CN114574535A - 一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用 - Google Patents

一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用。该肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备包括：将肉糜与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行离心，得到上清液；将上清液与乳酸混合后进行离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；将肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；将肌浆蛋白溶液发酵，得到肌浆蛋白肽液；将肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。本发明的肌浆蛋白肽糖基化接枝物具有较强抗氧化能力，可减缓肉蛋白质和脂质的氧化速率。本发明将肉松和肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合发酵，制备的肉松酱在贮藏期间具有较好的抗氧化能力和氧化稳定性。

Description

一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉 松酱中的应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用。
背景技术
目前，市场上销售的肉松酱种类越来越多，口味也多种多样，其营养丰富，易被人体消化吸收，食用方便，逐渐成为一种佐餐佳品。但是，肉松酱因富含蛋白质和脂肪，在贮藏过程中极易被氧自由基攻击而发生氧化，进而破坏肉松酱品质，影响食用安全性。
蛋白质的糖基化改性是基于美拉德反应机理的羰氨缩合反应，该过程不需任何化学催化剂参与，通过自发的美拉德反应即可使蛋白质分子的ε-氨基与糖分子的还原性末端羰基进行共价结合而实现，所得到的蛋白质-糖共价复合物常可作为性质优良的多功能添加剂。因其反应条件温和、安全性高而倍受瞩目。
目前虽然也有关于蛋白肽的糖基化改性提高抗氧化能力的研究，比如，赵玉滨利用碱性蛋白酶水解芸豆蛋白再通过糖基化反应制备芸豆肽糖基化改性物，其自由基清除能力和还原能力得到显著提高。尤娟采用五种蛋白酶酶解鲢鱼肉蛋白制备抗氧化肽，再经糖基化反应制备得到有较好清除DPPH自由基能力和还原力的产物。中国专利CN110951811B公开了一种糖基化蜂王浆抗氧化肽及制备方法，其是将碱性蛋白酶酶解后的蜂王浆蛋白肽进行糖基化改性来提高蜂王浆蛋白肽的抗氧化活性。然而，目前未见利用乳酸菌发酵蛋白质制备肽再进一步经糖基化反应制备接枝物的报道。而且现有技术也只是停留在改善蛋白肽糖基化接枝物功能特性的研究上，还未见将糖基化产物成功应用于肉松酱的制备并显著增强其抗氧化能力以及氧化稳定性的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法及其在制备发酵肉松酱中的应用，采用本申请提供的制备方法操作简单，得到的肉松酱具有很强的抗氧化性和氧化稳定性，在贮藏期内具有更好的挥发性风味物质保持率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法，包括以下步骤：
将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；
将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；
将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；
将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；
将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
优选的，所述糖基化反应的反应温度为50～70℃，反应时间为90～150min。
优选的，所述糖类包括木糖和海藻糖；所述木糖和海藻糖的质量比为(1～3)：(1～3)。
优选的，所述发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.05～0.25％；所述发酵用菌包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5；所述发酵用菌的总活力为250Danisco单位。
优选的，所述发酵的发酵温度为40～45℃，发酵时间为10～15h。
优选的，所述鱼肉取自但不限于冷水鱼的背部肌肉；所述冷水鱼包括腹鱼、鲟鱼和鲑鳟鱼中的一种或几种。
本发明还提供了利用前述技术方案所述制备方法制备得到的肌浆蛋白肽糖基化接枝物，所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物中固形物含量为25％～35％，接枝度为30％～40％。
本发明还提供了一种利用前述技术方案所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物制备发酵肉松酱的方法，包括以下步骤：
将肉松与肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合，得到肉松-肽糖基化接枝物混物；
利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到发酵肉松酱。
优选的，每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106～108CFU发酵乳杆菌。
优选的，所述肉松发酵的发酵温度为35～40℃，发酵时间为4～8h。
本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法和发酵肉松酱的制备方法，包括将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；将所述肌浆蛋白与磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。本发明的肌浆蛋白肽糖基化接枝物抗氧化能力强，可减缓肉蛋白质和脂质的氧化速率。本发明将肉松和肌浆蛋白糖基化接枝物混合发酵后，生成了很多具有抗氧化的小分子肽和氨基酸，使得制备的肉松酱在贮藏期间具有较好的抗氧化能力和氧化稳定性，保持了肉松酱的食用品质。在本发明实施例中，利用本发明所述制备方法得到的肉松酱抗氧化能力强，在贮藏期间的氧化稳定性突出，具有更好地挥发性风味物质保持率；且所得肉松酱品质好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的TBA值变化结果；
图2为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的羰基值变化结果；
图3为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的DPPH·清除能力(％)变化结果；
图4为不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的挥发性风味物质变化结果。
具体实施方式
本发明提供了一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法，包括以下步骤：
将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；
将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；
将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；
将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；
将所述肌浆蛋白肽液与多糖混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
本发明将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液。在本发明中，所述鱼肉取自但不限于冷水鱼的背部肌肉；所述冷水鱼优选包括腹鱼、鲟鱼和鲑鳟鱼中的一种或几种。在本发明中，所述鱼肉优选以肉糜的形式提供；在本发明中，所述肉糜优选通过去除冷水鱼的鱼头、鱼尾和鱼皮，剖下鱼背部肌肉，绞碎得到。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.03mol/L，进一步优选为0.02mol/L；所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为6.8～7.5，进一步优选为6.9或7.0或7.1～7.4。在本发明中，所述肉糜与磷酸盐缓冲液的质量比优选为1:2～6，进一步优选为1：3～5。在本发明中，所述匀浆的时间优选为1～5min，进一步优选为2～3min。在本发明中，所述第一次离心的离心力优选为7000～9000g，进一步优选为8000g；离心时间优选为8～12min，进一步优选为10min。本发明以磷酸盐缓冲液对肉糜进行匀浆，可使肉糜的pH值上升，高于肉蛋白的等电点，从而使肉糜的持水能力得到提高，同时增加离子强度，有利于肌浆蛋白的溶出，还为肌浆蛋白提供了适宜环境。
得到上清液后，本发明将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白。在本发明中，所述乳酸的体积浓度优选为1～4％，进一步优选为1.5～3.5％，更优选为2％；所述乳酸与上清液的体积比优选为(1～4)：1，进一步优选为2:1。在本发明中，所述第二次离心的离心力优选为7000～9000g，进一步优选为8000g；离心的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。本发明所述乳酸的作用是沉淀肌浆蛋白。
得到肌浆蛋白后，本发明将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液。在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.01～0.03mol/L，进一步优选为0.02mol/L；磷酸盐缓冲液的pH值优选为6.8～7.5，进一步优选为6.9或7.0或7.1～7.4。在本发明中，所述磷酸盐缓冲溶液中的葡萄糖含量优选为0.5％～2％，进一步优选为1％。在本发明中，所述葡萄糖为后续菌种发酵提供碳源。在本发明中，所述肌浆蛋白溶液的蛋白质质量分数优选为5％～10％，进一步优选为7％～9％。混合后，本发明优选还包括将所述肌浆蛋白溶液进行水浴灭菌，冷却，得到肌浆蛋白溶液。在本发明中，所述水浴灭菌的温度优选为90～95℃，进一步优选为92～94℃，所述水浴灭菌的时间优选为5～10min，进一步优选为6～9min。本发明所述冷却包括将肌浆蛋白溶液冷却至40～45℃。本发明将所述肌浆蛋白溶液的蛋白质质量分数控制在5％～10％有利于提高接枝度。
得到肌浆蛋白溶液后，本发明将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液。在本发明中，所述发酵用菌的接种量优选为肌浆蛋白溶液质量的0.05％～0.25％，进一步优选为0.1％～0.2％；所述发酵用菌优选包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5；所述发酵用菌的总活力为250Danisco单位。在本发明的实施例中，具体采用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌直投式混合菌粉。在本发明中，所述发酵的发酵温度优选为40～45℃，进一步优选为41～43℃，发酵时间优选为10～15h，进一步优选为11～13h。本发明将肌浆蛋白溶液发酵的目的是使肌浆蛋白在乳酸菌分泌的蛋白酶和肽酶作用下生成肌浆蛋白肽。
在本发明中，所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌直投式混合菌粉为常规购置，购自Danisco公司。
得到肌浆蛋白肽液后，本发明将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。在本发明中，所述肌浆蛋白肽液的pH值优选为7.0～8.5，进一步优选为7.5～8.0。在本发明中，所述糖类的质量优选为肌浆蛋白肽液质量的1％～7％，进一步优选为2％～5％。在本发明中，所述糖类优选包括木糖和海藻糖；所述木糖和海藻糖的质量比优选为(1～3)：(1～3)，进一步优选为2:3。在本发明中，所述糖基化反应的温度优选为50～70℃，进一步优选为55～65℃，反应时间优选为90～150min，进一步优选为100～140min。所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度优选为30％～40％。本发明通过限制糖基化反应的温度、时间以及糖的种类来实现30％～40％的接枝度。本发明将肌浆蛋白肽液的pH值调节到7.0～8.5，目的是为糖基化反应创造良好的环境。本发明所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度在30％～40％时，抗氧化的能力较强。
所述糖基化反应后，本发明优选还包括将糖基化反应料液冷却至室温，进行真空浓缩，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。本发明进行真空浓缩时，对于浓缩的倍数没有严格要求，保证浓缩后，肌浆蛋白肽糖基化接枝物中的固形物含量为25％～35％即可。
本发明还提供了利用前述技术方案所述制备方法制备得到的肌浆蛋白肽糖基化接枝物；所述肌浆蛋白糖基化接枝物固形物含量为25％～35％，接枝度为30％～40％。
本发明还提供了一种利用前述技术方案所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物制备发酵肉松酱的方法，包括：将肉松和肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合，得到肉松-肽糖基化接枝物混物；利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到所述发酵肉松酱。
本发明可以采用肉松市售产品也可以自行制备；本发明采用自行制备的方式提供肉松时，所述肉松的制备方法包括：肉中加入食盐、姜粉和六偏磷酸钠，进行腌制、蒸煮、挑出鱼刺和炒制，得到肉松。
按照重量份计，每100份肉中，优选加入食盐1.00～3.00份，进一步优选为2.0份；优选加入姜粉0.10～0.15份，进一步优选为0.14份；优选加入六偏磷酸钠0.10～0.30份，进一步优选为0.2份。在本发明中，所述腌制的温度优选为2℃～6℃，进一步优选为4℃。
在本发明中，所述蒸煮的时间优选为30～50min，进一步优选为35～45min。在本发明中，所述炒制优选在铁锅中进行。本发明所述肉松中含水量优选为20％～35％，进一步优选为25％～30％。所述食盐的作用是调味，姜粉的作用是去腥，六偏磷酸钠的作用是保水。本发明肉松中含水量为25％～30％时口感最佳，耐保存。
在本发明中，所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物的添加重量优选为肉松重量的50％～60％，进一步优选为53％～57％。
得到肉松-肽糖基化接枝物混物后，本发明利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行肉松发酵，得到所述发酵肉松酱。本发明对所述发酵乳杆菌的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。在本发明的实施例中，采用发酵乳杆菌SICC1.366，购自四川省微生物资源平台菌种保藏管理中心。
在本发明中，所述发酵乳杆菌的接种量优选为每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106～108CFU，进一步优选为107CFU。在本发明中，对肉松-肽糖基化接枝物混物进行发酵的温度优选为35～40℃，进一步优选为37℃；时间优选为4～8h，进一步优选为5～6h。本发明通过将肉松和肌浆蛋白糖基化接枝物混合后发酵，发酵乳杆菌在发酵过程中产生的特异性蛋白酶和肽酶，可作用于底物生成很多能够抗氧化的小分子肽和氨基酸，使得制备的肉松酱具有更强的抗氧化能力，贮藏时间长。
得到发酵肉松酱后，本发明优选还包括将发酵肉松酱灌装于玻璃瓶中，密封后于121℃反压杀菌30min，得到发酵肉松酱成品。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法和发酵肉松酱的制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1-1
去除冷水鱼的鱼头、鱼尾和鱼皮，剖下鱼背部肌肉，绞碎，得到肉糜(200g)，加入4倍质量的浓度为0.01mol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，匀浆2min，在8000g/10min的条件下，进行第一次离心，获得上清液。在上清液中加入体积分数为2％的乳酸(乳酸体积为上清液体积的2倍)混合，在8000g/10min的条件下，进行第二次离心，得到肌浆蛋白(约10g)。
将肌浆蛋白溶解于含有1％葡萄糖的0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液中，配制成蛋白质质量分数为5％的肌浆蛋白溶液，90℃水浴灭菌5min，冷却至40℃。按照肌浆蛋白溶液质量的0.15％加入嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的直投式混合菌粉(嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5，总活力为250Danisco单位)，于42℃条件下发酵12h，得到肌浆蛋白肽液。
调节肌浆蛋白肽液pH至7.5，按肌浆蛋白肽液重量的3％加入木糖和海藻糖混合物(木糖和海藻糖的重量比为2:3)，进行糖基化反应，反应温度为60℃，反应时间为130min。冷却至室温，真空浓缩至固形物含量为30％，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
实施例1-2
将冷水鱼的背部肌肉切成4cm长的鱼片，按照重量比，每100份鱼肉加入食盐2.0份、姜粉0.14份和六偏磷酸钠0.2份，4℃腌制6h。腌制好的鱼片在100℃蒸煮40min。挑出鱼刺后，在炒锅中炒至鱼肉含水量为30％，得到鱼松。
按鱼松重量的55％加入肌浆蛋白肽糖基化接枝物，混匀后，得到鱼松-肽糖基化接枝物混物。按照每克鱼松-肽糖基化接枝物混物接种107CFU发酵乳杆菌SICC 1.366，搅拌均匀，37℃恒温发酵5h，得到发酵鱼松酱。将发酵鱼松酱灌装于玻璃瓶中，密封后于121℃反压杀菌30min，得到发酵鱼松酱成品。
实施例2-1
同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为1：3。
实施例2-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例2-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例3-1
同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为3：1。
实施例3-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例3-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例4-1
同实施例1-1，区别在于木糖和海藻糖的质量比为1：1。
实施例4-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例4-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例5-1
同实施例1-1，区别在于糖基化反应的反应温度为50℃，反应时间为90min。
实施例5-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例5-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例6-1
同实施例1-1，区别在于糖基化反应的反应温度为70℃，反应时间为150min。
实施例6-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例6-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例7-1
同实施例1-1，区别在于发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.05％。
实施例7-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例7-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例8-1
同实施例1-1，区别在于发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.25％。
实施例8-2
同实施例1-2，区别在于采用的是实施例8-1制备的肌浆蛋白糖基化接枝物。
实施例9-1
同实施例1-1。
实施例9-2
同实施例1-2，区别在于肌浆蛋白肽糖基化接枝物占鱼松重量的50％。
实施例10-1
同实施例1-1。
实施例10-2
同实施例1-2，区别在于每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106CFU发酵乳杆菌。
对比例1-1
按照实施例1-1的方式制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物，再按照实施例1-2制备发酵鱼松酱成品，区别在于糖基化反应时，加入的糖类为木糖。
对比例1-2
同对比例1-1，区别在于加入的糖类为海藻糖。
对比例1-3
同对比例1-1，区别在于加入的糖类为葡聚糖。
对比例1-4
同对比例1-1，区别在于加入的糖类为壳聚糖。
对比例1-5
同对比例1-1，区别在于加入的糖类为木糖和葡聚糖，木糖和葡聚糖的质量比为2:3。
对比例1-6
同对比例1-1，区别在于加入的糖类为木糖和壳聚糖，木糖和壳聚糖的质量比为2:3。
对比例2
同实施例1-2，区别在于鱼松酱的制备不加入肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
对比例3
按照实施例1-1的方式制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物，再按照实施例1-2制备发酵鱼松酱成品，区别在于对鱼松-肽糖基化接枝物混物进行发酵的菌种为植物乳杆菌CICC20265，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
测试例1
对实施例1-1～8-1、对比例1-1～1-6得到的蛋白肽糖基化接枝物进行接枝度测定，检测方法为邻苯二甲醛(OPA)法。准确称取40mg的OPA溶于1mL甲醇中，分别加入20％(w/v)十二烷基磺酸钠溶液2.5mL，0.1mol/L硼砂溶液25mL，β-巯基乙醇100μL，混合均匀后用蒸馏水定容至50mL，得到OPA试剂。测定时，取OPA试剂4mL于试管中，加入200μL固形物含量为30％接枝物，混合均匀后于35℃水浴2min，在340nm处测定溶液吸光值Ct，同时作空白对照C0。接枝度(％)＝(C0－Ct)/C0×100。接枝度测定结果如表1和表2所示。
表1不同实施例制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度
实施例 接枝度(％) 实施例 接枝度(％)
1-1 40.05 5-1 30.48
2-1 30.29 6-1 37.07
3-1 35.47 7-1 31.19
4-1 32.12 8-1 38.24
表2不同糖类制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度
对比例 接枝度(％) 对比例 接枝度(％)
1-1 17.78 1-4 10.68
1-2 13.86 1-5 22.34
1-3 9.37 1-6 24.82
表1和表2表明，利用本发明方法制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度为30％～40％，将糖类替换成木糖或海藻糖或葡聚糖或壳聚糖或木糖：葡聚糖＝2:3或木糖：壳聚糖＝2:3后，制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的接枝度均在25％以下。本发明的方案更有利于提高接枝度。
测试例2
分别对实施例1-1～8-1和对比例1-1～1-6制备得到的蛋白肽糖基化接枝物进行DPPH·清除能力和总抗氧化能力测定，检测方法为：1)DPPH·清除能力：将0.2mmol/L的DPPH溶液(95％甲醇作为溶剂)3mL与固形物含量为30％的1mL接枝物样品或95％甲醇(对照)1mL混合均匀，并在室温下静置20min。经10000×g离心10min，取上清液，于517nm处测定吸光值。DPPH·清除率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100。2)总抗氧化能力：利用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，在520nm处检测固形物含量为30％的接枝物的总抗氧化能力，结果如表3和表4所示。
表3不同实施例制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的抗氧化能力
实施例 DPPH·清除能力(％) 总抗氧化能力(U/mg蛋白)
1-1 80.63 5.21
2-1 72.23 3.79
3-1 68.44 4.41
4-1 75.12 5.02
5-1 73.29 4.45
6-1 62.03 3.67
7-1 73.18 4.88
8-1 69.45 4.36
表4不同糖类制备肌浆蛋白肽糖基化接枝物的的抗氧化能力
对比例 DPPH·清除能力(％) 总抗氧化能力(U/mg蛋白)
1-1 60.01 3.89
1-2 51.27 3.55
1-3 46.02 2.97
1-4 45.76 2.81
1-5 54.55 3.48
1-6 57.06 3.56
表3和表4表明，利用本发明方法制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的DPPH·清除能力为62.03％～80.63％，总抗氧化能力为3.67～5.21U/mg蛋白。将糖类替换成木糖或海藻糖或葡聚糖或壳聚糖或木糖：葡聚糖＝2:3或木糖：壳聚糖＝2:3后，制备的肌浆蛋白肽糖基化接枝物的DPPH·清除能力和总抗氧化能力均较低，分别为46.02％～60.01％和2.81～3.89U/mg蛋白。
测试例3
分别对实施例1-2～10-2和对比例2～3制备得到的鱼松酱在20℃贮藏第0d、30d、60d和120d时进行TBA(硫代巴比妥酸)值、羰基值测定；对实施例1-2和对比例2～3制备得到的鱼松酱在20℃贮藏第0d、30d、60d和120d时进行挥发性风味物质和总抗氧化能力测定，检测方法为：
1)TBA值测定：取鱼松酱10g于具塞锥形瓶，加入50mL 7.5％三氯乙酸(含0.1％乙二胺四乙酸二钠)溶液，水浴振荡30min，使其充分溶解，并用滤纸过滤2次。吸取5mL滤液于试管中，加入5mL 0.02mol/L的TBA溶液，混匀后放入90℃水浴锅中保温40min，取出。冷却后加入5mL三氯甲烷，混匀，静置分层后取上清液，在波长532nm处测定吸光度。TBA值以每千克脂质氧化样品中丙二醛的毫克数表示。TBA值(mg/kg)＝m2/m1。式中：m1为肉样的质量(kg)；m2为丙二醛的质量(mg)。结果如图1和表5所示。
2)羰基值测定：取2.0g鱼松酱于20mL含0.6mol/LNaCl的40mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)中匀浆，12000g离心5min，取上清液。调整上清液蛋白浓度至4mg/L。取4mg/L的蛋白溶液1mL，加入10mmol/L的DNPH溶液1mL，混匀，暗处反应40min(25℃)。加入20％(w/v)的TCA溶液1mL，混匀后于12000g离心10min(4℃)。收集沉淀，用1mL乙醇-乙酸乙酯溶液(1:1(v:v))洗涤3次，将沉淀溶解于3mL盐酸胍溶液中(6mol/L)，并在37℃水浴15min。随后，12000g离心5min，取上清液于370nm处测定吸光度值。羰基含量(nmol/mg蛋白)用摩尔吸光系数22000L/(mol·cm)计算。结果如图2和表6所示。
3)DPPH·清除能力：取鱼松酱50g，加入0.01mol/L盐酸200mL高速均浆，然后纱布过滤。在滤液中加入3倍体积乙醇，混匀后离心。取离心后的上清液在旋转蒸发器中回收溶剂。将旋蒸后的样品溶解在0.01mol/L盐酸(25mL)中，用于DPPH·清除能力测定。将0.2mmol/L的DPPH溶液(95％甲醇作为溶剂)3mL与待测样品1mL或95％甲醇(对照)1mL混合均匀，并在室温下静置20min。经10000×g离心10min，取上清液，于517nm处测定吸光值。DPPH·清除率(％)＝(A对照-A样品)/A对照×100。测定结果如图3和表7所示。
4)挥发性风味物质测定：取鱼松酱1g置于20mL顶空瓶中，压盖密封。将装有涂层厚度为75μm的CAR/PDMS型纤维头的萃取针头通过顶空瓶的密封顶部，在60℃下萃取30min，然后注入GC-MS仪分析。GC条件：DB-5MS气相色谱柱；进样口温度250℃，不分流模式；流速为1mL/min的氦气作为载气；升温程序：45℃维持5min，以10℃/min的速度升温至80℃，进一步以5℃/min的速度升温至240℃。MS条件：电离能为70eV，捕获范围为30～450m/z，扫描速率4.5scans/s，获得质谱。鱼松酱中风味物质的鉴定以其保留时间和NIST 08标准库比对确定，最终报道正反匹配因子均大于800的结果。挥发性风味物质含量(％)采用面积归一化法，用各物质的峰面积占总峰面积的百分比表示，即相对峰面积。挥发性风味物质含量(％)测定结果如图4和表8所示。
表5不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的TBA值(mg/kg)变化结果
处理 0d 30d 60d 120d
实施例1-2 0.09 0.22 0.54 1.07
实施例2-2 0.18 0.40 0.75 1.58
实施例3-2 0.14 0.31 0.66 1.28
实施例4-2 0.11 0.28 0.58 1.10
实施例5-2 0.12 0.30 0.64 1.12
实施例6-2 0.19 0.46 0.72 1.57
实施例7-2 0.12 0.33 0.68 1.23
实施例8-2 0.15 0.36 0.70 1.28
实施例9-2 0.18 0.45 0.72 1.46
实施例10-2 0.17 0.45 0.89 1.87
对比例2 0.19 0.62 1.08 2.33
对比例3 0.18 0.55 0.99 2.17
表6不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的羰基值(nmol/mg蛋白)变化结果
Figure BDA0003535864410000141
Figure BDA0003535864410000151
表7不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的DPPH·能力(％)变化结果
处理 0d 30d 60d 120d
实施例1-2 88.75 86.44 80.78 68.33
对比例2 82.17 77.97 72.06 50.19
对比例3 85.42 81.01 70.47 52.04
表8不同发酵鱼松酱在贮藏120d期间的挥发性风味物质含量(％)变化结果
处理 0d 30d 60d 120d
实施例1-2 87.47 84.12 83.30 74.55
对比例2 75.22 72.48 74.25 62.33
对比例3 80.13 81.04 79.68 70.14
由以上实施例和对比例可知，本发明提供的方法使制备的发酵鱼松酱具有很强的抗氧化性和氧化稳定性，在贮藏期内具有更好地挥发性风味物质保持率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种肌浆蛋白肽糖基化接枝物的制备方法，包括以下步骤：
将鱼肉与磷酸盐缓冲液混合匀浆后进行第一次离心，得到上清液；
将所述上清液与乳酸混合后进行第二次离心，收集沉淀物，得到肌浆蛋白；
将所述肌浆蛋白与含有葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液混合，得到肌浆蛋白溶液；
将所述肌浆蛋白溶液进行发酵，得到肌浆蛋白肽液；
将所述肌浆蛋白肽液与糖类混合，进行糖基化反应，得到肌浆蛋白肽糖基化接枝物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖基化反应的反应温度为50～70℃，反应时间为90～150min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖类包括木糖和海藻糖；所述木糖和海藻糖的质量比为(1～3)：(1～3)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵用菌的接种量为肌浆蛋白溶液质量的0.05％～0.25％；所述发酵用菌包括嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比为95:5；所述发酵用菌的总活力为250Danisco单位。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为40～45℃，时间为10～15h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鱼肉取自但不限于冷水鱼的背部肌肉；所述冷水鱼包括腹鱼、鲟鱼和鲑鳟鱼中的一种或几种。
7.权利要求1～6任一项所述方法制备得到的肌浆蛋白肽糖基化接枝物，其特征在于，所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物中固形物含量为25％～35％，接枝度为30％～40％。
8.一种利用权利要求7所述肌浆蛋白肽糖基化接枝物制备发酵肉松酱的方法，包括以下步骤：
将肉松与肌浆蛋白肽糖基化接枝物混合，得到肉松-肽糖基化接枝物混物；
利用发酵乳杆菌对所述肉松-肽糖基化接枝物混物进行发酵，得到发酵肉松酱。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每克肉松-肽糖基化接枝物混物接种106～108CFU发酵乳杆菌。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35～40℃，时间为4～8h。
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