CN112292447B - 脐带间充质干细胞及其细胞膜片的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种脐带间充质干细胞的制备方法，其能够显著提高细胞得率。一种脐带间充质干细胞膜片及其制备方法。所述脐带间充质干细胞膜片含有脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的全部细胞外基质和生长因子，该制备方法在不使用酶及类似物消化且不通过物理剥离的情况下，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离，得到片层状的细胞膜片。

Description

脐带间充质干细胞及其细胞膜片的制备方法

本申请要求于2019年02月28日递交的申请号为CN 201910149006.8，发明名称为“脐带间充质干细胞及其细胞膜片的制备方法”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。

技术领域

本公开涉及再生医学及细胞生物学领域，尤其涉及一种产生脐带间充质干细胞的方法，以及一种脐带间充质干细胞膜片及其制备方法。

背景技术

脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。目前常用的分离脐带组织的方法有两种，酶消化和组织块贴壁；酶消化成本高操作复杂不易控制，容易对细胞造成损伤或细胞突变临床应用风险高，组织块突变法，操作简单，成本低对细胞损伤较小，适合临床应用。然而，常规的组织块贴壁得到的脐带间充质干细胞周期较长，导致原代细胞数量少，纯度低对临床应用细胞数量不能达到国际标准，导致临床应用困难。因此，本领域需要一种具备高得率的脐带间充质干细胞制备方法。

此外，目前脐带间充质干细胞在自身组织修复的基础研究和临床应用中，主要采用细胞悬浮液直接注射或者与组织工程支架材料结合后移植的方案，这两者均具有一定的局限性。干细胞悬液直接注射会导致大量干细胞丢失，细胞利用率低，干细胞发挥组织修复的功能有限；而细胞与组织工程支架结合后进行移植虽然解决了细胞丢失的问题，但是支架材料在生物体内可能会引起不同程度的炎症反应，且材料的降解产物可能改变局部组织的微环境，引发更严重的病变。

细胞膜片(cell sheet)技术是一种新的干细胞移植及应用的技术。细胞膜片是通过细胞自身分泌的细胞外基质形成内源性支架，有利于细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的交互作用和遗传信息的传递。从一定意义上讲，细胞膜片工程能够最大限度地模拟胚胎发育组织形成的过程，其作用和价值远远超过所有的外源性生物支架材料。

发明内容

在第一方面，本公开提供了一种产生脐带间充质干细胞的方法，其通过分批加入培养基，显著提高了细胞得率(即，细胞一代的扩增倍数)。具体地，本公开的产生脐带间充质干细胞的方法包括以下步骤：a.将脐带组织块铺于培养容器中；b.以分批补料方式加入完全培养基进行培养；c.分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，在步骤b中将所述完全培养基以2-5次分批添加至所述培养容器中，其中除最后一次添加外，以保持所述脐带组织块湿润但不覆盖脐带组织块的量添加所述完全培养基；并且在最后一次添加时以覆盖所述脐带组织块的量添加所述完全培养基。

在某些实施方案中，在步骤b中将所述完全培养基以3次或4次分批添加至所述培养容器。

在某些实施方案中，在步骤b中以12-36小时的时间间隔，例如约24小时的时间间隔分批添加所述完全培养基。

在某些实施方案中，步骤a包括：

a1.从脐带组织分离华通氏胶；

a2.将所述华通氏胶切碎以获得组织块；和

a3.将所述组织块铺于培养容器中。

在某些实施方案中，步骤c包括：

c1.当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞时，移除所述组织块，并向所述培养容器中加入适量的完全培养基继续培养；

c2.分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(1)从脐带组织分离华通氏胶；

(2)将所述华通氏胶切碎以获得组织块；

(3)将所述组织块铺于培养容器中；

(4)向步骤(3)所述的组织块滴加适量的完全培养基，并进行培养；

(5)向步骤(4)所述的组织块滴加适量的完全培养基，并继续培养；

(6)向所述培养容器中加入适量的完全培养基以覆盖组织块，并继续培养；

(7)当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞时，移除所述组织块，并向所述培养容器中加入适量的完全培养基继续培养；

(8)分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，步骤(7)中所述的附着于培养容器的细胞即为P0代的脐带间充质干细胞。在某些实施方案中，当步骤(7)中所述的附着于培养容器的细胞的汇合度不低于约80％(例如不低于约85％，不低于约90％，或不低于约95％)时，可以将该细胞与培养容器分离，从而获得P0代的脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述完全培养基选自包含10％胎牛血清的DMEM/F12、αMEM或DMEM。

在某些实施方案中，所述完全培养基是包含血清替代物的无血清培养基。

在某些实施方案中，所述完全培养基包含无血清培养基Lonza(12-725f)和血清替代物Pall(15950-017)。

在某些实施方案中，在步骤(1)之前，所述方法还包括以下步骤：(i)提供新鲜脐带组织；(ii)洗涤所述脐带组织，以去除血污。在某些实施方案中，使用PBS缓冲液或生理盐水洗涤脐带组织。在某些实施方案中，所述PBS缓冲液或生理盐水不含有链霉素和青霉素。

在某些实施方案中，在步骤(1)中，通过下述步骤分离华通氏胶：去除脐带组织的脐带外膜和血管，剥离华通氏胶。

在某些实施方案中，在步骤(2)中，使用无菌剪将所述华通氏胶剪碎成组织块。

在某些实施方案中，所述组织块的体积为约1-2mm³。

在某些实施方案中，在步骤(3)中，所述培养容器为细胞培养皿。

在某些实施方案中，所述培养容器为直径为100mm的细胞培养皿。

在某些实施方案中，将组织块按照约2-30mm的间距均匀铺在培养容器中。

在某些实施方案中，在步骤(4)-(7)中，所述培养条件为37℃、5％CO₂。

在某些实施方案中，在步骤(4)-(7)中，在37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。

在某些实施方案中，在步骤(4)中，所述培养时间为约24h。

在某些实施方案中，在步骤(4)中，所述完全培养基的量为约20-100μl。

在某些实施方案中，在步骤(5)中，所述培养时间为约24h。

在某些实施方案中，在步骤(5)中，所述完全培养基的量为约20-200μl。

在某些实施方案中，在步骤(6)中，所述培养时间为约3-5天。

在某些实施方案中，在步骤(6)中，所述完全培养基的量为约3ml。

在某些实施方案中，在步骤(7)中，所述完全培养基的量为约5ml。

在某些实施方案中，在步骤(7)之后，所述方法还包括以下步骤：当细胞汇合度大于或等于约85％(例如，大于或等于约90％，大于或等于约95％，或大于或等于约100％)时，对所述细胞进行传代。

在某些实施方案中，以约1×10⁶/ml的细胞密度进行传代。

对细胞进行传代的方法是本领域技术人员熟知的。例如，该方法可以包括：将细胞与培养容器分离并将细胞均匀分散于培养基中，然后接种于培养容器中。加入适量培养基，根据细胞生长状态每1～5天更换适量新鲜的培养基，待细胞长至70～100％汇合时，重复传代操作。细胞每次进行传代操作，代数增加1。脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。

在某些实施方式中，将细胞与培养容器分离的方法包括但不限于胰酶及类似物质消化、使用细胞刮等。

在某些实施方式中，将细胞通过搅拌、涡旋等方法均匀分散于培养基中，然后接种。

任选地，在培养获得脐带间充质干细胞之后，可以通过MTT法、WST法、DNA含量检测法、ATP检测法等测定细胞生长曲线，以评估脐带间充质干细胞的生长活性。另外，可通过流式细胞术检测细胞表面标志物、三向分化测定以及PCR法检测细胞表达基因来鉴定所分离培养的脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，在步骤(8)之后，所述方法还包括冻存所述脐带间充质干细胞的步骤。

在某些实施方案中，以约2×10⁶/ml的细胞密度进行冻存。

在第二方面，本公开提供了一种制备脐带间充质干细胞膜片的方法，其特征在于：不使用酶及类似物消化，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离而形成脐带间充质干细胞膜片。

具体地，本公开的制备脐带间充质干细胞膜片的方法包括以下步骤：

将包被液加入温敏培养皿中进行孵育，所述包被液包含血清；

将脐带间充质干细胞加入上述温敏培养皿中进行培养；

将预冷的缓冲液加入上述温敏培养皿中，脐带间充质干细胞及其分泌的细胞外基质成片层状脱离，得到脐带间充质干细胞膜片。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞是通过本公开的第一方面的方法制备的。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞是传代数为P0-P20的脐带间充质干细胞，例如传代数为P2-P10的脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，将脐带间充质干细胞的细胞悬液加入温敏培养皿中进行培养。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞是P0-P20代的脐带间充质干细胞。在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞是P2-P10代的脐带间充质干细胞。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞通过第一方面所述的方法产生。

本文所述的“温敏培养皿”是指表面涂覆了温度敏感性高分子物质的培养皿，该高分子物质在不同温度下分子链段的伸展情况不同，从而表现出亲水性或疏水性，使得该高分子物质的亲疏水性能够随外部温度变化而变化。当温敏培养皿表面呈现亲水性时，与细胞及其分泌的细胞外基质粘合性变差，细胞将成层状脱落。在具体实施方式中，当降低温度至该高分子物质的低临界溶解温度(LCST)之下，该温敏培养皿表面呈现亲水性，从而使得细胞将成层状脱落。

本公开利用温敏培养皿，成功实现了在不使用酶及类似物消化也不使用物理方法剥离的情况下的将形成片层状的间充质干细胞从温敏培养皿底部脱离，成为保留有细胞外基质完整连结的细胞膜片。

在某些实施方案中，所述血清选自胎牛血清(FBS)或分离自人外周血的血清。在某些实施方案中，所述分离自人外周血的血清是自体的，也即，是分离自自体外周血的血清。本文所述的“自体的”是指，该分离自人外周血的血清从受试者获得并分离，并且使用该血清获得的脐带间充质干细胞膜片给予至同一受试者，即供体和受体是相同的。在此类实施方案中，不受理论的约束，认为自体血清的使用将会预期降低或消除来自该受试者的免疫反应。

在某些实施方案中，所述包被液是100％血清。包被液中所含有的粘附因子的量及包被时间直接影响细胞膜片的形成，例如如果粘附因子太少，则不能很好的粘附细胞，而如果粘附因子过多，又会阻碍细胞的生长，因此控制好粘附因子的量及其作用时间对于细胞膜片的形成至关重要。本申请的发明人出乎意料地发现，当使用100％血清、包被12-24h时，包被体系中的粘附因子的含量既适合细胞贴壁，也适合细胞生长，从而有利于膜片的形成。

在某些实施方案中，所述包被液是包含至少10％(v/v)(例如至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％)血清的基础培养基。在一些实施方案中，所述基础培养基选自DMEM/F12、αMEM或DMEM。在此类实施方案中，所述血清是FBS。

在另一些实施方案中，所述基础培养基是无血清培养基(SFM)，例如Lonza(12-725f)。在此类实施方案中，所述血清是来自人外周血的血清。

在某些实施方案中，所述包被液的量为约0.05-0.3ml/cm²(培养皿底面积)，例如为约0.09ml/cm²，约0.14ml/cm²，或约0.25ml/cm²。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为100mm时，所述包被液的量为约5ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为60mm时，所述包被液的量为约3ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为35mm时，所述包被液的量为约2ml。

在某些实施方案中，包被时间为约12-24h。在某些实施方案中，包被条件为37℃、5％CO₂。

在某些实施方案中，将所述包被液加入温敏培养皿中；将所述温敏培养皿放置于37℃、5％CO₂的培养箱中，孵育约12-24h；任选地，弃去所述温敏培养皿中残存的包被液。

在某些实施方案中，将脐带间充质干细胞的细胞悬液以约1×10⁶-1×10⁷个细胞/cm²(例如约2×10⁶-4×10⁶个/cm²，约2.5×10⁶-6.0×10⁷个/cm²，约5.5×10⁶-6.5×10⁶个/cm²)的密度加入所述温敏培养皿中。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为100mm时，接种细胞浓度为：约6×10⁷-7×10⁷个/ml，接种体积为约5ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为60mm时，接种细胞浓度为：约2×10⁷-4×10⁷个/ml，接种体积为约3ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为35mm时，接种细胞浓度为：约8×10⁶-1.5×10⁷个/ml，接种体积为约2ml。

在某些实施方案中，所述细胞悬液是包含脐带间充质干细胞的完全培养基。在一些实施方案中，所述完全培养基选自包含10％胎牛血清的DMEM/F12、αMEM或DMEM。在另一些实施方案中，所述完全培养基是包含血清替代物的无血清培养基，例如包含血清替代物Pall(15950-017)的无血清培养基Lonza(12-725f)。

在某些实施方案中，培养条件为12-36h。在某些实施方案中，培养条件为37℃、5％CO₂。

在某些实施方案中，所述缓冲液选自HBSS、PBS或生理盐水。在某些实施方案中，加入4℃预冷的缓冲液(例如，HBSS、PBS或生理盐水)。当加入预冷的缓冲液后，成片层状的脐带间充质干细胞将逐渐从温敏培养皿底面脱离，成为保留有细胞外基质完整连结的细胞膜片。

在某些实施方案中，所述预冷的缓冲液的量为约0.05-0.3ml/cm²(培养皿底面积)，例如为约0.09ml/cm²，约0.14ml/cm²，或约0.25ml/cm²。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为100mm时，所述缓冲液的量为约5ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为60mm时，所述缓冲液的量为约3ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为35mm时，所述缓冲液的量为约2ml。

在某些实施方案中，所述方法还包括将所述脐带间充质干细胞膜片转移至储存容器中的步骤。在某些实施方案中，所述储存容器是细胞培养皿。

在一些实施方案中，可以通过下述步骤将所述脐带间充质干细胞膜片转移至储存容器中：使用剪刀(例如无菌的)剪去移液器吸头(例如1ml吸头)端部约1/3；使用该剪短的吸头并通过移液器吸住膜片，并将膜片转移至储存容器中。

在另一些实施方案中，可以通过下述步骤将所述脐带间充质干细胞膜片转移至储存容器中：将所述温敏培养皿中的液体连同细胞膜片一起倒入储存容器中。当倾倒温敏培养皿时，已脱离皿底的细胞膜片随着液体的流动一起流至储存容器中。在该转移过程中，由于细胞膜片漂浮在液体之上，保证了细胞膜片不会直接粘到温敏培养皿或储存容器的边缘，从而防止细胞膜片发送撕裂或损坏。

在某些实施方案中，待转移细胞膜片所在温敏培养皿中的液体量(也即，缓冲液的量)维持在约0.05-0.4ml/cm²(培养皿底面积)，例如为约0.09-0.18ml/cm²，约0.14-0.24ml/cm²，或约0.25-0.38ml/cm²。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为100mm时，所述液体量为约5-10ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为60mm时，所述液体量为约3-5ml。在某些实施方案中，当温敏培养皿直径为35mm时，所述液体量为约2-3ml。

在另一些实施方案中，可以使用膜片铲将所述脐带间充质干细胞膜片铲起并转移至储存容器中。所述膜片铲是能够用于细胞的任何铲类制品，例如专门的膜片铲或细胞染色铲。

在第三方面，本公开提供了一种脐带间充质干细胞膜片，其通过第二方面所述的方法制备。通过本公开的方法制备的脐带间充质干细胞膜片含有脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的全部细胞外基质和生长因子。另外，由于未使用酶及类似物消化也未使用物理方法剥离，本公开的脐带间充质干细胞膜片中的脐带间充质干细胞密度高，膜片厚度均一，边缘整齐。本公开的脐带间充质干细胞膜片能够分泌包括血管生成和免疫调节在内的多种细胞因子，参与组织器官的修复。

任选地，在制备得到脐带间充质干细胞膜片之后，可以通过扫描电子显微镜观察细胞膜片的表面结构。另外，可以检测细胞膜片分泌的细胞因子数量，细胞膜片中细胞外基质所含蛋白情况等。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片具有在制备过程中不接触培养皿的表面和接触培养皿的基底面，所述表面较光滑且所述基底面较粗糙。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片包含基本上呈现具有一致细胞方向性的单层或多层互连细胞结构，并且基本上保留了脐带间充质干细胞分泌的细胞外基质。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片至少在其基底表面分布有细胞外基质(例如，一层基本上连续的细胞外基质)。在某些实施方案中，所述细胞外基质包含聚胺基酸、胶原蛋白、聚多糖、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层连结蛋白中的至少一种，例如可以是纤维连接蛋白和层连接蛋白的混合物。在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片所包含的脐带间充质干细胞间的连接位置包含上述物质。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片富含纤粘蛋白和整联蛋白β1。

在某些实施方案中，所述脐带间充质干细胞膜片中的视网膜色素上皮细胞能够分泌多种血管生成因子和免疫调节因子。例如，所述血管生成因子和免疫调节因子可以包括肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种。

在第四方面，本公开涉及一种治疗受试者中心脏组织损伤或心功能不全相关的疾病的方法，所述方法包括对所述受试者的损伤部位局部应用本公开第二方面的脐带间充质干细胞膜片的步骤。

在某些实施方案中，所述疾病是心力衰竭。在某些实施方案中，所述心力衰竭是缺血性心力衰竭，例如急性缺血性心力衰竭。

在第五方面，本公开涉及本公开第二方面的脐带间充质干细胞膜片在治疗受试者中心脏组织损伤或心功能不全相关的疾病中的用途。

在第六方面，本公开涉及本公开第二方面的脐带间充质干细胞膜片在制备用于在受试者中治疗心脏组织损伤或心功能不全相关的疾病的组合物中的用途。

在第五方面和第六方面的某些实施方案中，所述疾病是心力衰竭。在某些实施方案中，所述心力衰竭是缺血性心力衰竭，例如急性缺血性心力衰竭。

本公开利用分批加入培养基的方式，显著提高了间充质干细胞的细胞得率。细胞得率越高得到的细胞越多，更容易满足临床治疗的用量。

本公开利用温敏培养皿，并且通过控制包被温敏培养皿过程中血清用量及包被时间，在不使用酶及类似物消化且不通过物理剥离的情况下，将脐带间充质干细胞及其在增殖过程中分泌的细胞外基质和生长因子完全保留并从培养皿表面分离，得到片层状的细胞膜片。该方法得到的细胞膜片细胞密度高、厚度均一、结构完整。通过本公开的方法制备得到的脐带间充质干细胞膜片具有丰富的天然细胞外基质，并且可以保留大部分纤维连接蛋白和层黏连蛋白，在体内移植时可不用缝合，膜片中的粘附分子和细胞外基质可直接黏附于病变组织，使细胞百分之百的作用于机体受损的部位，从而提高细胞移植对组织的再生修复效果和移植的细胞更好保留其活性。

附图说明

图1分别示出了原代第0天、原代第5天、以及脐带间充质干细胞P0的代表性照片。其中，原代是指脐带组织块，P0是指已从组织块中爬出但未经传代的脐带间充质干细胞。

图2分别示出了脐带间充质干细胞P2第5天的×4倍物镜及×10倍物镜下的代表性照片。

图3示出了脐带间充质干细胞表面标志物的流式检测结果。

图4示出了脐带间充质干细胞成脂、成骨分化功能检测结果。

图5示出了脐带间充质干细胞膜片的代表性照片。

图6示出了脐带间充质干细胞膜片的扫描电镜成像照片。图6A：细胞膜片的表面(上表面)。图6B：细胞膜片的基底面。

图7示出了脐带间充质干细胞膜片的免疫荧光成像照片。图7A：纤粘蛋白。图7B：整联蛋白β1。

图8示出了使用ELISA方法检测视脐带间充质干细胞膜片培养上清液中的细胞因子表达的结果。

图9示出了构建的心力衰竭小鼠疾病模型的表征。图9A：疾病模型小鼠的心脏照片；图9B：疾病模型小鼠的心电图结果。

图10示出了不同时间点的小鼠超声心动图结果。图10A：建模前；图10B：建模后1周；图10C：建模后4周。左侧：对照组动物；右侧：细胞膜片移植组动物。

图11示出了建模前后小鼠左心室射血分数随时间变化的曲线。

图12示出了建模前后小鼠左心室短轴缩短指数随时间变化的曲线。

图13示出了建模前后小鼠左心室内径随时间变化的曲线。

图14示出了建模前后小鼠左心室容积随时间变化的曲线。

图15示出了实验结束时(建模后第28天)，小鼠心脏组织切片的Masson染色结果图。左侧：对照组动物；右侧：细胞膜片移植组动物。

具体实施方式

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1.脐带间充质干细胞的分离及培养

使用不含青链双抗的1xPBS缓冲液反复冲洗新鲜脐带，去除血污。去除脐带外膜和血管留取脐带组织内的华通氏胶样组织。用无菌剪剪碎成1-2mm³的组织块，平铺于100mm培养皿中，每个组织块滴加完全培养基20-100ul放置于37℃、5％CO₂培养箱中。24小时后再滴加20-200ul完全培养基。48小时培养皿中加入3ml完全培养基。3-5天细胞爬出可换液，去掉组织块，每个培养皿中加入5ml培养基。待细胞长至85％汇合时，进行传代，细胞传代密度为1×10⁶。细胞每次进行传代操作，代数增加1。脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。P0和P2代脐带间充质干细胞的代表性图片如图1-2所示。经检测，该方法的细胞得率为8.3倍，一般方法的细胞得率是3-5倍。

实施例2.脐带间充质干细胞的鉴定

2.1脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定

将脐带间充质干细胞分散于培养基中后离心，用血清或血清蛋白含量为1～20％的与等渗生理溶液中，根据所购买的试剂说明书对细胞表面标记蛋白进行染色，包括但不限于CD73、CD90、CD105、CD34、CD11B、CD19、CD45、HLA-DR。其中CD73、CD90、CD105的表型为阳性，其比率应不小于95％，CD34、CD11B、CD19、CD45、HLA-DR的表型为阴性，其比率应不大于2％。结果如图3所示，其中，CD105/CD34 99.64％/0.02％，CD105/CD31 99.04％/0.00％，CD105/CD117 95.53％/0.51％。

2.2脐带间充质干细胞的三向诱导分化

将实施例1制备的脐带间充质干细胞按照三向诱导分化试剂说明书的比例接种于合适的培养器皿中，待成骨诱导检测的细胞生长至50～90％汇合，成脂肪诱导检测的细胞生长至90％以上汇合时，分别加入成骨和成脂肪诱导培养基。成软骨诱导时将一定数量的细胞离心至离心管底部，而后加入成软骨诱导培养基，待细胞团成小球后，使细胞小球离开管底，保证与诱导培养基完全接触。

诱导培养7天以上时对细胞进行检测。成骨诱导可用包括但不限于茜素红、anti-Osteocalcin染色，成脂肪诱导可用包括但不限于油红O、anti-mFABP4染色，成软骨诱导可以用包括但不限于阿尔新蓝、番红O、anti-Aggrecan染色。

成骨分化(茜素红染色)及成脂分化(油红O染色)结果如图4所示。

实施例3.脐带间充质干细胞膜片制备

1、血清包被：用100％血清包被温敏培养皿，不同培养皿中添加量如下：35mm/2ml、60mm/3ml、100mm/5ml。包被时间和温度：12-24h，37℃、5％CO₂培养箱中。

2、细胞培养：包被完成后，弃去培养皿内的液体，接种实施例1获得的脐带间充质干细胞，细胞接种浓度：35mm皿接种细胞浓度为：8×10⁶--1.5×10⁷个/ml，60mm皿接种细胞浓度为：2×10⁷--4×10⁷个/ml，100mm皿接种细胞浓度为：6×10⁷--7×10⁷个/ml。37℃、5％CO₂培养箱培养12-36h。

3、膜片剥离：培养箱中取出温皿，吸弃培养基；加入4℃预冷的HBSS液：35mm/2ml、60mm/3ml、100mm/5ml；10--30分钟后成片层状的脐带间充质干细胞将从皿边缘开始脱离，成为保留有细胞外基质完整连结的细胞膜片，细胞膜片宏观形貌如图5所示，脐带间充质干细胞膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。

4、膜片转移：将完全剥离的细胞膜片移至普通培养皿中，加入HBSS液洗膜片2-3次：35mm/2ml、60mm/3ml、100mm/5ml。

5、制备完成的膜片4℃暂存。

实施例4.脐带间充质干细胞膜片的结构表征

在本实施例中，使用扫描电镜和免疫荧光成像对制备的脐带间充质干细胞膜片的结构进行表征。

首先，通过如实施例3中所述的方法制备脐带间充质干细胞膜片。使细胞膜片从温敏智能培养皿底部脱离，形成的膜片保留有细胞外基质完整连接。将细胞膜片经2.5％戊二醛固定、酒精梯度脱水和风干等步骤制样后进行扫描电镜拍摄。如图6所示，细胞膜片具有不与培养皿接触的表面(上表面，图6A)和与培养皿接触的基底面(下表面，图6B)，其结构上存在差异：表面由于细胞自然沉降，形成的表面较光滑；基底面与温皿材料接触，相对较粗糙。由于其结构特征，基底面可以提供较大的摩擦力，有利于细胞膜片应用时更好地贴附于应用部位。

进一步通过免疫荧光的方法检测了脐带间充质干细胞膜片中的纤连蛋白和整合素β1的表达情况。膜片经固定液固定后进行冰冻切片，使用荧光素标记的纤连蛋白和整合素β1抗体进行染色，并进行免疫荧光成像分析。结果如图7所示，通过本公开的方法制备得到的细胞膜片含有大量的纤连蛋白(图7A)和整合素β1(图7B)。

纤连蛋白广泛存在于动物组织和组织液中，具有促进细胞的黏连生长的功能，而细胞的黏连生长是维持和修复机体组织结构的必要条件。整合素β1是整合素家族的重要成员，其在介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互黏附，以及细胞与ECM之间的双向信号传导方面具有重要作用，并与组织修复和纤维化形成紧密相关。上述结果表明，本公开的脐带间充质干细胞膜片并非是细胞简单地堆积而成，而是通过细胞外基质连接形成的具有致密组织性和生物活性的膜片。并且，该细胞膜片中高水平的纤连蛋白和整合素β1表达表明其具有组织修复的功能，能够用于与例如心脏、肝脏、胰脏和子宫的等组织的损伤相关的疾病中以实现组织修复。

实施例5.脐带间充质干细胞膜片的结构表征

为了进一步对本公开的脐带间充质干细胞膜片的功能进行表征，对其分泌的以下细胞因子进行了检测：肝细胞生长因子(HGF)；白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)。HGF由间充质干细胞产生并参与上皮-间充质转化(EMT)过程，其对多种组织和细胞具有调控作用，能够促进细胞运动和***；IL-6和IL-8参与调节机体免疫反应和免疫细胞的多种生理过程；VEGF具有促进内皮细胞增殖和诱导血管新生的功能。上述细胞因子具有促进细胞生长和分化和促进血管生成过程的功能，对于组织修复具有重要作用。

在细胞膜片的制备过程中取培养上清液，通过ELISA方法对上清液中的细胞因子进行检测，检测结果如图8所示。结果表明，上述四种细胞因子在上清液中均有表达，且HGF和IL-8的表达水平较高。上述结果表明，本公开的脐带间充质干细胞细胞膜片能够分泌多种细胞因子，包括血管生成因子和免疫调节因子，证明其具有高生物学活性和功能，能够促进局部血管生成和组织修复过程。并且，高IL-8表达水平表明细胞膜片在使用过程中具有促进免疫反应和抑制细菌的功能，有利于细胞膜片更好地发挥其生物学功能。

实施例6.脐带间充质干细胞膜片在治疗心力衰竭中的应用

在本实施例中，构建了心力衰竭小鼠疾病模型，并在该模型中评估本公开的脐带间充质干细胞膜片对心脏组织的修复功能。首先，在雄性C57BL/6小鼠(约12周龄)中通过冠状动脉结扎法构建急性缺血型心力衰竭动物模型，具体步骤包括：

(1)使用已异氟烷混合氧气(异氟烷浓度为约3.5-5％)的方式麻醉小鼠，进行脱毛处理；

(2)经颈透照直视进行气管插管，使用呼吸机泵入麻醉气体维持麻醉，并测量小鼠的心电信号；

(3)开胸并暴露心脏，使用7-0手术缝合线对小鼠左前降支(左心耳下缘约1.5mm处)进行结扎以建模；

(4)胸腔缝合和术后处理。

在步骤(3)建模后，观察到小鼠的左心室壁发白(图9A)；心电图结果显示ST段抬高，呈心肌梗死状态(图9B)，表明该心力衰竭动物模型建模成功。对于脐带间充质干细胞膜片治疗组小鼠，在步骤(3)后将裁剪成直径为约2-5mm的圆形或近似面积的适当形状的脐带间充质干细胞细胞膜片贴附于模型动物左心室表面。静置3-5分钟后进行上述步骤(4)。未贴附细胞膜片的动物作为对照。细胞膜片治疗组和对照组各10只小鼠。

在建模前(图10A)、建模后1周(图10B)和建模后4周(图10C)对小鼠进行超声心动检查，胸骨旁短轴切面以左心室***肌水平的切面为标志点可观察到超声心动图。从图10B和图10C中的结果可以看出，建模后心力衰竭模型动物的心脏有明显的运动减弱现象。并且，相比于对照组动物(左侧图)，细胞膜片移植组动物(右侧图)的心脏运动较强。

根据超声心动图计算并绘制了手术前后小鼠左心室射血分数随时间变化的曲线(图11)和左心室短轴缩短指数随时间变化曲线(图12)。左心室射血分数是评价左心室功能的重要指标。如图11中的结果所示，建模后心力衰竭模型动物的左心室射血分数值显著下降，但细胞膜片移植组动物的射血分数显著高于对照组动物。左心室短轴缩短指数是指左心室收缩和舒张时短轴比例，比例越大表明心脏收缩功能越强。如图12中的结果所示，建模后心力衰竭模型动物的左心室短轴缩短指数值有显著下降，但细胞膜片移植组动物的左心室短轴缩短指数值显著高于对照组动物。

还根据超声心动图计算并绘制了左心室内径随时间变化的曲线(图13)和左心室容积随时间变化曲线(图14)，两者均可用于描述左心室容积。在制备动物模型后，由于缺血性心力衰竭，左心室发生代偿性重构，心室体积变大。如图13和图14中的结果所示，建模后，细胞膜片移植组动物的左心室内径及容积(收缩期和舒张期)均显著低于对照组动物，说明细胞膜片的使用对抑制缺血性心力衰竭引起的左心室重构有显著的效果，能够明显提高心脏功能。

在实验结束时(建模后第28天)，处死小鼠并取心脏组织进行固定、切片和染色。切片结果(图15)显示，与对照组动物相比，间充质干细胞膜片移植组的小鼠左心室壁较厚，心室重构情况较轻，且纤维化程度较小(Masson染色,胶原纤维呈现蓝色)。上述结果表明，移植了细胞膜片的小鼠左心室的纤维化程度与对照组动物相比明显较低。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (33)

1.一种制备脐带间充质干细胞膜片的方法，其包括以下步骤：

通过以下步骤产生脐带间充质干细胞：

a. 将脐带组织块铺于培养容器中；

b. 以分批补料方式加入完全培养基进行培养；

c. 分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞；

其中在步骤b中以12-36小时的时间间隔将所述完全培养基以2-5次分批添加至所述培养容器中，其中除最后一次添加外，以保持所述脐带组织块湿润但不覆盖脐带组织块的量添加所述完全培养基；并且在最后一次添加时以覆盖所述脐带组织块的量添加所述完全培养基；

将包被液加入温敏培养皿中进行孵育，所述包被液是100%血清并且包被时间为12-24h，包被完成后弃去所述温敏培养皿中的包被液；

将脐带间充质干细胞的细胞悬液加入上述温敏培养皿中进行培养；

将预冷的缓冲液加入上述温敏培养皿中，脐带间充质干细胞及其分泌的细胞外基质成片层状脱离，得到脐带间充质干细胞膜片。

2.权利要求1所述的方法，其中在步骤b中将所述完全培养基以3次或4次分批添加至所述培养容器。

3.权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b中以24小时的时间间隔分批添加所述完全培养基。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤a包括：

a1. 从脐带组织分离华通氏胶；

a2. 将所述华通氏胶切碎以获得组织块；和

a3. 将所述组织块铺于培养容器中。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤c包括：

c1. 当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞时，移除所述组织块，并向所述培养容器中加入适量的完全培养基继续培养；

c2. 分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞。

6.权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤产生脐带间充质干细胞：

(1) 从脐带组织分离华通氏胶；

(2) 将所述华通氏胶切碎以获得组织块；

(3) 将所述组织块铺于培养容器中；

(4) 向步骤(3)所述的组织块滴加适量的完全培养基，并进行培养；

(5) 向步骤(4)所述的组织块滴加适量的完全培养基，并继续培养；

(6) 向所述培养容器中加入适量的完全培养基以覆盖组织块，并继续培养；

(7) 当所述组织块周围出现附着于培养容器的细胞时，移除所述组织块，并向所述培养容器中加入适量的完全培养基继续培养；

(8) 分离附着于培养容器的细胞，从而获得脐带间充质干细胞。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤c之后对所述脐带间充质干细胞进行传代的步骤。

8.权利要求7所述的方法，其中当所述脐带间充质干细胞汇合度大于或等于85%时对其进行传代。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述完全培养基选自包含10%胎牛血清的DMEM/F12、αMEM或DMEM。

10.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述完全培养基包含无血清培养基Lonza(12-725f)和血清替代物Pall(15950-017)。

11.权利要求6-10中任一项所述的方法，其中，在步骤(4)和/或步骤(5)中，所述培养时间为24h；和/或，所述完全培养基的量为20-100μl。

12.权利要求6-11中任一项所述的方法，其中，在步骤(6)中，所述培养时间为3-5天；和/或，所述完全培养基的量为3ml。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述血清选自胎牛血清或分离自人外周血的血清。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其具备以下特征中的一项或多项：

(1) 所述包被液的量为0.05-0.3ml/cm²(培养皿底面积)；

(2) 包被条件为37°C、5%CO₂。

15.权利要求14所述的方法，其中所述包被液的量为0.09ml/cm²、0.14ml/cm²、或0.25ml/cm²。

16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其具备以下特征中的一项或多项：

(1) 所述脐带间充质干细胞的细胞悬液以1×10⁶-1×10⁷个细胞/cm²的密度被加入所述温敏培养皿中；

(2) 所述细胞悬液是包含脐带间充质干细胞的完全培养基；

(3) 所述脐带间充质干细胞在所述温敏培养皿中的培养条件为12-36h；

(4) 所述脐带间充质干细胞在所述温敏培养皿中的培养条件为37°C、5%CO₂。

17.权利要求16所述的方法，其中所述完全培养基选自包含10%胎牛血清的DMEM/F12、αMEM或DMEM；或者，所述完全培养基是包含血清替代物Pall(15950-017)的无血清培养基Lonza(12-725f)。

18.权利要求1-17中任一项所述的方法，所述缓冲液选自HBSS、PBS或生理盐水。

19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将所述脐带间充质干细胞膜片转移至储存容器中的步骤。

20.权利要求19所述的方法，其中，使用剪刀剪去移液器吸头端部1/3；使用该剪短的吸头并通过移液器吸住脐带间充质干细胞膜片，并将脐带间充质干细胞膜片转移至储存容器中。

21.权利要求19所述的方法，其中，将所述温敏培养皿中的包被液连同脐带间充质干细胞膜片一起倒入储存容器中。

22.权利要求19所述的方法，其中，使用膜片铲将所述脐带间充质干细胞膜片铲起并转移至储存容器中。

23.通过权利要求1-22任一项所述的方法制备的脐带间充质干细胞膜片。

24.如权利要求23所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述细胞膜片具有在制备过程中不接触培养皿的表面和接触培养皿的基底面，所述表面较光滑且所述基底面较粗糙。

25.如权利要求23或24所述的脐带间充质干细胞膜片，其包含基本上呈现具有一致细胞方向性的单层或多层互连细胞结构，并且基本上保留了脐带间充质干细胞分泌的细胞外基质。

26.权利要求25所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述脐带间充质干细胞膜片至少在其基底表面分布有细胞外基质。

27.权利要求23-26中任一项所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述细胞膜片富含纤粘蛋白和整联蛋白β1。

28.权利要求23-27中任一项所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述细胞膜片中的脐带间充质干细胞能够分泌多种血管生成因子和免疫调节因子。

29.权利要求28所述的脐带间充质干细胞膜片，其中所述血管生成因子和免疫调节因子包括肝细胞生长因子(HGF)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种。

30.权利要求23-29中任一项所述的脐带间充质干细胞膜片在制备用于在受试者中治疗心脏组织损伤或心功能不全相关的疾病的组合物中的用途。

31.如权利要求30所述的用途，其中所述疾病是心力衰竭。

32.如权利要求31所述的用途，其中所述心力衰竭是缺血性心力衰竭。

33.如权利要求32所述的用途，其中所述缺血性心力衰竭是急性缺血性心力衰竭。

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