CN114578057A - 单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途及试剂盒 - Google Patents
单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了用于检测抗mCRP抗体的试剂盒,该试剂盒包含单体C反应蛋白(mCRP),以及提出了单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测待测样品中抗mCRP抗体的含量。发明人发现,当采用单体CRP(mCRP)检测待测样品中的抗mCRP抗体时,相比于现有技术,检测的准确度和灵敏度均得到显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途以及试剂盒。
背景技术
急性肾小管间质肾病(ATIN)是急性肾损伤的重要病因,占所有肾活检的1~3%,占肾实质性急性肾损伤(AKI)的15~27%。其病因主要包括药物、感染、肾小管间质性肾炎-眼色素膜炎(TINU)综合征、自身免疫以及特发等。
C反应蛋白(CRP)是一种进化过程中高度保守的急性期反应蛋白,在人体内有两种天然形式,五聚体CRP(pCRP)和单体CRP(mCRP)。我们的前期研究在国内首先应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)建立了抗mCRP抗体的检测方法,发现抗mCRP抗体在狼疮性肾炎中与肾小管间质损伤密切相关。生物学功能研究提示抗mCRP抗体可以抑制C1q与mCRP的结合,也可抑制mCRP与H因子的结合,且可对mCRP对巨噬细胞的调理作用有抑制作用,以上研究提示抗mCRP抗体可能与免疫性小管间质损伤有关。
为更好的明确抗mCRP抗体在小管间质病变中的作用,我们选用了TINU作为疾病模型,因其既是以肾间质损伤为主要病征,在其发病机制上又属于自身免疫性疾病,可作为一个较好的小管间质病变“模型”。我们发现TINU综合征患者中的抗mCRP抗体的阳性率非常高,可达100%,显著高于一般的间质性肾炎中的比例。进一步研究发现抗mCRP抗体与TINU综合征患者的疾病活动相关,抗体滴度在急性间质肾炎和眼色素膜炎发病时升高,在疾病缓解时降低。同时发现mCRP主要在肾小管上皮细胞、肾***内表达,小球基本无mCRP表达。提示在肾小管间质受累时,可出现局部CRP的高水平表达,且为具有隐匿性抗原表位的mCRP,而非五聚体CRP。与其它疾病对照相比,TINU综合征患者的mCRP表达水平显著高于其它肾小球肾炎和药物相关性的急性间质性肾炎,具有一定的特异性。我们又进行了mCRP与患者IgG的共定位研究,结果提示mCRP可能就是TINU综合征患者的眼、肾的共同靶抗原之一。
为了进一步验证抗mCRP在临床中的价值,申请人前瞻性地在肾活检证实的急性间质性肾炎患者中进行了抗mCRP抗体的检测,并对这些患者进行了长期随访,发现抗mCRP抗体阳性可预测晚发型TINU,对于明确急性间质性肾炎的病因起到了重要作用。对于mCRP抗原表位的研究也提示,抗mCRP35-47可以提示狼疮性肾炎的预后,更进一步说明其在疾病的发生和发展过程中起到了重要的作用。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的:
当采用五聚体CRP(pCRP)检测待测血样中的抗mCRP抗体时,检测的灵敏度和准确度均不太理想,限制了对间质性肾炎患者的早期筛查和诊断。而本申请的发明人意外地发现,如果采用单体CRP(mCRP)检测待测血样中的抗mCRP抗体时,检测的灵敏度和准确度均得到显著提高,为间质性肾炎患者的早期筛查、诊断和分型提供了有力依据。
在本发明的第一方面,本发明提出了单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测待测样品中抗mCRP抗体的含量。如前所述,发明人发现,当采用单体CRP(mCRP)检测待测样品中的抗mCRP抗体时,相比于现有技术,检测的准确度和灵敏度均得到显著提高。
根据本发明的实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述待测样品为血清或血浆。当采用单体C反应蛋白(mCRP)检测血清或血浆中的抗mCRP抗体时,mCRP与血清或血浆中的其他非抗mCRP抗体的非特异性结合大大降低,对于血清或血浆中抗mCRP抗体的检测灵敏度和准确度进一步提高。
根据本发明的实施例,所述待测样品来源于人。
在本发明的第二方面,本发明提出了单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于肾小管间质肾病早期筛查、诊断或分型。发明发现,抗mCRP抗体与肾小管间质性肾病具有强相关性,单体C反应蛋白(mCRP)所制备的试剂盒,可用于肾小管间质肾病更加准确、可信地早期筛查、诊断或分型。
根据本发明的实施例,上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述肾小管间质肾病为急性肾小管间质肾病或TINU综合征。发明人根据检测统计结果,发现,在肾活检明确诊断肾小管间质肾病患者中,TINU(肾小管间质肾病和眼色素膜炎)患者的阳性率约为57.1%,阳性概率较高,采用根据本发明实施例的试剂盒也实现了对TINU综合征的早期筛查,抗mCRP抗体阳性可预测晚发型肾小管间质性肾炎-眼色素膜炎(TINU)综合征。
根据本发明的实施例,单侧检测值大于32.5%是肾小管间质肾病阳性的指示。根据本发明的实施例,利用单体C反应蛋白(mCRP)所制备的试剂盒采用间接酶联免疫法(以下简称ELISA)检测待测样品中的抗mCRP抗体,可根据如下公式计算待测样品中抗mCRP抗体的阳性率,当单侧检测值大于32.50%(单侧检测值保留两位小数)是待测样品中抗mCRP抗体阳性的指示,进而可初步筛查和确定肾小管间质肾病患者。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒含有单体C反应蛋白(mCRP)。根据本发明实施例的试剂盒对待测样品中抗mCRP抗体的检测更加灵敏和准确。
根据本发明的实施例,上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述单体C反应蛋白是以溶于碳酸盐缓冲液的形式提供的,所述碳酸盐缓冲液包括碳酸钠、碳酸氢钠以及水。
根据本发明的实施例,所述碳酸盐缓冲液的pH为9.0~10.0,优选地,pH为9.6。进而使得单体C反应蛋白更好地结合于ELISA板。
根据本发明的实施例,所述碳酸钠在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为1~2g/L,所述碳酸氢钠在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为2.5~3g/L;
根据本发明的实施例,所述单体C反应蛋白在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为7~8mg/mL,优选地,7.5mg/ml。发明人发现,当单体C反应蛋白在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为7~8mg/mL时,可在控制抗原-单体C反应蛋白低用量的前提下,进一步提高对待测样品中抗mCRP抗体的检测灵敏度。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括所述碳酸盐缓冲液。进而方便使用者直接采用所述碳酸盐缓冲液对单体C反应蛋白进行稀释处理,用于后续检测反应,进一步降低因为人为因素造成的实验误差。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括第二抗体。根据本发明实施例的试剂盒适于采用ELISA法检测待测样品中的抗mCRP抗体的含量。具体地,所述第二抗体为山羊抗人IgG。具体地,所述第二抗体带有可检测的标记物。具体地,所述标记物为辣根过氧化物酶。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括:非蛋白封闭液以及0.1%PBST。发明人发现,如果采用蛋白封闭液,如BSA作为封闭液,BSA会跟mCRP有交叉反应而影响检测的灵敏性和准确性,使用非蛋白封闭液,可避免mCRP交叉反应风险,进一步提高检测的灵敏性和准确性。0.1%PBST可在ELISA检测中直接用作样品稀释液、第二抗体稀释液和洗涤液。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括底物显色液;
根据本发明的实施例,所述底物显色液包括体积分数为9.7%的二乙醇胺以及MgCl2·6H2O。
根据本发明的实施例,所述试剂盒进一步包括:阳性对照血清和阴性对照血清。具体地,所述阳性对照血清为使用ELISA和Western blot方法检测抗mCRP抗体均为阳性的血清,例如,所述血清可来自急性肾小管间质肾病患者血清或其他疾病患者的血浆置换液;具体地,所述阴性对照血清是使用ELISA和Western blot方法检测抗mCRP抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。
在发明的第四方面,本发明提出了一种用于肾小管间质肾病早期筛查、诊断或分型的试剂盒或提出了一种用于检测抗mCRP抗体的试剂盒。根据本发明的实施例,所述试剂盒含有单体C反应蛋白(mCRP)。根据本发明实施例的试剂盒对待测血样中抗mCRP抗体的检测更加灵敏和准确。抗mCRP抗体阳性可预测晚发型肾小管间质性肾炎-眼色素膜炎(TINU)综合征,抗mCRP抗体与肾小管间质性肾炎具有强相关性。根据本发明实施例的包含单体C反应蛋白(mCRP)的试剂盒,可用于肾小管间质肾病更加准确、可信地早期筛查、诊断或分型。
根据本发明的实施例,所述用于肾小管间质肾病早期筛查、诊断或分型的试剂盒具有与上述试剂盒相同或相应的附加技术特征,其技术效果与上述试剂盒的附加技术特征相同,在此不再赘述。
附图说明
图1为间接酶联免疫吸附实验原理图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明,但并不限制本发明的范围。
下列实施例所述的实验方法,如无特殊说明,均为本技术领域常规技术,或按照生产厂商所建议的条件;所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明根据间接酶联免疫法的原理制备了一种用于急性肾小管间质肾病早期筛查的抗mCRP抗体检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,然后测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量(参见图1)。
需要说明的是,本申请所采用的单体C反应蛋白(mCRP)可通过购买获得或通过制备获得,制备方法可参考专利U.S.专利5,874,238。
定义
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义,但如有冲突,则以本说明书中的定义为准。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
如说明书和权利要求书中所用,单数形式“一”、“一个”和“该(所述)”包括复数形式,除非上下文另有明确说明。
如无特殊说明,本说明书中的百分比(%)均为重量百分比(重量%)。
在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。术语“约”当指数量或数值范围时,意思是所指数量或者数值范围是试验变异性内(或统计学实验误差内)的近似值,因此该数量或者数值范围可以在所述数量或数值范围的例如±5之间变化。
涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点,该端点可独立地组合。由于这些范围是连续的,因此它们包括在最小值与最大值之间的每一数值。还应理解的是,本申请引用的任何数值范围预期包括该范围内的所有子范围。
当本发明针对物理性质例如分子量或者针对化学性质范围时,应包括范围的所有组合和亚组合以及其内的具体实施方式。术语“包含”(以及相关术语例如“含有”或“含”或“具有”或“包括”)包括这样一些实施方式,该实施方式为例如,物质、组分、方法或过程等的任何组合,其“由所描述的特征组成”或者“基本上由所描述的特征组成”。
本说明书和权利要求中使用的“和/或”,应当理解为相关联的组分“二者择一或二者”,即组分在一些情况中联合存在而在另一些情况中分开存在。多个用“和/或”列出的组分应当以同样的方式理解,即“一种或多种”相关联的组分。除了“和/或”从句具体确定的组分,其它组分可任选地存在,无论与那些具体确定的组分相关还是不相关。因此,作为非限制性实例,提及“A和/或B”,当用于连接开放式结尾的文字如“包括”,在一个实施方案中,可仅指A(任选地包括除B外的组分);在另一实施方案,可仅指B(任选地包括除A外的组分);在再一实施方案中,指A和B(任选的包括其它组分)等。
应当理解,除非明确地相反指示,否则在本文要求保护的包括多于一步或一个行为的任何方法中,该方法的步骤和行为的顺序不必限制于所叙及的方法的步骤和行为的顺序。
本发明使用的缩写具有在生物学和化学领域的通常含义。
mCRP:单体C反应蛋白;
0.1%PBST:PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%;
PBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1试剂盒的制备
1、实验材料及试剂:
(1)自制单体C反应蛋白(mCRP,7.5mg/ml),制备方法参考专利U.S.专利5,874,238;
(2)酶标板:3590(costar.美国);
(3)碳酸盐缓冲液:0.477g碳酸钠,0.879g碳酸氢钠,300ml去离子水,pH=9.6,过膜分装冻存;
(4)PBST溶液:0.1%PBST;
(5)非蛋白封闭液:2%封闭试剂(生工生物,PW040-500ml);
(7)第二抗体:山羊抗人IgG(sigma,cat#A3188);
(9)阳性对照血清:来自一例急性肾小管间质肾病患者(使用ELISA和Westernblot方法检测该血清中的抗mCRP抗体,抗mCRP抗体均为阳性);
(10)阴性对照血清:正常人的血清(使用ELISA和Western blot方法检测该血清中的抗mCRP抗体表达水平,血清含量均为正常人群血清抗体平均含量);
(11)底物显色液:97ml二乙醇胺,0.1g MgCl2·6H2O,使用ddH2O定容至1000ml,pH=9.8;
(13)终止液:2mol/L的硫酸;
(14)酶标仪:Star Fax 2100(Awareness.美国)。
2、制备抗原包被的酶标板:
(1)用碳酸盐缓冲液稀释7.5mg/ml的mCRP至5μg/ml,充分混匀。
(2)包被酶标板:
将制备好的mCRP抗原加入到96孔酶标板的反应孔中,加样量为100μl/孔;阳性对照孔和阴性对照孔中加入mCRP抗原溶液,空白对照孔加入包被液,37℃恒温培养箱孵育1h,4℃过夜后去除包被液,然后用洗涤液洗涤3次,每次洗涤3min。
(3)封闭:
向包被后的96孔酶标板的反应孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔),室温孵育2小时,去除封闭液,然后用洗涤液洗涤3次,每次洗涤3min。
(4)干燥,包装:
将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后,包装,得到抗原包被的96孔酶标板,4℃保存备用。
3、本发明试剂盒的组成如下:
(1)步骤2制备的抗原包被的96孔酶标板;
(2)样品稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;
(3)第二抗体稀释液:含有1%(W/V)BSA的PBST缓冲液;
(4)酶标第二抗体:辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(sigma,cat#A3188);
(5)显色液:97ml二乙醇胺,0.1g MgCl2·6H2O,使用ddH2O定容至1000ml,pH=9.8;
(6)终止液:1mol/L的硫酸;
(7)洗涤液:含0.2%吐温20的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液;
(8)阳性对照血清:抗mCRP抗体阳性对照血清;
(9)阴性对照血清:抗mCRP抗体阴性对照血清。
试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成试剂盒。
实施例2试剂盒的使用方法
2.1用碳酸盐缓冲液稀释mCRP(7.5mg/ml)至5μg/ml,混匀。抗原孔加入mCRP稀释液100μl/孔,非抗原包被孔加入碳酸盐缓冲液100μl/孔,4℃过夜包板或37℃2h。(具体孔数按标本数来定,做副孔;同时有阳性对照、阴性对照、空白对照孔)
2.2PBST洗板,每孔300μL,放置1min,拍干,共三次。
2.3配制非蛋白封闭液(按量计算一孔200μl,50%体积商品化无菌PBS,50%体积商品化非蛋白封闭液).
2.4非蛋白封闭液封闭,每孔200μL,37℃,200rpm,2h。
2.5PBST洗板,每孔300μL,放置1min,拍干,共三次。
2.6PBST稀释待测血样及阳性对照等标本,体积比1:100,100μL/孔,37℃,1h。
2.7PBST洗板,每孔300μL,放置1min,拍干,共三次。
2.8用PBST配制山羊抗人IgG二抗,稀释比例1:5000,混匀,100μl/孔,37℃,30min。
2.9PBST洗板,每孔300μL,放置1min,拍干,共三次。
2.10显色:配制底物显色液,每5mL底物缓冲液加入5mg显色底物,避光混匀溶解,100μl/孔,室温显色30min.(比色前轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀)。
2.11读数:用酶标仪在405nm读取吸光度(A)值。
2.12计算:
阳性判读:单侧>32.5%阳性(结果保留两位小数)
备注:
每次实验必须设阳性、空白和阴性对照;
试剂储存条件及有效期:2-8度保存,自生产日起,非蛋白封闭液未开封前室温保存2年,试剂开启后需放置2-8度冰箱保存,如果溶液变浑或者出现污染则不能使用。
务必保证每次洗板干净,尤其是非蛋白封闭液。
实施例3
发明人采用实施例1所制备的试剂盒,对388例疑诊急性肾小管间质肾病患者进行了抗mCRP抗体检测,检测过程如实施例2所述,检测结果显示,其中312例患者抗mCRP抗体阴性,76例患者抗mCRP抗体阳性。初步确诊这76例阳性患者患有急性肾小管间质肾病。
进而发明人对这76例阳性患者进一步进行肾活检检测确认,活检检测结果也确诊这76例阳性患者患有急性肾小管间质肾病,与抗mCRP抗体检测初步确诊结果一致。
采用实施例2所制备的试剂盒检测疑似急性肾小管间质肾病患者体内的抗mCRP抗体,以进行肾小管间质肾病的早期筛查和确诊,可信度高。
在本申请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献,已发布的专利,已公开的专利申请和同时待审的专利申请)的内容在此明确地全文引入作为参考。除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员通常已知的含义一致。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同,等同或相似目的的替代特征代替。因此,除非另有明确说明,否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的示例。
根据以上描述,本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征,并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此,其他实施例也在所附权利要求的范围内。
Claims (12)
1.单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于检测待测样品中抗mCRP抗体的含量。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述待测样品为血清或血浆。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述待测样品来源于人。
4.单体C反应蛋白(mCRP)在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于肾小管间质肾病早期筛查、诊断或分型。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述肾小管间质肾病为急性肾小管间质肾病或TINU综合征。
6.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,单侧检测值大于32.5%是肾小管间质肾病阳性的指示。
7.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有单体C反应蛋白(mCRP)。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述单体C反应蛋白是以溶于碳酸盐缓冲液的形式提供的,所述碳酸盐缓冲液包括碳酸钠、碳酸氢钠以及水;
任选地,所述碳酸盐缓冲液的pH为9.0~10.0,优选地,pH为9.6;
优选地,所述碳酸钠在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为1~2g/L,所述碳酸氢钠在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为2.5~3g/L;
优选地,所述单体C反应蛋白在所述碳酸盐缓冲液中的浓度为7~8mg/mL,优选地,7.5mg/ml。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括所述碳酸盐缓冲液。
10.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括第二抗体;
任选地,所述第二抗体为山羊抗人IgG;
任选地,所述第二抗体带有可检测的标记物;
任选地,所述标记物为辣根过氧化物酶。
11.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括:非蛋白封闭液以及0.1%PBST;
任选地,所述试剂盒进一步包括底物显色液;
优选地,所述底物显色液包括体积分数为9.7%的二乙醇胺以及MgCl2·6H2O。
12.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括:阳性对照血清和阴性对照血清,
任选地,所述阳性对照血清为使用ELISA和Western blot方法检测抗mCRP抗体均为阳性的急性肾小管间质肾病患者血清;
任选地,所述阴性对照血清是使用ELISA和Western blot方法检测抗mCRP抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。
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CN118090377A (zh) * | 2024-04-28 | 2024-05-28 | 北京大学第一医院(北京大学第一临床医学院) | 一种用于肾穿刺组织活检光镜特殊染色的试剂盒及染色方法 |
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- 2020-11-30 CN CN202011377237.3A patent/CN114578057A/zh active Pending
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