。
6)HUV-EC-C人脐静脉内皮细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出HUV-EC-C人脐静脉内皮细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的F-12K培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。细胞传代方法同上。
7)HK-2人肾皮质细胞株复苏及传代培养
从液氮保存罐中取出HK-2人肾皮质细胞株，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速摇晃直至其中冻存液完全融化。调整细胞浓度，将细胞接种于含有5ng/mL rhEGF的Keratinocyte-SFM培养基中，之后将接种细胞在37℃培养于CO2培养箱中。细胞传代方法同上。
基于SEQ ID NO.70所示序列的环状RNA分子，在环状RNA的表达调控元件中替换一个下列miRNA识别区对环状RNA表达抑制的影响：
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
实施例4：包含miR-122识别区的环状mRNA介导Luciferase在小鼠体内特定部位的表达
将上述实施例1和实施例2中的环状mRNA EV29-LUC-3’UTR、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122进行阳离子脂质体LNP递送***的包载。环状mRNA-脂质纳米粒复合物通过微流控设备制备，将水相中的mRNA活性成分与有机相中的四种脂质充分混合后形成纳米尺寸的高包封率的mRNA产品。首先将环状mRNA原液用pH4.0的柠檬酸溶液稀释至0.4mg/mL，称取4种脂质溶解到乙醇溶液中，脂质总浓度为24.4mg/mL。使用微流控设备将两相快速混合，其中总流速设为12mL/min，水相(环状mRNA)/有机相(脂质)(v/v)＝3:1。制备结束后，使用透析或切向流的方式除掉乙醇，同时将溶液置换成pH 7.4的PBS溶液，即得到环状mRNA-脂质纳米粒复合物。使用动态光散射器(DLS)检测环状mRNA-脂质纳米粒复合物的粒径及多分散系数(PDI)，使用Ribogreen检测复合物中环状mRNA的包封率。采用肌肉注射方式对小鼠给药，6小时后测定Luciferase在小鼠的表达情况。
具体方法如下：取pUC-EV29-LUC-3UTR、pUC-EV29-LUC-3UTR+1×miR-122、pUC-EV29-LUC-3UTR+3×miR-122免疫后的小鼠，腹腔注射0.3ml的luciferase底物VivoGloluciferin(In Vivo Grade，Promega)，8分钟后进行成像，观测体内分布和荧光表达强度。
实验结果：如图5所示，对照组(EV29-luc-3UTR)小鼠的荧光素酶主要在肌肉注射部位以及肝脏表达；而加入单个miR-122识别区的环状mRNA
(EV29-luc-3UTR+1xmiR-122)主要在肌肉注射部位表达，个别小鼠出现少量肝脏表达；而加入三个miR-122识别区的环状mRNA(EV29-luc-3UTR+3×miR-122)，其mRNA仅在肌肉注射部位表达，未检测到肝脏表达。由此可见，在环状mRNA引入miR-122能有效避免环状mRNA在肝脏表达，且引入的miR-122识别区越多，其肝脏表达抑制效应越显著。
实施例5：测试瘤内注射条件下包含miR-122识别区的环状mRNA介导Luciferase在小鼠肿瘤原位以及肝脏表达情况
将上述实施例4的环状mRNA EV29-LUC-3’UTR、EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122、EV29-LUC-3UTR+3×miR-122进行阳离子脂质体LNP递送***的包载。方法与实施例4相一致。MC38肿瘤模型的构建方法如下：雌性C57BL/6(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6-8周大，体重在18和22克之间，研究前在饲养室(吉玛基因)适应至少三天。小鼠可以自由获取食物和无菌水。饲养环境：维持12h明12h暗昼夜交替，湿度维持在40～70％且日湿差<5％；温度维持于20～25℃。按照实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。MC38细胞来自南京科佰生物技术有限公司，培养于DuLbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)高糖培养基，加入10％FBS(Fatal Bovine Serum，胎牛血清)和1％PS(Penicillin-StreptomycinSolution，青霉素-链霉素溶液)。DMEM高糖培养基和FBS购自Biological Industries，PBS购自HyClone。细胞计数采用台盼蓝(Trypan Blue Solution，购自SIGMA)与细胞悬液1:1混合后，使用Countstar细胞计数仪计数。收集细胞时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)消化细胞，重悬于添加了Matrigel(Corning)的磷酸盐缓冲液(PBS，上海源培生物科技股份有限公司)中，每只雌性C57BL/6J小鼠右侧腋下皮下接种1×106/150μl的MC38细胞。采用微型注射器进行MC38流体的瘤内注射，每个瘤体注射LNP包载的环状mRNA 10ug。6小时后测定Luciferase在小鼠的表达情况，具体操作步骤与实施例4相一致。
如图6和图7的实验结果所示，EV29-LUC-3UTR组Luciferse主要在瘤内以及肝脏表达，而EV29-LUC-3’UTR+1×miR-122、EV29-LUC-3’UTR+3×miR-122组的Luciferase仅在瘤内表达，肝脏不表达。实验证据充分说明在环状mRNA引入miR-122可有效避免Luciferse在肝脏表达，从而把表达部位局限在肿瘤内部。
实施例6：测试瘤内注射条件下包含miR-122识别区的环状mRNA介导细胞因子IL-2在Hela细胞及肝细胞的表达，以及小鼠肿瘤原位以及血浆表达情况
环状mRNA EV29-IL-2-3UTR与EV29-IL-2-3UTR+3xmiR-122的制备方法与实施例1中的方法相一致。采用Lipofectamine Messenger Max(Invitrogen)转染试剂将两种不同的环状mRNA以500ng/孔的量转染至HeLa细胞以及肝细胞。实验结果表明，环状mRNA EV29-IL-2-3UTR与EV29-IL-2-3UTR+3xmiR-122在转染HeLa细胞12小时后的表达量分别为2520.5ng/mL及2074.3ng/mL；在转染肝细胞12小时后的IL-2表达量分别为226.8ng/mL及23.2ng/mL。由此可见，EV29-IL-2-3UTR+3xmiR-122在肝细胞的蛋白表达收到显著的抑制。
表17
| HeLa细胞(ng/mL) | Chang Liver肝细胞(ng/mL) | |
| EV29-IL-2-3’UTR | 2520.5 | 226.8 |
| EV29-IL-2-3’UTR+3×miR-122 | 2074.3 | 23.2 |
采用阳离子脂质体LNP递送***对上述环状mRNA的包载方法与实施例4中的方法相一致。MC38肿瘤的C57BL/6J小鼠肿瘤模型制备方法同实施例5。将上述环状mRNA-LNP复合物对MC38肿瘤的C57BL/6J小鼠进行瘤内注射，方法同实施例5。瘤内注射后12小时处死小鼠，分别采用IL-12ELISA检测试剂盒(Thermo Fisher)测定肿瘤内部以及外周血的IL-2含量。
实验结果表明:瘤内注射环状mRNA EV29-IL-2-3’UTR达12小时后，IL-2在瘤内的含量为146.5ng/g,在血浆中的含量为153.2ng/mL；而瘤内注射环状mRNA EV29-IL-2-3’UTR+3×miR-122达12小时后，其瘤内IL-2含量为231.4ng/mL，而血浆中IL-2的含量为16.5ng/mL。由此可见，环状mRNAEV29-IL-2-3UTR+3×miR-122所表达的IL-2蛋白主要分布在瘤内，而EV29-IL-2-3UTR所表达的蛋白分别分布在瘤内和血浆，且瘤内表达的IL-2含量偏低。而血浆中的IL-2蛋白主要经由肝脏表达并分泌至血液循环。细胞因子IL-2分泌至循环***会导致显著的***毒性。因此，采用环状mRNA EV29-IL-2-3UTR+3×miR-122做瘤内注射，避免该mRNA在肝脏表达而分泌进入血液循环，是一种较为安全与优效的策略。
表18
| 瘤内表达(ng/g) | 血浆表达(ng/mL) | |
| EV29-IL-2-3’UTR | 146.5 | 153.2 |
| EV29-IL-2-3’UTR+3×miR-122 | 231.4 | 16.5 |
实施例7：测试瘤内注射条件下包含miR-122识别区的环状mRNA介导抗CTLA-4单抗在Hela细胞及肝细胞的表达，以及小鼠肿瘤原位以及血浆表达情况
环状mRNA EV29-CTLA-4(HC)-3’UTR/EV29-CTLA-4(LC)-3’UTR与EV29-CTLA-4(HC)-3’UTR+3×miR-122/EV29-CTLA-4(LC)-3’UTR+3×miR-122的制备方法与实施例1中的方法相一致。采用Lipofectamine Messenger Max(Invitrogen)转染试剂将HC与LC两种不同的环状mRNA混合物以500ng/孔(1：1)的量转染至HeLa细胞以及肝细胞。实验结果表明，环状mRNA EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR与EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR+3×miR-122在转染HeLa细胞12小时后的表达量分别为3631.5ng/mL及3307.2ng/mL；在转染肝细胞12小时后的IL-2表达量分别为463.2ng/mL及37.2ng/mL。由此可见，EV29-IL-2-3’UTR+3×miR-122在肝细胞的蛋白表达受到显著抑制。
表19
采用阳离子脂质体LNP递送***对上述环状mRNA的包载方法与实施例4中的方法相一致。MC38肿瘤的C57BL/6J小鼠肿瘤模型制备方法同实施例5。将上述环状mRNA-LNP复合物对MC38肿瘤的C57BL/6J小鼠进行瘤内注射，方法同实施例5。瘤内注射后12小时处死小鼠，分别采用CTLA-4抗体ELISA检测试剂盒(ThermoFisher)测定肿瘤内部以及外周血的CTLA-4单抗含量。
实验结果表明，瘤内注射环状mRNA EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR达12小时后，CTLA-4单抗在瘤内的含量为283.8ng/g，在血浆中的含量为235.9ng/mL；而瘤内注射环状mRNA EV29-CTLA-4(HC/LC)+3×miR-122达12小时后，其瘤内CTLA-4单抗含量为473.4ng/mL，而血浆中CTLA-4单抗的含量为31.6ng/mL。由此可见，环状mRNA EV29-CTLA-4(HC/LC)+3×miR-122所表达的IL-2蛋白主要分布在瘤内，而EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR所表达的蛋白分别分布在瘤内和血浆，且瘤内表达的CTLA-4单抗含量偏低。而血浆中的CTLA-4单抗蛋白主要经由肝脏表达并分泌至血液循环。分布在瘤内的CTLA-4单抗主要作用于浸润至瘤内的效应性T细胞，相比循环***的CTLA-4单抗更有利于发挥其T细胞激活效应。因此，采用环状mRNA EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR+3×miR-122做瘤内注射能产生相对较高浓度的抗体集中于肿瘤内部，更有利于引发抗肿瘤免疫作用，是一种较为优效的策略。
表20
| 瘤内表达(ng/g) | 血浆表达(ng/mL) | |
| EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR | 283.8 | 235.9 |
| EV29-CTLA-4(HC/LC)-3’UTR+3×miR-122 | 473.4 | 31.6 |
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏普瑞康生物医药科技有限公司
<120> 一种组织特异性表达的环状RNA分子及其应用
<130> 6A23-2173225I-SU
<160> 97
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3'UTR序列
<400> 1
ugauaauagg cuggagccuc gguggccaug cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc 60
cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcggc 119
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
caaacaccau ugucacacuc ca 22
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ccaaguucug ucaugcacug a 21
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
agucggagug ucucagaacu uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
uccacaugga guugcuguua ca 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
uaaccaaugu gcagacuacu gu 22
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gucugucaau ucauagguca u 21
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
cuaucugcac uagaugcacc uua 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
cuaccugcac uauaagcacu uua 23
<210> 10
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
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<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
agcugagugu aggauguuua ca 22
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
gcugagagug uaggauguuu aca 23
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ugcaacuuag uaaugugcaa ua 22
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
ccaucuuuac cagacagugu ua 22
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
ggcugucaau ucauagguca g 21
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ucaucucgcc cgcaaagacc ca 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
uccacaugga guugcuguua ca 22
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
ucaucauuac caggcaguau ua 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
aggcauagga ugacaaaggg aa 22
<210> 20
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
cuaucugcac uagaugcacc uua 23
<210> 21
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<213> Homo sapiens
<400> 21
ucaguuuugc auagauuugc aca 23
<210> 22
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
cuaccugcac uauaagcacu uua 23
<210> 23
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
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<210> 24
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
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<210> 25
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
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<210> 26
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
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<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
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<210> 28
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<213> Homo sapiens
<400> 28
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<210> 29
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
ucaucauuac caggcaguau ua 22
<210> 30
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
acucaccgac agcguugaau guu 23
<210> 31
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
auacauacuu cuuuacauuc ca 22
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
cagcugguug aaggggacca aa 22
<210> 33
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gagcuacagu gcuucaucuc a 21
<210> 34
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
gggagugaag acacggagcc aga 23
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
ccacacacuu ccuuacauuc ca 22
<210> 36
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
guauaacccg ggccaaaagc uc 22
<210> 37
<211> 24
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
aacaacaaaa ucacuagucu ucca 24
<210> 38
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 38
ucauacagcu agauaaccaa aga 23
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
uuggcauuca ccgcgugccu ua 22
<210> 40
<211> 24
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
ucacagguua aagggucuca ggga 24
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
aaagagaccg guucacugug a 21
<210> 42
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
cgaccauggc uguagacugu ua 22
<210> 43
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 43
ucacauagga auaaaaagcc aua 23
<210> 44
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
cuacgcguau ucuuaagcaa uaa 23
<210> 45
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
acuggagaca cgugcacugu aga 23
<210> 46
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 46
gggagugaag acacggagcc aga 23
<210> 47
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 47
gaucacuuuu gugacuaugc aa 22
<210> 48
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 48
agugaauucu accagugcca ua 22
<210> 49
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
accuaauaua ucaaacauau ca 22
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 50
agaauugcgu uuggacaauc a 21
<210> 51
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 51
cgccaauauu uacgugcugc ua 22
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
ucaacaucag ucugauaagc ua 22
<210> 53
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
cuguuccugc ugaacugagc ca 22
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 54
gcggaacuua gccacuguga a 21
<210> 55
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 55
cacaagaucg gaucuacggg uu 22
<210> 56
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
agccaagcuc agacggaucc ga 22
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
cgaccauggc uguagacugu ua 22
<210> 58
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 58
uccauaaagu aggaaacacu aca 23
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 59
acuagacugu gagcuccucg a 21
<210> 60
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
acucaccgac agcguugaau guu 23
<210> 61
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
acugauauca gcucaguagg ca 22
<210> 62
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
aguaagcagu cuagagccaa ggu 23
<210> 63
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
ugggguauuu gacaaacuga ca 22
<210> 64
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
cuaccugcac uguaagcacu uug 23
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 65
acaggccggg acaagugcaa ua 22
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
cgcguaccaa aaguaauaau g 21
<210> 67
<211> 141
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 表达调控元件序列
<400> 67
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aauaaagucu gagugggcgg c 141
<210> 68
<211> 185
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 表达调控元件序列
<400> 68
ugauaauagc aaacaccauu gucacacucc agcuggagcc ucgguggcca ugcuucuugc 60
cccuugggcc caaacaccau ugucacacuc caucccccca gccccuccuc cccuuccugc 120
acccguaccc cccaaacacc auugucacac uccagugguc uuugaauaaa gucugagugg 180
gcggc 185
<210> 69
<211> 2691
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 69
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cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240
cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660
accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaaauggagg acgccaagaa caucaagaag ggcccugccc 900
cuuucuaccc ucuggaggac ggcaccgccg gcgagcagcu gcacaaggcc augaagaggu 960
acgcccuggu gccuggcacc aucgccuuca ccgacgccca caucgaggug gacaucaccu 1020
acgccgagua cuucgagaug agcgugaggc uggccgaggc caugaagagg uacggccuga 1080
acaccaacca caggaucgug gugugcagcg agaacagccu gcaguucuuc augccugugc 1140
ugggcgcccu guucaucggc guggccgugg ccccugccaa cgacaucuac aacgagaggg 1200
agcugcugaa cagcaugggc aucagccagc cuaccguggu guucgugagc aagaagggcc 1260
ugcagaagau ccugaacgug cagaagaagc ugccuaucau ccagaagauc aucaucaugg 1320
acagcaagac cgacuaccag ggcuuccaga gcauguacac cuucgugacc agccaccugc 1380
cuccuggcuu caacgaguac gacuucgugc cugagagcuu cgacagggac aagaccaucg 1440
cccugaucau gaacagcagc ggcagcaccg gccugccuaa gggcguggcc cugccucaca 1500
ggaccgccug cgugagguuc agccacgcca gggacccuau cuucggcaac cagaucaucc 1560
cugacaccgc cauccugagc guggugccuu uccaccacgg cuucggcaug uucaccaccc 1620
ugggcuaccu gaucugcggc uucagggugg ugcugaugua cagguucgag gaggagcugu 1680
uccugaggag ccugcaggac uacaagaucc agagcgcccu gcuggugccu acccuguuca 1740
gcuucuucgc caagagcacc cugaucgaca aguacgaccu gagcaaccug cacgagaucg 1800
ccagcggcgg cgccccucug agcaaggagg ugggcgaggc cguggccaag agguuccacc 1860
ugccuggcau caggcagggc uacggccuga ccgagaccac cagcgccauc cugaucaccc 1920
cugagggcga cgacaagccu ggcgccgugg gcaagguggu gccuuucuuc gaggccaagg 1980
ugguggaccu ggacaccggc aagacccugg gcgugaacca gaggggcgag cugugcguga 2040
ggggcccuau gaucaugagc ggcuacguga acaacccuga ggccaccaac gcccugaucg 2100
acaaggacgg cuggcugcac agcggcgaca ucgccuacug ggacgaggac gagcacuucu 2160
ucaucgugga caggcugaag agccugauca aguacaaggg cuaccaggug gccccugccg 2220
agcuggagag cauccugcug cagcacccua acaucuucga cgccggcgug gcuggcuugc 2280
cugaugacga ugcuggagag cugccugccg ccgugguggu gcuggagcac ggcaagacca 2340
ugaccgagaa ggagaucgug gacuacgugg ccagccaggu gaccaccgcc aagaagcuga 2400
ggggcggcgu gguguucgug gacgaggugc cuaagggccu gaccggcaag cuggacgcca 2460
ggaagaucag ggagauccug aucaaggcca agaagggcgg caagaucgcc gugugaugau 2520
aauaggcugg agccucggug gccaugcuuc uugccccuug ggccuccccc cagccccucc 2580
uccccuuccu gcacccguac ccccgugguc uuugaauaaa gucugagugg gcggcaaaaa 2640
acaaaaaaca aaacggcuau uaugcguuac cggcgagacg cuacggacuu a 2691
<210> 70
<211> 2713
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 70
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cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
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cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
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cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
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accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
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cugaugacga ugcuggagag cugccugccg ccgugguggu gcuggagcac ggcaagacca 2340
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<210> 71
<211> 2757
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 71
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cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240
cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660
accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaaauggagg acgccaagaa caucaagaag ggcccugccc 900
cuuucuaccc ucuggaggac ggcaccgccg gcgagcagcu gcacaaggcc augaagaggu 960
acgcccuggu gccuggcacc aucgccuuca ccgacgccca caucgaggug gacaucaccu 1020
acgccgagua cuucgagaug agcgugaggc uggccgaggc caugaagagg uacggccuga 1080
acaccaacca caggaucgug gugugcagcg agaacagccu gcaguucuuc augccugugc 1140
ugggcgcccu guucaucggc guggccgugg ccccugccaa cgacaucuac aacgagaggg 1200
agcugcugaa cagcaugggc aucagccagc cuaccguggu guucgugagc aagaagggcc 1260
ugcagaagau ccugaacgug cagaagaagc ugccuaucau ccagaagauc aucaucaugg 1320
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caaaaaacaa aaaacaaaac ggcuauuaug cguuaccggc gagacgcuac ggacuua 2757
<210> 72
<211> 1545
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 72
aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc acgccggaaa 60
cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240
cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660
accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaaauguaca gcaugcagcu ggccagcugc gugacccuga 900
cccuggugcu gcuggugaac agcgccccca ccagcagcag caccagcagc agcaccgccg 960
aggcccagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcaccuggag cagcugcuga 1020
uggaccugca ggagcugcug agcaggaugg agaacuacag gaaccugaag cugcccagga 1080
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uggaggacga gcugggcccc cugaggcacg ugcuggaccu gacccagagc aagagcuucc 1200
agcuggagga cgccgagaac uucaucagca acaucagggu gaccguggug aagcugaagg 1260
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ugaggaggug gaucgccuuc ugccagagca ucaucagcac cagcccccag ugauaauagg 1380
cuggagccuc gguggccaug cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc cuccuccccu 1440
uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcggca aaaaacaaaa 1500
aacaaaacgg cuauuaugcg uuaccggcga gacgcuacgg acuua 1545
<210> 73
<211> 1611
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 73
aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc acgccggaaa 60
cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240
cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660
accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaaauguaca gcaugcagcu ggccagcugc gugacccuga 900
cccuggugcu gcuggugaac agcgccccca ccagcagcag caccagcagc agcaccgccg 960
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uggaccugca ggagcugcug agcaggaugg agaacuacag gaaccugaag cugcccagga 1080
ugcugaccuu caaguucuac cugcccaagc aggccaccga gcugaaggac cugcagugcc 1140
uggaggacga gcugggcccc cugaggcacg ugcuggaccu gacccagagc aagagcuucc 1200
agcuggagga cgccgagaac uucaucagca acaucagggu gaccguggug aagcugaagg 1260
gcagcgacaa caccuucgag ugccaguucg acgacgagag cgccaccgug guggacuucc 1320
ugaggaggug gaucgccuuc ugccagagca ucaucagcac cagcccccag ugauaauagc 1380
aaacaccauu gucacacucc agcuggagcc ucgguggcca ugcuucuugc cccuugggcc 1440
caaacaccau ugucacacuc caucccccca gccccuccuc cccuuccugc acccguaccc 1500
cccaaacacc auugucacac uccagugguc uuugaauaaa gucugagugg gcggcaaaaa 1560
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<210> 74
<211> 2382
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 74
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cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
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cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
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cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
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accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
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ccgugcugca gagcagcggc cuguacagcc ugagcagcgu ggugaccgug cccagcagca 1440
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aaaacggcua uuaugcguua ccggcgagac gcuacggacu ua 2382
<210> 75
<211> 1683
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 75
aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc acgccggaaa 60
cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
aucacgguac cuuugugcgc cuguuuuaua cuuccucccc caacugcaac uuagaaguaa 240
cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
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cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
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auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
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cccagccccu ccuccccuuc cugcacccgu acccccgugg ucuuugaaua aagucugagu 1620
gggcggcaaa aaacaaaaaa caaaacggcu auuaugcguu accggcgaga cgcuacggac 1680
uua 1683
<210> 76
<211> 2448
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 76
aaaauccguu gaccuuaaac ggucgugugg guucaagucc cuccaccccc acgccggaaa 60
cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
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cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
accccggacu gaguaucaau agacugcuca cgcgguugaa ggagaaaacg uucguuaucc 360
ggccaacuac uucgagaaac cuaguaacgc cauggaaguu guggaguguu ucgcucagca 420
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ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
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auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaacaggugc agcuggugga gagcggcggc ggcguggugc 900
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gggaggagca guacaacagc accuacaggg uggugagcgu gcugaccgug cugcaccagg 1800
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<210> 77
<211> 1749
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 环状RNA分子序列
<400> 77
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cgcaauagcc gaaaaaacaa aaacaaaaaa aacaaaaaaa caaaaaaaaa accaaaacac 120
auuaaaacag ccuguggguu gaucccaccc acagggccca cugggcgcua gcacucuggu 180
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cacaaaccga ucaacaguca gcguggcaca ccagccacgu uuugaucaaa cacuucuguu 300
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cuaccccagu guagaucagg uugaugaguc accgcauucc ccacggguga ccguggcggu 480
ggcugcguug gcggccugcc cauggggaaa cccaugggac gcucuuauac agacauggug 540
cgaagagucu auugagcuag uugguagucc uccggccccu gaaugcggcu aaucccaacu 600
gcggagcaua cacucucaag ccagagggua gugugucgua augggcaacu cugcagcgga 660
accgacuacu uugggugucc guguuucauu uuauuccuau acuggcugcu uauggugaca 720
auugagagau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugacuaa cagagcuauu 780
auauaucuuu uuguuggguu uauaccacuu agcuugaaag agguuaaaac ucuacauuac 840
auuuuaauac ugaacaccgc aaagagaucg ugcugaccca gagccccggc acccugagcc 900
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ucagcagggc caccggcauc cccgacaggu ucagcggcag cggcagcggc accgacuuca 1080
cccugaccau cagcaggcug gagcccgagg acuucgccgu guacuacugc cagcaguacg 1140
gcagcagccc cuggaccuuc ggccagggca ccaaggugga gaucaagagg accguggccg 1200
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acgcccugca gagcggcaac agccaggaga gcgugaccga gcaggacagc aaggacagca 1380
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<210> 78
<211> 741
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 78
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ccaacuacuu cgaaaaaccu aguaacaccg uggaaguugc agaguguuuc gcucagcacu 300
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<210> 79
<211> 682
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 79
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uauaccucuu uguuggauuu au 682
<210> 80
<211> 742
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 80
uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccac ugggcgcuag cacucuggua 60
ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauac uuccuccccc aacugcaacu uagaaguaac 120
acaaaccgau caacagucag cguggcacac cagccacguu uugaucaaac acuucuguua 180
ccccggacug aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaaacgu ucguuauccg 240
gccaacuacu ucgagaaacc uaguaacgcc auggaaguug uggaguguuu cgcucagcac 300
uaccccagug uagaucaggu ugaugaguca ccgcauuccc cacgggugac cguggcggug 360
gcugcguugg cggccugccc auggggaaac ccaugggacg cucuuauaca gacauggugc 420
gaagagucua uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua aucccaacug 480
cggagcauac acucucaagc cagaggguag ugugucguaa ugggcaacuc ugcagcggaa 540
ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauuccuaua cuggcugcuu auggugacaa 600
uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc ggugacuaac agagcuauua 660
uauaucuuuu uguuggguuu auaccacuua gcuugaaaga gguuaaaacu cuacauuaca 720
uuuuaauacu gaacaccgca aa 742
<210> 81
<211> 737
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 81
uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccau ugggcgcuag cacucuggua 60
ucacgguacc cuugugcgcc uguuuuaugu cccuucccuc aacuguaacu uagaaguaac 120
gcacaccgau caacagucag cguggcacac cagccauguu uugaucaagc acuucuguua 180
ccccggaccg aguaucaaca gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240
gccaacuacu ucgaaaaacc uaguaacacc auggaaguug cagaguguuu cgcucagcac 300
uaccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcaucccc cacgggcgac cguggcggug 360
gcugcguugg cggccugccu augggggaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420
gaagagucca uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480
cggagcacac accuucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540
ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauucuuaua cuggcugcuu auggugacaa 600
uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc agugacuagc agagcuauua 660
uauaccucuu uguuggguuu auaccaccua auuugaaaga aguuaaaaca uuagaauuca 720
uuauuaaauu gaauaca 737
<210> 82
<211> 683
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 82
uuaaaacagc cuguggguug cacccaccca cagggcccac agggcgcuag cacucuggua 60
ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauua ccccuucccc aauugaaaau uagaagcaau 120
gcacaccgau caacagcagg cguggcgcac cagucacguc ucgaucaagc acuucuguuu 180
ccccggaccg aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240
gcuaaccacu ucgagaaacc caguaacacc augaaaguug caggguguuu cgcucagcac 300
uuccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcguuccc cacgggcgac cguggcggug 360
gcugcguugg cggccugccu auggguuaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420
gaagaguuua uugagcuggu uaguaucucc uccggccccu gaaugcggcu aauccuaacu 480
gcggagcaca cacccucaag ccagagggca gugugucgua acgggcaacu cugcagcgga 540
accgacuacu uugggugucc guguuuccuu uuauucuuau acuggcugcu uauggugaca 600
aucgaggaau uguuaccaua uagcuauugg auuggccauc cggugucuaa cagagcgauu 660
auauaccucu uuguuggauu uau 683
<210> 83
<211> 742
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 83
uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccac ugggcgcuag cacucuggua 60
ucacgguacc uuugugcgcc uguuuuauac uuccuccccc aacugcaacu uagaaguaac 120
acaaaccgau caacagucag cguggcacac cagccacguu uugaucaaac acuucuguua 180
ccccggacug aguaucaaua gacugcucac gcgguugaag gagaaaacgu ucguuauccg 240
gccaacuacu ucgagaaacc uaguaacgcc auggaaguug uggaguguuu cgcucagcac 300
uaccccagug uagaucaggu ugaugaguca ccgcauuccc cacgggugac cguggcggug 360
gcugcguugg cggccugccc auggggaaac ccaugggacg cucuuauaca gacauggugc 420
gaagagucua uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480
cggagcacac acccucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540
ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauuccuaua cuggcugcuu auggugacaa 600
uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc ggugacuaac agagcuauua 660
uauaucuuuu uguuggguuu auaccacuua gcuugaaaga gguuaaaacu cuacauuaca 720
uuuuaauacu gaacaccgca aa 742
<210> 84
<211> 737
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES元件序列
<400> 84
uuaaaacagc cuguggguug aucccaccca cagggcccau ugggcgcuag cacucuggua 60
ucacgguacc cuugugcgcc uguuuuaugu cccuucccuc aacuguaacu uagaaguaac 120
gcacaccgau caacagucag cguggcacac cagccauguu uugaucaagc acuucuguua 180
ccccggaccg aguaucaaca gacugcucac gcgguugaag gagaaagugu ucguuauccg 240
gccaacuacu ucgaaaaacc uaguaacacc auggaaguug cagaguguuu cgcucagcac 300
uaccccagug uagaucaggu cgaugaguca ccgcaucccc cacgggcgac cguggcggug 360
gcugcguugg cggccugccu augggggaac ccauaggacg cucuaauaca gacauggugc 420
gaagagucca uugagcuagu ugguaguccu ccggccccug aaugcggcua auccuaacug 480
cggagcacac acccucaagc cagagggcag ugugucguaa cgggcaacuc ugcagcggaa 540
ccgacuacuu uggguguccg uguuucauuu uauucuuaua cuggcugcuu auggugacaa 600
uugagagauu guuaccauau agcuauugga uuggccaucc agugacuagc agagcuauua 660
uauaccucuu uguuggguuu auaccaccua auuugaaaga aguuaaaaca uuagaauuca 720
uuauuaaauu gaauaca 737
<210> 85
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’间隔区序列
<400> 85
aaaaaacaaa aacaaaaaaa acaaaaaaac aaaaaaaaaa ccaaaacaca 50
<210> 86
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’间隔区序列
<400> 86
aaaaacaaaa aacaaaaaaa aaaccaaaaa aacaaaaaaa acaaaacaca 50
<210> 87
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’间隔区序列
<400> 87
aaaaaaacaa aaaaacaaaa caaac 25
<210> 88
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’间隔区序列
<400> 88
aaaaacaaaa aacaaaacaa ac 22
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’间隔区序列
<400> 89
aaaaaacaaa aaacaaaac 19
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一外显子序列
<400> 90
agacgctacg gactta 16
<210> 91
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二外显子序列
<400> 91
aaaatccgtt gaccttaaac ggtcgtgtgg gttcaagtcc ctccaccccc a 51
<210> 92
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’内含子序列
<400> 92
aataattgag ccttaaagaa gaaattcttt aagtggatgc tctcaaactc agggaaacct 60
aaatctagtt atagacaagg caatcctgag ccaagccgaa gtagtaatta gtaa 114
<210> 93
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’内含子序列
<400> 93
aacaatagat gacttacaac taatcggaag gtgcagagac tcgacgggag ctaccctaac 60
gtcaagacga gggtaaagag agagtccaat tctcaaagcc aataggcagt agcgaaagct 120
gcaagagaat g 131
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’同源臂序列
<400> 94
accgtcagtt gctcactgtg c 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’同源臂序列
<400> 95
accgtgctat gtccacgtgt c 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’同源臂序列
<400> 96
gcacagtgag caactgacgg a 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3’同源臂序列
<400> 97
gacacgtgga catagcacgg a 21
Claims (38)
1.一种环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包括编码目标多肽的编码区，和与所述编码区可操作地连接的表达调控元件；所述表达调控元件具有如下(i)-(ii)组成组中任一项所示的特性：
(i)使所述目标多肽在靶细胞或靶组织中的表达增强，
(ii)使所述目标多肽在非靶细胞或非靶组织中的表达减弱；
并且，所述环状RNA分子包含(ii)所示的表达调控元件，如(ii)所示的表达调控元件包含与miR-122的序列杂交的3个miRNA识别区；
所述(ii)所示的表达调控元件的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中***3个如SEQ ID NO：2所示的miRNA识别区的序列；
所述miRNA识别区***如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第88和第89位的核苷酸之间、第48和第49位的核苷酸之间和第9位和第10位的核苷酸之间。
2.根据权利要求1所述的环状RNA分子，其中，所述miRNA在所述非靶细胞或非靶组织中的表达水平高于所述miRNA在所述靶细胞或靶组织中的表达水平。
3.根据权利要求1所述的环状RNA分子，其中，所述miRNA在非肿瘤细胞或非肿瘤组织中的表达水平高于所述miRNA在肿瘤细胞或肿瘤组织中的表达水平。
4.根据权利要求1-3任一项所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包含与所述编码区可操作地连接的翻译起始元件。
5.根据权利要求4所述的环状RNA分子，其中，所述翻译起始元件位于所述编码区的上游，所述(ii)所示的表达调控元件位于所述编码区的下游。
6.根据权利要求4所述的环状RNA分子，其中，所述翻译起始元件为IRES元件。
7.根据权利要求6所述的环状RNA分子，其中，所述IRES元件包含如SEQ ID NO：78-81任一序列所组成的组中的一种或多种序列的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的环状RNA分子，其中，所述IRES元件选自如下(b1)-(b7)中的任一项：
(b1)包含如SEQ ID NO：78所示序列的核苷酸序列；
(b2)包含如SEQ ID NO：79所示序列的核苷酸序列；
(b3)包含如SEQ ID NO：80所示序列的核苷酸序列；
(b4)包含如SEQ ID NO：81所示序列的核苷酸序列；
(b5)包含如SEQ ID NO：82所示序列的核苷酸序列；
(b6)包含如SEQ ID NO：83所示序列的核苷酸序列；
(b7)包含如SEQ ID NO：84所示序列的核苷酸序列。
9.根据权利要求4所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括如下的一种或多种元件：5’间隔区、3’间隔区、第二外显子、第一外显子、所述(i)所示的表达调控元件。
10.根据权利要求9所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包括位于所述翻译起始元件上游的5’间隔区，和位于所述表达调控元件下游的3’间隔区。
11.根据权利要求10所述的环状RNA分子，其中，所述5’间隔区包含如SEQ ID NO：85-86任一序列所示的核苷酸序列。
12.根据权利要求10所述的环状RNA分子，其中，所述3’间隔区包含如SEQ ID NO：87-89任一序列所示的核苷酸序列。
13.根据权利要求9所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子还包括位于所述5’间隔区上游的第二外显子，和位于所述3’间隔区下游的第一外显子。
14.根据权利要求13所述的环状RNA分子，其中，所述第二外显子包含如SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的环状RNA分子，其中，所述第一外显子包含如SEQ ID NO：90所示的核苷酸序列。
16.根据权利要求1-3任一项所述的环状RNA分子，其中，所述目标多肽为具有疾病预防或治疗活性的多肽。
17.根据权利要求16所述的环状RNA分子，其中，所述目标多肽为具有肿瘤预防或治疗活性的多肽。
18.根据权利要求17所述的环状RNA分子，其中，所述具有肿瘤预防或治疗活性的多肽选自如下的一种或多种：细胞因子、抗原结合片段、免疫检查点抑制剂。
19.根据权利要求18所述的环状RNA分子，其中，所述细胞因子选自IL、IFN、TNF、GM-CSF、M-CSF中的一种或多种。
20.根据权利要求18所述的环状RNA分子，其中，所述抗原结合片段与如下的一种或多种肿瘤抗原特异性结合：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、AFP、CEA、PSCA、GD2、NKG2D、BCMA、EGFR、Her2、EGFRvⅢ、CD171、FAP、IL13Rα2、VEGFR1、VEGFR2、GPC-3、Mesothelin、claudin 18.2、EpCAM、MUC1、MUC16、EPHA2、EPHA3、CD133、PSMA。
21.根据权利要求18所述的环状RNA分子，其中，所述免疫检查点抑制剂为如下一种或多种免疫检查点蛋白抑制剂：PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。
22.根据权利要求1-3任一项所述的环状RNA分子，其中，所述环状RNA分子包含如SEQID NO：73、SEQ ID NO：76-77所示的核苷酸序列。
23.一种环化前体RNA分子，其中，所述环化前体RNA分子环化形成根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子。
24.根据权利要求23所述的环化前体RNA分子，其中，所述环化前体RNA分子包含如下的一种或多种元件：
5’同源臂、3’内含子、第二外显子、5’间隔区、翻译起始元件、表达调控元件、编码区、3’间隔区、第一外显子、5’内含子和3’同源臂。
25.一种重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子转录形成根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子。
26.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据权利要求25所述的重组核酸分子。
27.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子，根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子，根据权利要求25所述的重组核酸分子，或根据权利要求26所述的重组表达载体。
28.一种药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂或组合物包括根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子，根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子，根据权利要求25所述的重组核酸分子，权利要求26所述的重组表达载体，或根据权利要求27所述的重组宿主细胞。
29.根据权利要求28所述的药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂或组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
30.根据权利要求29所述的药物制剂或组合物，其中，所述药学上可接受的载体为包裹所述环状RNA分子、环化前体RNA分子、重组核酸分子、重组表达载体、或重组宿主细胞的脂质体材料。
31.根据权利要求28-30任一项所述的药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、丸剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、口服溶液、吸入剂、混悬剂或干悬剂。
32.根据权利要求31所述的药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂为注射剂。
33.根据权利要求31所述的药物制剂或组合物，其中，所述药物制剂为向肿瘤的瘤内递送的药物制剂。
34.根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子，根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子，根据权利要求25所述的重组核酸分子，权利要求26所述的重组表达载体，根据权利要求27所述的重组宿主细胞，或根据权利要求28-33任一项所述的组合物或药物制剂在制备预防或治疗疾病的药物中的应用。
35.根据权利要求34所述的应用，其中，所述应用为制备预防或***的药物中的应用。
36.根据权利要求34所述的应用，其中，所述应用为制备预防或***的瘤内注射剂中的应用。
37.根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子，根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子，根据权利要求25所述的重组核酸分子，权利要求26所述的重组表达载体，根据权利要求27所述的重组宿主细胞，或根据权利要求28-33任一项所述的组合物或药物制剂在制备通过以下方法用于预防或治疗疾病的药物中的用途，其中，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-22任一项所述的环状RNA分子，根据权利要求23或24所述的环化前体RNA分子，根据权利要求25所述的重组核酸分子，根据权利要求26所述的重组表达载体，根据权利要求27所述的重组宿主细胞，或根据权利要求28-33任一项所述的组合物或药物制剂；
所述施用选自口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠、肿瘤瘤内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或***性施用。
38.根据权利要求37所述的用途，其中，所述施用为肿瘤瘤内注射。
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