CN111781346B - 一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法，该稀释液由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG‑6000、氯化钙、丙三醇、抗内风湿因子抗体和防腐剂组成。本发明提供的一种用于稀释全血的样本稀释液，将全血经过该稀释液的处理，能有效的去除全血样本对检测结果的影响，同时能够有效的降低本底、去除假阳性，提高检测的灵敏度，增加阳性和阴性的对比度，性能上明显优于传统的样本稀释液稀释血清或血浆的效果。该稀释液可以直接稀释全血使用，减少提取血清或血浆的过程，便于简化操作，当然稀释血清亦可使用，效果良好。

Description

一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法
技术领域
本发明涉及生物检测试剂技术领域，具体涉及一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法。
背景技术
酶联免疫检测试剂盒(ELISA试剂盒)是酶免疫检测技术中应用最广的检测技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，加入待测物，再使用酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。酶联免疫检测试剂盒通常包括包被板、样本稀释液、洗涤液、酶标抗体稀释液、终止液等在检测过程中所使用的试剂。
当前酶联免疫法产品检测样本多是血清或血浆，很少见直接使用全血样本，而血清要等血液凝固后才能更好地进行分离，血液凝固一般是在4℃放置几个小时甚至更长的时间，血液凝固之后经过离心才能得到血清，因而过程比较繁琐且费时。而采用全血样本其某些成分对检测结果会产生影响，增加了本底及导致假阳性的出现，降低了检测的灵敏度。因此，急需一种用于全血的酶联免疫稀释液，减少提取血清或血浆的过程，便于简化操作，且能降低本底提高检测的灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用于全血的酶联免疫稀释液；
本发明的第二目的在于提供此种稀释液的制备方法；
本发明的第三目的在于提供此种稀释液的使用方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.4～0.8％；磷酸二氢钾：0.04～0.08％；表面活性剂S9：0.05～0.1％；PEG-6000：0.05～0.1％；氯化钙：0.01～0.03％；丙三醇：5～10mL/L；抗内风湿因子抗体：0.1～0.3mg/L；防腐剂：100～400μL/L。
进一步地，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.5～0.6％；磷酸二氢钾：0.05～0.06％；表面活性剂S9：0.05～0.08％；PEG-6000：0.05～0.08％；氯化钙：0.01～0.02％；丙三醇：5～8mL/L；抗内风湿因子抗体：0.1～0.2mg/L；防腐剂：200～400μL/L。
作为优选方案，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.58％；磷酸二氢钾：0.052％；表面活性剂S9：0.05％；PEG-6000：0.05％；氯化钙：0.01％；丙三醇：5mL/L；抗内风湿因子抗体：0.2mg/L；防腐剂：300μL/L。
进一步地，所述抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
进一步地，所述防腐剂为Proclin-300。
上述的一种用于全血的酶联免疫稀释液的制备方法，它包括以下步骤：
S1.称量：按配方比例称取各原料，备用；
S2.溶解：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG-6000和氯化钙加入纯水中溶解，再加入丙三醇和抗内风湿因子抗体；
S3.定容：待上述物质溶解后加入纯化水定容至相应体积，最后再加入防腐剂，置于2～8℃储存。
上述的一种用于全血的酶联免疫稀释液的使用方法，它包括以下步骤：
S1.分装：将上述稀释液分装到EP管中，0.5mL/支；
S2.稀释：按常规方法采集全血，取10～50μL的全血加入到步骤S1分装好的稀释液中；
S3.沉淀：将加有全血的稀释液EP管置于2～8℃，放置≥1h进行自然沉淀；
S4.储存：沉淀后的样本若置于2～8℃的环境下5d内进行检测，若长期保存，需吸取上清液装入EP管中，置于-20℃冻存。
本发明中磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成磷酸盐缓冲***，使得血细胞稳定存在不会自溶；抗内风湿因子抗体可以有效去除内风湿因子的影响，表面活性剂S9、氯化钙、丙三醇等能够有效去除假反应而降低本底，PEG-6000能有效的促进抗原抗体反应，提高阳性的检出率。
本发明具有以下优点：本发明提供的一种用于稀释全血的样本稀释液，将全血(包括静脉血和末梢全血)经过该稀释液的处理，能有效的去除全血样本对检测结果的影响，同时能够有效的降低本底、去除假阳性，提高检测的灵敏度，增加阳性和阴性的对比度，性能上明显优于传统的样本稀释液稀释血清或血浆的效果。该稀释液可以直接稀释全血使用，减少提取血清或血浆的过程，便于简化操作，当然稀释血清亦可使用，效果良好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.4％；磷酸二氢钾：0.04％；表面活性剂S9：0.05％；PEG-6000：0.05％；氯化钙：0.01％；丙三醇：5mL/L；抗内风湿因子抗体：0.1mg/L；防腐剂：100μL/L；
其中，抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
实施例2：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.8％；磷酸二氢钾：0.08％；表面活性剂S9：0.1％；PEG-6000：0.1％；氯化钙：0.03％；丙三醇：10mL/L；抗内风湿因子抗体：0.3mg/L；防腐剂：400μL/L；
其中，抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
实施例3：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.5％；磷酸二氢钾：0.05％；表面活性剂S9：0.05％；PEG-6000：0.05％；氯化钙：0.01％；丙三醇：5mL/L；抗内风湿因子抗体：0.1mg/L；防腐剂：200μL/L；
其中，抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
实施例4：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.6％；磷酸二氢钾：0.06％；表面活性剂S9：0.08％；PEG-6000：0.08％；氯化钙：0.02％；丙三醇：8mL/L；抗内风湿因子抗体：0.2mg/L；防腐剂：400μL/L；
其中，抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
实施例5：一种用于全血的酶联免疫稀释液，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.58％；磷酸二氢钾：0.052％；表面活性剂S9：0.05％；PEG-6000：0.05％；氯化钙：0.01％；丙三醇：5mL/L；抗内风湿因子抗体：0.2mg/L；防腐剂：300μL/L；
其中，抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
实施例6：一种用于全血的酶联免疫稀释液的制备方法，它包括以下步骤：
S1.称量：按实施例1的配方比例称取各原料，备用；
S2.溶解：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG-6000和氯化钙加入纯水中溶解，再加入丙三醇和抗内风湿因子抗体；
S3.定容：待上述物质溶解后加入纯化水定容至相应体积，最后再加入防腐剂，置于2～8℃储存。
实施例7：一种用于全血的酶联免疫稀释液的制备方法，它包括以下步骤：
S1.称量：按实施例3的配方比例称取各原料，备用；
S2.溶解：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG-6000和氯化钙加入纯水中溶解，再加入丙三醇和抗内风湿因子抗体；
S3.定容：待上述物质溶解后加入纯化水定容至相应体积，最后再加入防腐剂，置于2～8℃储存。
实施例8：一种用于全血的酶联免疫稀释液的制备方法，它包括以下步骤：
S1.称量：按实施例4的配方比例称取各原料，备用；
S2.溶解：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG-6000和氯化钙加入纯水中溶解，再加入丙三醇和抗内风湿因子抗体；
S3.定容：待上述物质溶解后加入纯化水定容至相应体积，最后再加入防腐剂，置于2～8℃储存。
实施例9：一种用于全血的酶联免疫稀释液的使用方法，它包括以下步骤：
S1.分装：将实施例6制备的稀释液分装到EP管中，0.5mL/支；
S2.稀释：按常规方法采集全血，取10μL的全血加入到步骤S1分装好的稀释液中；
S3.沉淀：将加有全血的稀释液EP管置于2～8℃，放置1h进行自然沉淀；
S4.储存：沉淀后的样本置于2～8℃的环境下5d内进行检测。
实施例10：一种用于全血的酶联免疫稀释液的使用方法，它包括以下步骤：
S1.分装：将实施例7制备的稀释液分装到EP管中，0.5mL/支；
S2.稀释：按常规方法采集全血，取50μL的全血加入到步骤S1分装好的稀释液中；
S3.沉淀：将加有全血的稀释液EP管置于2～8℃，放置1.5h进行自然沉淀；
S4.储存：需吸取上清液装入EP管中，置于-20℃冻存。
实施例11：一种用于全血的酶联免疫稀释液的使用方法，它包括以下步骤：
S1.分装：将实施例8制备的稀释液分装到EP管中，0.5mL/支；
S2.稀释：按常规方法采集全血，取30μL的全血加入到步骤S1分装好的稀释液中；
S3.沉淀：将加有全血的稀释液EP管置于2～8℃，放置2h进行自然沉淀；
S4.储存：沉淀后的样本置于2～8℃的环境下5d内进行检测。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
一、样本稀释液的制备
称取5.8g磷酸氢二钠，0.52g磷酸二氢钾，0.5g表面活性剂S9，0.5g大分子聚合物PEG-6000，0.1g氯化钙，加纯化水溶解，再加5mL的丙三醇，0.1mg的抗内风湿因子，溶解后加纯化水定容至1L，最后加200μL的防腐剂Proclin-300，放置2-8℃储存。
二、稀释液的使用
1.可将配制好的样本稀释液分装到EP管中，0.5mL/支，2～8℃冰箱保存。
2.按常规方法采集全血(如静脉血或指尖血)，取10-50μL的全血加入到分装好的样本稀释液中，稀释的比例基本同血清的稀释比例。
3.将加有全血的样本稀释液EP管放入EP管架上，放置冰箱。
4.放置1小时后，全血细胞会基本沉入到管底，通过这个自然沉淀的方法基本将血细胞分离出来，由于检测的可溶性抗体(如IgG、IgM、IgA等)及相关蛋白会均匀的溶解到缓冲液中。
5.由于加了防腐剂，样本放置2～8℃5天内检测无显著差异。如需长期存放，可吸取上清液装入到另外EP管中，-20℃长期冻存。
三、检测效果
常用的样本稀释液多为含有Tween-20的PBS缓冲液。用其将血清或血浆作1:10～1:50不等的稀释，稀释后的样本在样本稀释液的环境中目标成分同微孔板上包被的物质进行有效反应，再通过多次洗涤、加酶标抗体、显色剂显色等过程，检测血样中的待测物。样本稀释液稀释血清或血浆进行的作用包括：稀化样本，样本中的目标成分能在缓冲液中更加有效的扩散，便于反应；降低本底及假阳性的反应；提高有效物质的检测效果，增加阴性和阳性的对比度。
但是传统的稀释液往往在稀释全血后出现本底偏高，个别假阳性反应，阳性检测结果不理想等问题。
我们对比这两种稀释液的检测效果，分别用两种稀释液稀释血清和全血，然后检测10份阳性样本和10份阴性样本，比较结果。检测的物质分别是：1.人血液中结核分枝杆菌IgG抗体。2.人血液中心肌钙蛋白(cTnI)。3.人血液中甲胎蛋白(AFP)。过程及结果如下：
1.稀释并检测人血液中结核分枝杆菌IgG抗体的比较
1)采用酶联免疫间接法检测人血液中结核分枝杆菌IgG抗体，检测原理是：微孔板上包被有一定浓度的结核蛋白TB-SA，样本经过稀释液稀释后加入到微孔板中，经37℃孵育10min，如果样本中有抗结核蛋白TB-SA抗体，则相应的抗体IgG便会特异性的与酶标板上的TB-SA结合而牢固的附着在酶标板上，经洗涤后将酶标二抗加入到微孔板中，经孵育再洗涤，最后加入显色剂，通过显色来判定抗体的有无及含量的高低。
整个过程中，除样本稀释液外，其他成分均相同，以便比较样本稀释液的效果。
2)采集10名结核病人和10名健康体检人血样，包括血清和末梢全血。用两种稀释液稀释，稀释情况如表1所示：
表1：稀释人血液中结核分枝杆菌IgG抗体的情况
Figure BDA0002589928250000061
将稀释后的血清和末梢全血样本放置2～8℃冰箱放置1小时后用于检测。
取出放置室温发现，用该方法制得的样本稀释液稀释末梢全血后，红细胞基本沉入管底，上清澄清透亮。含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液稀释末梢全血后，还有红细胞分散在溶液中，另外溶液呈淡淡的红色。
均取100μL的上清液加入到包被好的微孔板中，按照检测流程进行检测，检测结果如表2所示：
表2：检测人血液中结核分枝杆菌IgG抗体的结果
Figure BDA0002589928250000062
Figure BDA0002589928250000071
注：按照测得的OD值大于等于0.3判定为阳性+，小于0.3判为阴性-。统计情况如表3所示：
表3：检测人血液中结核分枝杆菌IgG抗体的统计结果
Figure BDA0002589928250000072
从检测结果可知：
1)该稀释液较传统使用的稀释液不论稀释血清还是全血在检出率上有提高。
2)在全血稀释检测的效果上，传统稀释液有较大的干扰，表现在阴性和阳性检出率不高，阴性和阳性的区分度大大下降。而该稀释液能够去除这些影响，阴阳性检出率高于传统稀释液稀释血清的结果，同时阴性和阳性的区分度提升。
3)该稀释液在稀释血清和全血后，检测效果无显著差异，似乎本底略低，具有更好的区分度。
2.稀释并检测人血液中心肌钙蛋白(cTnI)比较
1)采用双单抗夹心法检测人血液中心肌钙蛋白(cTnI)，检测原理是：微孔板上包被有一定浓度的小鼠抗人心肌钙蛋白(cTnI)单克隆抗体IgG，血液样本经过稀释液稀释后加入到微孔板中，经37℃孵育30min，如果样本中含有人心肌钙蛋白(cTnI)，则相应的心肌钙蛋白(cTnI)便会特异性的与酶标板上的小鼠抗人心肌钙蛋白(cTnI)单克隆抗体IgG结合而牢固的附着在酶标板上，经洗涤后将酶标小鼠抗人心肌钙蛋白(cTnI)另一单克隆抗体IgG加入到微孔板中，经孵育再洗涤，最后加入显色剂，通过显色来判定抗体的有无及含量的高低。
整个过程中，除样本稀释液外，其他成分均相同，以便比较样本稀释液的效果。
2)采集10名心肌梗塞病人和10名健康体检人血样，包括血清和末梢全血。用两种稀释液稀释，稀释情况如表4所示：
表4：稀释人血液中心肌钙蛋白的情况
Figure BDA0002589928250000081
将稀释后的血清和末梢全血样本放置2-8℃冰箱放置1小时后用于检测。
取出放置室温发现，用该方法制得的样本稀释液稀释末梢全血后，红细胞基本沉入管底，上清澄清透亮。含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液稀释末梢全血后，还有红细胞分散在溶液中，另外溶液呈淡淡的红色。
均取100μL的上清液加入到包被好的微孔板中，按照检测流程进行检测，结果如表5所示：
表5：检测人血液中心肌钙蛋白的结果
Figure BDA0002589928250000091
Figure BDA0002589928250000101
注：按照测得的OD值大于等于0.25判定为阳性+，小于0.25判为阴性-。
统计如表6所示：
表6：检测人血液中心肌钙蛋白的统计结果
Figure BDA0002589928250000102
从检测结果可知：
1)该稀释液较传统使用的稀释液不论稀释血清还是全血总的检出率不低于传统血清稀释效果。
2)在全血稀释检测的效果上，传统稀释液有较大的干扰，阳性中高值起不来，低值下不去，此次有一个样本在其他几个稀释中呈阴性而在此为阳性，应该是非特异性反应导致本底上升而呈阳性，从阴性检测结果能看到，传统稀释液稀释全血导致两个非特异性反应而导致的假阳性。
3)从检测的对比度(P/N)来看，该稀释液在稀释血清和全血后，检测效果无显著差异，但具有更好的区分度。
4)传统稀释液在稀释血清时，阴阳性检出数量无差异，但是检测的对比度(P/N)稍差，在稀释全血时，更是出现较严重的干扰。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于全血的酶联免疫稀释液，其特征在于，它包括以下原料：
磷酸氢二钠：0.58%；磷酸二氢钾：0.052%；表面活性剂S9：0.05%；PEG-6000：0.05%；氯化钙：0.01%；丙三醇：5mL/L；抗内风湿因子抗体：0.2mg/L；防腐剂：300μL/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于全血的酶联免疫稀释液，其特征在于，所述抗内风湿因子抗体为小鼠抗人类风湿因子多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种用于全血的酶联免疫稀释液，其特征在于，所述防腐剂为Proclin-300。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种用于全血的酶联免疫稀释液的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 称量：按配方比例称取各原料，备用；
S2. 溶解：将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、表面活性剂S9、PEG-6000和氯化钙加入纯水中溶解，再加入丙三醇和抗内风湿因子抗体；
S3. 定容：待上述物质溶解后加入纯化水定容至相应体积，最后再加入防腐剂，置于2～8℃储存。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的一种用于非诊断目的全血的酶联免疫稀释液的使用方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 分装：将上述稀释液分装到EP管中，0.5mL/支；
S2. 稀释：按常规方法采集全血，取10～50μL的全血加入到步骤S1分装好的稀释液中；
S3. 沉淀：将加有全血的稀释液EP管置于2～8℃，放置≥1h进行自然沉淀；
S4. 储存：沉淀后的样本若置于2～8℃的环境下5d内进行检测，若长期保存，需吸取上清液装入EP管中，置于-20℃冻存。
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