CN114573704B - Pd-1/ctla-4结合蛋白及其医药用途 - Google Patents

Pd-1/ctla-4结合蛋白及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及PD‑1/CTLA‑4结合蛋白及其医药用途。具体而言，本公开涉及PD‑1/CTLA‑4结合蛋白及其治疗癌症的制药用途，所述PD‑1/CTLA‑4结合蛋白包含特异性结合PD‑1的第一抗原结合结构域和特异性结合CTLA‑4的第二抗原结合结构域。

Description

PD-1/CTLA-4结合蛋白及其医药用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，涉及PD-1/CTLA-4结合蛋白及其用于治疗疾病(例如癌症)。
背景技术
PD-1(Programmed Cell death-1)属于CD28受体家族，是免疫抑制性受体。PD-1是I型跨膜蛋白，主要表达在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞(Chen等人2013，Nat.Rev.Immunol.13:227-42)，有两种细胞表面的糖蛋白配体，分别是PD-L1和PD-L2。PD-1与PD-L1或PD-L2结合后，会下调T细胞的功能，包括降低T细胞的活化、分化增殖和细胞因子的分泌等。阻断PD-1和PD-L1的相互作用能够逆转免疫抑制，而同时抑制PD-1和PD-L1、PD-L2的作用能够起到协同作用。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，又称CD152)，是一种具有免疫检查点和下调免疫反应功能的受体蛋白，表达于活化的CD4+和CD8+T细胞，能够中止激活的T细胞的反应以及介导Treg的抑制功能，因此，CTLA-4抗体或CTLA-4配体可以阻止CTLA-4结合其天然配体，从而阻断CTLA-4转导T细胞负调节信号和增强T细胞对多种抗原的响应性(Margaret K等(2010)，Semin Oncol.37(5):473-484.4)。目前，已有CTLA-4抗体伊匹单抗(ipilimumab，
Figure BDA0003538252640000011
)获批上市治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、间皮瘤、结直肠癌、肝细胞癌。另有tremelimumab、zalifrelimab等CTLA-4抗体正在临床研究中，用于治疗膀胱癌、小细胞肺癌、子***肿瘤、血管肉瘤、软组织肉瘤等癌症。
驼科动物会产生单域抗体，分子量只有12-15kDa，是传统抗体的十分之一。单域抗体含有3个CDR，其中CDR3对亲和力起到主要作用。与人抗体VH相比，单域抗体的CDR3更长，可以形成凸环(bulge loop)结构，能够深入抗原内部，从而更好地结合抗原。此外，单域抗体中FR2的疏水残基被亲水残基取代，水溶性更好，不易形成聚集体。与传统抗体相比，单域抗体具有高结合力、高特异性、高溶解度、高稳定性和高表达量等诸多优点。
目前，全球范围内针对PD-1的单域抗体均处于早期开发阶段，尚没有靶向PD-1的单域抗体药物上市，也没有针对PD-1/CTLA-4的双抗药物上市，均处于早期开发阶段。本公开提供了能同时结合PD-1和CTLA-4的双特异性抗体，能阻断PD-1-和CTLA-4介导的免疫***抑制，以促进免疫***的激活或继续激活，有效治疗癌症和病原体相关的疾病。
发明内容
本公开提供一种PD-1结合蛋白，更具体的，提供一种PD-1/CTLA-4结合蛋白或PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的联用，及其医药用途。
PD-1/CTLA-4结合蛋白
本公开提供了一种PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域和特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域，所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1包含如X22KCMG(SEQ ID NO：152)所示的氨基酸序列，其中，X22选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S，CDR2包含如VVDRFGGTIYAX25SVKG(SEQ ID NO：187)所示的氨基酸序列，其中，X25选自A或D，CDR3包含如GSYTSA X23SCQPDAL(SEQ ID NO：153)所示的氨基酸序列，其中，X23选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含X1IDSVGX2TX3YX4X5SVKG(SEQ IDNO：115)所示氨基酸序列，其中，X1选自S或T，X2选自T或A，X3选自D、N或G，X4选自T或A，X5选自N或D，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含VVDRX24GGX6IYAX7SVKX8(SEQ IDNO：116)所示氨基酸序列，其中，X24选自Y或F，X6选自I或T，X7选自A或D，X8选自K或D，CDR3包含GSYTX9X10X11SCX12PDAL(SEQ ID NO：117)所示氨基酸序列，其中，X9选自S或D，X10选自A或D，X11选自N或G，X12选自Q或H；或
CDR1包含YNX13MX14(SEQ ID NO：118)所示氨基酸序列，其中，X13选自F或Y，X14选自S或T，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含VINTGX15NX16TYYADSVKG(SEQID NO：119)所示氨基酸序列，其中，X15选自A或T，X16选自S或T，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含X17YPTAGX18TYX19X20DSX21KG(SEQ ID NO：120)所示氨基酸序列，其中，X17选自L或I，X18选自R或K，X19选自Y或F，X20选自G或A，X21选自M或V，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：59、60、61所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：74、75、76所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：88、89、90所示氨基酸序列；
或，CDR1、CDR2、CDR3分别包含SEQ ID NO：96、97、98所示氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域包含如下的CDR1、CDR2和CDR3：
CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、82、145所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、82、145所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、82、146所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、82、146所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、71、145所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、71、145所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、71、146所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、71、146所示的氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、63、73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、94、95所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
VH包含如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含如SEQ ID NO：161、163所示的LCDR1、LCDR3，以及GAF氨基酸序列所示的LCDR2。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的VH包含如SEQ ID NO：164所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：165所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；一些具体实施方案中，VH包含如SEQID NO：164所示氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：165所示氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)；例如，全长重链为IgG1或IgG4同种型，全长轻链为Kappa同种型；例如，全长重链为SEQ ID NO：166所示或与之具有至少90％序列同一性，全长轻链为SEQ ID NO：167所示或与之具有至少90％序列同一性；例如，全长重链、全长轻链分别为SEQ ID NO：166、167所示。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的重链可变区或全长重链的N端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的重链可变区或全长重链的C端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的轻链可变区或全长轻链的N端；和/或
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的轻链可变区或全长轻链的C端。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中，特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；例如，所述GGGS(SEQ ID NO：174)、LGGGSG(SEQ ID NO：175)、GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO：176)、ASTKG(SEQ IDNO:177)、DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：178)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：179)、LEPKSS(SEQ IDNO:180)、APSSS(SEQ ID NO：181)和APSSSPME(SEQ ID NO：182)、LEPKSADKTHTCPPC(SEQ ID NO：183)、GGC和GGG；又例如，所述连接子为具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数(例如，x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)；例如，所述连接子为(G4S)4、(G4S)6所示的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，第一多肽链包含如SEQ ID NO：168-173任一所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，第二多肽链包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，PD-1/CTLA-4结合蛋白的第一多肽链包含如SEQ ID NO：168-173任一所示的氨基酸序列，第二多肽链包含如包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列。
一些实施方案中的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其具有选自以下至少一项的活性：
(a)以≤10-7的KD值与人PD-1或其片段结合；
(b)以≤10-7的KD值与人CTLA-4或其片段结合；
(c)抑制PD-1与PD-L1的结合；
(d)抑制PD-1与PD-L2的结合；
(e)抑制CTLA-4与CD80和/或CD86的结合；
(f)诱导T细胞分泌IFN-γ和/或IL-2；
(g)增强PBMC的活化；
(h)增强T细胞的活化、刺激T细胞应答或刺激T细胞增殖；
(i)抑制肿瘤生长、延缓癌症发展。
一些实施方案中，上述PD-1/CTLA-4结合蛋白为抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体含有前述本公开提供的特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域中的免疫球蛋白单一可变结构域，和前述本公开提供的特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体中：
特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域为第一抗体，其是VHH，具有前述本公开提供的任意免疫球蛋白单一可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3；和，特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域为第二抗体，其包括重链(HC)和轻链(LC)。
一些具体实施方案中，所述第二抗体为任意的抗CTLA-4抗体。例如，示例性抗CTLA4抗体包括替西木单抗(tremelimumab)(例如公开于US6682736和WO00/37504中)；和伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS编号477202-00-9，其公开于例如US5811097、US7605238、WO00/32231和WO97/20574中)。其他示例性的抗CTLA-4抗体公开于例如US5811097、WO2014209804A、WO2017128534A、WO2017106061A、WO2017193032A、WO2017218707A、WO2019090002A、WO2019179391A、WO2019179421A、WO2019094637A、WO2020205516A、WO2020057610A、WO2020057611A以及WO2021023117A。
一些具体实施方案中，所述VHH作为第一抗***于第二抗体的重链或轻链的N端和/或C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体包含1个第二抗体和2个VHH的第一抗体；所述第二抗体包括两条HC和两条LC，第二抗体的一条HC的VH与一条LC的VL形成抗原结合部位，另一条HC的VH与另一条LC的VL形成抗原结合部位。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的一个VHH的第一抗***于第二抗体的重链或轻链的N端，另一个VHH的第一抗***于第二抗体的重链或轻链的C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体中每个VHH的第一抗体分别位于第二抗体的两条重链或两条轻链的N端；或者，每个VHH的第一抗体分别位于第二抗体的两条重链或两条轻链的C端。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的每个VHH的第一抗体分别位于第一抗体的两条重链的N端；或者，每个VHH的第一抗体分别位于第一抗体的两条重链的C端；
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的第二抗体可以连接有1、2、3、4、5、6、7、8个VHH的第一抗体，所述VHH的第一抗体可以是相同的或不同的，可以均连接在第二抗体的重链N端，或均连接在第二抗体的重链C端，或均连接在第二抗体的轻链N端，或均连接在第二抗体的轻链C端，或重链N端、重链C端、轻链N端、轻链C端的任意组合。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体中的VHH的第一抗体直接或通过连接子与第二抗体的每条重链的N端或C端连接。所述连接子选自：如(GmSn)x所示的氨基酸序列，其中m、n各自独立地选自1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x独立地选自1-20的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。例如，连接子为G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G4S)6所示的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的第二抗体的重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)，轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。第二抗体可以为全长抗体。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的第二抗体的重链为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如为IgG1同种型；和/或，所述第二抗体的轻链为Kappa同种型。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的两条HC包含相同的CDR和/或两条LC包含相同的CDR。一些具体实施方案中，第二抗体的两条HC包含相同的VH和/或两条LC包含相同的VL。一些具体实施方案中，第二抗体的两条HC具有相同的氨基酸序列和/或两条LC具有相同的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体两个VHH的第一抗体具有相同或不相同的氨基酸序列。例如，两个所述VHH的第一抗体具有相同的氨基酸序列。
一些实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体包含两条第一多肽链和两条第二多肽链，其中对于每条多肽链：
a)第一多肽链各自独立地包含VHH的第一抗体和第二抗体的重链(HC)；和b)第二多肽链各自独立地包含第二抗体的轻链(LC)；其中，VHH通过连接子与第一抗体的HC的N端和/或C端相连；或者，
i)第一多肽链各自独立地包含第二抗体的重链(HC)；和ii)第二多肽链各自独立地包含VHH的第一抗体和第二抗体的轻链(LC)；其中，VHH直接或通过连接子与第二抗体的LC的N端和/或C端相连。
一些具体实施方案中，抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体包含两条相同的第一多肽链和两条相同的第二多肽链。
一些实施方案中，提供与本公开的PD-1结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1抗体、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体竞争性结合相同表位的抗体。
一些实施方案中，本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体还包含人免疫球蛋白Fc区；例如，所述Fc区是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区。所述Fc区可以具有突变。示例性突变选自：IgG1上的L234A/L235A，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P或S228P/F234A/L235A，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358MV309L/A330S/P331S，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S，以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
一些具体的实施方案中，所述人IgG4的Fc区具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突变。一些具体的实施方案中，所述人IgG1的Fc区具有L234A/L235A或L234A/L235A/P329G突变。
PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物
本公开提供含有PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物，其中PD-1结合蛋白包含前述本公开提供的特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域，CTLA-4结合蛋白包含前述本公开提供的特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域。
一些实施方案中，组合物中的PD-1结合蛋白包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一序列中的CDR1、CDR2、CDR3所示，CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号***定义的，一些具体实施方案中，是根据Kabat编号***定义的。
一些实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域中：
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：152、187、153所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、115、64所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、116、117所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：118、66、67所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：84、119、86所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：78、120、80所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：59-61所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：74-76所示氨基酸序列；
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：88-90所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：96-98所示氨基酸序列。
一些具体方案中，CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、82、145所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、82、145所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、82、146所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、82、146所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、71、145所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、71、145所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：129、71、146所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：132、71、146所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、63、73所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、94、95所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白中的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH，例如，所述VHH为人源化的和/或经亲和力成熟的VHH。
一些实施方案中，PD-1结合蛋白为特异性结合PD-1或其片段的抗体；优选地，所述抗体为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。一些具体实施方案中，PD-1结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区，例如人IgG1或IgG4的Fc区，所述人IgG4的Fc区例如具有S228P、F234A、L235A和/或K447A的突变。
一些实施方案中，CTLA-4结合蛋白为抗CTLA-4抗体。例如，替西木单抗和伊匹单抗，其他示例性的抗CTLA-4抗体公开于US5811097、WO2014209804A、WO2017128534A、WO2017106061A、WO2017193032A、WO2017218707A、WO2019090002A、WO2019179391A、WO2019179421A、WO2019094637A、WO2020205516A、WO2020057610A、WO2020057611A以及WO2021023117A。
一些实施方案中，CTLA-4结合蛋白包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：VH包含如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含如SEQ ID NO：161、163所示的LCDR1、LCDR3，以及GAF氨基酸序列所示的LCDR2。
一些具体实施方案中，CTLA-4结合蛋白为全长抗体，包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)，全长重链例如为IgG1或IgG4同种型，全长轻链例如为Kappa同种型。
一些具体实施方案中，CTLA-4结合蛋白的VH包含如SEQ ID NO：164所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQ IDNO：165所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列；一些具体方案中，VH包含如SEQ ID NO：164所示氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：165所示氨基酸序列与之具有至少95％同一性。
一些具体实施方案中，CTLA-4结合蛋白的全长重链为SEQ ID NO：166所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，全长轻链为SEQ IDNO：167所示或与之具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性；一些具体方案中，CTLA-4结合蛋白的全长重链、全长轻链分别为SEQ ID NO：166、167所示。
多核苷酸
本公开提供编码本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的多核苷酸。本公开的多核苷酸可为RNA、DNA或cDNA。根据本公开的一些实施方案，本公开的多核苷酸是基本上分离的核酸。
本公开的多核苷酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒、YAC或病毒载体。载体可尤其为表达载体，即可提供PD-1结合蛋白体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达***中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本公开的核酸，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。针对在特定宿主中的表达对所述元件及其序列进行选择为本领域技术人员的常识。对本公开的PD-1结合蛋白的表达有用或必需的调控元件及其他元件例如为启动子、增强子、终止子、整合因子、选择标记物、前导序列、报告基因。
本公开的多核苷酸可基于本公开的多肽的氨基酸序列的信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。
宿主细胞
本公开提供表达或能够表达一种或多种本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体和/或含有本公开的多核苷酸或载体的重组宿主细胞。一些实施方案中，宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
细菌细胞例如包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及***菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。
真菌细胞例如包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
哺乳动物细胞例如包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。
然而，本公开也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。
本公开的细胞不能发育成完成的植株或动物个体。
生产或制备方法
本公开提供制备本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的条件下培养本公开的宿主细胞；及
-从培养物回收由所述宿主细胞表达的目的蛋白；及
-任选的，包括进一步纯化和/或修饰本公开的目的蛋白。
本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。
用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本公开的PD-1结合蛋白的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。
然而，本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。
药物组合物
本公开提供药物组合物，其含有预防或治疗有效量的如上所述的本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其编码多核苷酸，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
一些具体实施方案中，所述药物组合物单位剂量中可含有0.01至99重量％的PD-1结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白或抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体。另一些具体实施方案中，药物组合物单位剂量中含PD-1结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白或抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的量为0.1-2000mg；一些具体实施方案中为1-1000mg。
试剂盒
本公开提供试剂盒，包含本公开的PD-1结合蛋白、CTLA-4结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体和/或其编码多核苷酸。一些实施方案中，还提供包含上述多核苷酸的诊断试剂，以及提供相关诊断用途。
治疗疾病的方法和制药用途
本公开提供了本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物在预防和/或治疗疾病中用途和方法，所述疾病可以是与PD-1信号通路相关或不相关的。一些实施方案中，本公开提供一种预防和/或治疗与PD-1相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1结合蛋白，或包含本公开PD-1结合蛋白的药物组合物。以及，还提供在制备本公开的PD-1结合蛋白在预防和/或与PD-1相关疾病的药物中的用途。
本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物可以单独使用，或者与其它抗肿瘤治疗手段联合使用(例如与其他免疫原性剂、标准癌症疗法或其他抗体分子联合使用)，以抑制癌性肿瘤的生长。
一些实施方案中，本公开提供一种促进T细胞增殖的方法，另一些实施方案中，本公开提供一种使患者或受试者从免疫反应上调获益的方法，另一些实施方案中，提供一种促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达的方法，所述方法均包括向患者或受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物。
一些实施方案中，本公开提供一种预防和/或治疗癌症的方法，包括给患者或受试者施用预防和/或治疗有效量的本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物，抑制患者或受试者中的肿瘤细胞生长。一些具体实施方案中，所述癌症优选但不限于对免疫治疗有应答的癌症。
以上方法中，癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤(例如转移的恶性黑色素瘤)、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、***、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本公开的方法治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、***癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***癌、***癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。一些实施方案中，上述癌症或肿瘤是转移性的。
一些实施方案中，本公开提供一种PD-1和/或CTLA-4的相关病症和疾病的方法，所述病症和疾病包括自身免疫性疾病，例如***性红斑狼疮(SLE)，牛皮癣，***性硬皮病，自身免疫性糖尿病等，包括施用有效量的本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物。
此外，本公开还提供一种预防和/或治疗受试者或患者中的感染性疾病的方法，包括给该受试者或患者施用本公开的PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体或其抗原结合片段、PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白的组合物、多核苷酸、药物组合物，使得所述对象的感染性疾病得到预防和/或治疗。类似于对于如上所述的肿瘤的应用，PD-1结合蛋白可以单独使用，或者与疫苗组合使用来刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。特别可以应用该治疗方法的病原体的示例包括当前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗不完全有效的病原体。其中包括但不限于HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌。
本公开同时提供PD-1结合蛋白、PD-1/CTLA-4结合蛋白、PD-1结合蛋白里联合CTLA-4结合蛋白用于上述方法的制药用途。
一些实施方案中，提供PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白联合用于制备***(癌症)、治疗自身免疫性疾病、治疗感染、促进T细胞增殖、使受试者或患者从免疫反应上调获益和/或促进受试者或患者体内细胞因子(如INFγ、IL-2)表达的药物的用途。
本公开包括以下实施方案：
1.PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含：
特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域、和
特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域，
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：
1)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：152、187、153所示的氨基酸序列；或
2)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：62、115、64所示氨基酸序列；或
3)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：81、116、117所示氨基酸序列；或
4)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：118、66、67所示氨基酸序列；或
5)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：84、119、86所示氨基酸序列；或
6)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：78、120、80所示氨基酸序列；或
7)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：59、60、61所示氨基酸序列；或
8)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：74、75、76所示氨基酸序列；或
9)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：88、89、90所示氨基酸序列；或
10)CDR1、CDR2和CDR3分别包含如SEQ ID NO：96、97、98所示氨基酸序列。
2.如第1项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含如下的CDR1、CDR2和CDR3：
1)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
2)CDR1包含如SEQ ID NO：129-141任一所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ IDNO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列；或
3)CDR1包含如SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：142-151任一所示的氨基酸序列；或
4)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：145所示的氨基酸序列；或
5)CDR1包含如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
6)CDR1包含如SEQ ID NO：132所示的氨基酸序列，CDR2包含如SEQ ID NO：71或82所示的氨基酸序列，CDR3包含如SEQ ID NO：146所示的氨基酸序列；或
7)CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63、68、69、70、72、77任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：64所示氨基酸序列；或
8)CDR1包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：63所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：73所示氨基酸序列；或
9)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：71、82任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列；或
10)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：91、93任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列；或
11)CDR1包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：94所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：95所示氨基酸序列；或
12)CDR1包含SEQ ID NO：65、113、114任一所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列；或
13)CDR1包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：85、102任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列；或
14)CDR1包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO：79、87、99、100、101任一所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO：80所示氨基酸序列。
3.如第1或2项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：154-157、7-33、35-58、123-128任一所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
4.如前述任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
VH包含分别如SEQ ID NO：158-160所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，VL包含分别如SEQID NO：161、163所示的LCDR1、LCDR3，以及GAF氨基酸序列所示的LCDR2。
5.如第4项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述VH包含如SEQ ID NO：164所示或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，VL包含如SEQID NO：165或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
6.如第4或5项任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含全长重链(HC)和全长轻链(LC)；
优选地，全长重链为IgG1或IgG4同种型，全长轻链为Kappa同种型；
更优选地，全长重链为SEQ ID NO：166所示或与之具有至少90％序列同一性，全长轻链为SEQ ID NO：167所示或与之具有至少90％序列同一性。
7.如前述任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中：
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的重链可变区的N端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的重链可变区的C端；
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的轻链可变区的N端；和/或
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域位于特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域的轻链可变区的C端。
8.如第7项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其中，特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域的免疫球蛋白单一可变结构域与特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域直接或通过连接子相连接；
优选地，所述连接子为具有如(G4S)x所示的氨基酸序列，其中，x独立地选自1-20的整数；
更优选地，所述连接子为(G4S)4、(G4S)6所示的氨基酸序列。
9.如前述任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中：
第一多肽链包含如SEQ ID NO：168-173任一所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，
第二多肽链包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列或与之具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。
10.抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体，其含有：
第1-3项任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域，和
第4-5项任一项所述第二抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
优选地，所述抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体还含有人IgG1或IgG4的Fc区。
11.多核苷酸，其编码第1-9项任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，或第10项所述的抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体。
12.载体，其包含第11项所述的多核苷酸。
13.宿主细胞，其包含第12项所述的载体。
14.制备PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的方法，包括步骤：
培养第13项所述的宿主细胞；
回收所述第1-9项任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白或第10项所述的抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体；
任选地，纯化和/或修饰所述PD-1/CTLA-4结合蛋白、抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体。
15.组合物或药盒，其包含PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白，所述PD-1结合蛋白包含第1-3项任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域；
优选地，所述CTLA-4结合蛋白包含第4-5项任一项所述第二抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，或第6项所述第二抗原结合结构域中的全长重链(HC)和全长轻链(LC)；
优选地，PD-1结合蛋白和CTLA-4结合蛋白在相同或不同的容器中。
16.如第15项所述的组合物或药盒，所述的免疫球蛋白单一可变结构域是VHH，优选地，所述VHH为人源化的和/或经亲和力成熟的VHH。
17.如第15-16项任一项所述的组合物或药盒，所述的PD-1结合蛋白为特异性结合PD-1或其片段的抗体；优选地，所述抗体为骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。
18.如第15-17项任一项所述的组合物或药盒，所述的PD-1结合蛋白还包含人免疫球蛋白Fc区；
优选地，所述Fc区是人IgG1或IgG4的Fc区；
更优选地，所述人IgG4的Fc区具有228P、234A、235A和/或447A突变。
19.如第15-18项任一项所述的组合物或药盒，所述CTLA-4结合蛋白包含第4-5项任一项所述第二抗原结合结构域中的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，或第6项所述第二抗原结合结构域中的全长重链(HC)和全长轻链(LC)。
20.药物组合物，其包含：
一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂，以及
选自以下的任一项：
治疗有效量或预防有效量的第1-9项任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白、第10项所述的抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体、第11所述的多核苷酸、第15-19项任一项所述的组合物或药盒、或其组合。
21.第1-9项任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白、第10所述的抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体、第15-19项任一项所述的组合物或药盒、第20项所述的药物组合物或其组合在制备药物中的用途，所述药物用于选自以下的任一项：
预防癌症、治疗癌症、抑制PD-1和/或CTLA-4活性、促进T细胞增殖。
22.PD-1结合蛋白联合CTLA-4结合蛋白用于制备治疗癌症的药物的用途，所述PD-1结合蛋白包含第1-3项任一项所述的免疫球蛋白单一可变结构域，所述CTLA-4结合蛋白包含第4-6项任一项中所述的第二抗原结合结构域；
优选地，所述癌症选自肺癌、***癌、乳腺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、***、子宫癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、肾癌、鳞状细胞癌、血液***癌症、或者特征在于不受控细胞生长的疾病或病症。
附图说明
图1为PD-1抗体与稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1上PD-1的结合结果图。
图2为PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1上PD-1结合的结果图。
图3为PD-1抗体在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活结果图。
图4为编号为7#、32#、32#_hu_3、106#、107#的PD-1抗体体外激活T细胞并分泌IFNγ的结果图。
图5为编号为32#_hu_3_IgG4、7#_hu_4_hIgG4、106#_hu_1_hIgG4、107#_hu_4_hIgG4的PD-1单域抗体体外激活T细胞并分泌IFNγ的结果图。
图6A-6B为PD-1抗体抑制小鼠M38结肠癌肿瘤生长结果和小鼠体重。
图7A-7B为示例性双抗结构，PR2001、PR2009和PR2011结构如图7A所示，PR2004、PR2012和PR2014如图7B所示。
图8为双抗经10％的SDS-PAGE凝胶电泳检测图。
图9为编号为PR2001、PR2004、PR2009和PR2012的抗体与稳定高表达PD-1的细胞系JURKAT-PD-1上PD-1的结合结果图。
图10为编号为PR2001、PR2004、PR2009和PR2012的抗体与高表达CTLA4的瞬转细胞系CHOK1-CTLA4上CTLA4的结合结果图。
图11为编号为PR2009的抗体在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活结果图。
图12为编号为PR2009的抗体SEB实验中，体外激活T细胞并分泌IL-2的结果图。
图13为编号为PR2009的抗体MLR实验中，体外激活T细胞并分泌IL-2的结果图。
图14A-14B为PR2009抗体抑制小鼠M38结肠癌肿瘤生长结果和小鼠体重。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
“PD-1”指T细胞共抑制物程序性死亡-1蛋白质，也称为CD279，与“程序性死亡1”、“细胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互换使用，且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物、以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。全长PD-1的氨基酸序列在GenBank中作为检索号NP_005009.2提供。术语“PD-1”包括重组PD-1或其片段。该术语还涵盖与例如组氨酸标记、小鼠或人Fc或信号序列如ROR1偶联的PD-1或其片段。例如，该术语包括SEQ ID NO：1-4示例的序列。除非指定为来自非人物种，术语“PD-1”指人PD-1。
“CTLA-4”是指细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，一种免疫检查点受体或T细胞共抑制因子，也称为CD152。全长人类CTLA-4的氨基酸序列以SEQID NO:505(寄存编号NP_005205.2)形式提供。术语“CTLA-4”包括重组CTLA-4或其片段。所述术语还涵盖例如与组氨酸标签、小鼠或人类Fc、信号序列或CD300a(aa181-299；寄存编号NP_009192.2)的跨膜结构域和细胞质结构域偶合的CTLA-4或其片段。举例来说，所述术语包括实例中所论述的序列，例如包含全长CTLA-4的C端的myc-myc-聚组氨酸标签或包含全长CTLA-4的C端的小鼠Fc(mIgG2a)。除非明确说明来自非人类物种，否则术语“CTLA-4”意思指人类CTLA-4。
“PD-1结合蛋白”意指任何能够特异性结合PD-1的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。PD-1结合蛋白可以包括针对PD-1的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。PD-1结合蛋白还涵盖免疫球蛋白超家族抗体(IgSF)或CDR移植分子。本公开的“PD-1结合蛋白”可以包含至少一个结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。在一些实施方案中，“PD-1结合蛋白”可以包含2、3、4或更多个结合PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域(如VHH)。本公开的PD-1结合蛋白除结合包含PD-1的免疫球蛋白单一可变结构域外，也可包含连接子和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本公开的“PD-1结合蛋白”还涵盖双/多特异性抗体，其含有结合不同抗原的免疫球蛋白(如结合第一抗原(如PD-1)的第一抗体和结合第二抗原(如CTLA-4)的第二抗体，可选的，包括结合第三抗原的第三抗体，进一步可选的，包括结合第四抗原的第四抗体。
“CTLA-4结合蛋白”意指任何能够特异性结合CTLA-4的蛋白或包含所述蛋白的任何分子。CTLA-4结合蛋白可以包括针对CTLA-4的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。
“PD-1/CTLA-4结合蛋白”意指任何能够特异性结合PD-1和CTLA-4的蛋白或包含所述蛋白的任何分子，涵盖前述“PD-1结合蛋白”的定义。PD-1/CTLA-4结合蛋白可以包括针对PD-1和CTLA-4的如本公开定义的抗体、其抗原结合片段或其缀合物。
“与PD-1结合”，指能与PD-1或其片段或其表位相互作用，所述PD-1或其片段或其表位可以是人源的。“与CTLA-4结合”，指能与CTLA-4或其片段或其表位相互作用，所述PD-1或其片段或其表位可以是人源的。
“抗体”或“免疫球蛋白”广义上涵盖传统的抗体(由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构抗体)，以及具有抗原结合活性的Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体(重链(VH)抗体、轻链(VL)抗体)和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)，因而，本公开中使用的“抗体”包括全长抗体、其单个的链及其任意具有抗原结合活性的部分、结构域或片段以及包含其单个的链及任意具有抗原结合活性的部分、结构域或片段的多特异性抗体(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。传统的抗体或免疫球蛋白通常是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ(kappa)链或λ(lambda)链。在一些实施例中，本公开的抗体特异性地或基本上特异性地结合到PD-1。
本公开的“抗体”包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)F(ab′)2片段，一种包含两个连接着的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接，所述肽连接子允许两个结构域结合形成抗原结合位点；(Bird等人，1988，《科学(Science)》242：423-426；Huston等人，1988，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》85：5879-5883)242，通过引用完全并入本文中)；(iv)“双功能抗体”或“三功能抗体”，通过基因融合构造的多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，《酶学方法(Methods Enzymol.)》326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，《美国美国国家科学院院刊》90：6444-6448，全部通过引用完全并入本文中)；(v)“结构域抗体”或“dAb”(有时称为“免疫球蛋白单一可变结构域”)，包括来自其它物种的免疫球蛋白单一可变结构域，如啮齿动物(例如，如WO00/29004中所公开)、护士鲨和骆驼科V-HH dAb；(vi)SMIP(小分子免疫药物)、骆驼抗体、纳米抗体以及IgNAR；(vii)上述(i)-(vi)的人源化抗体。
在未特殊指明的情况下，本公开的抗体通常使用Kabat编号***。Kabat中的EU编号一般也用于恒定结构域和/或Fc结构域。
多肽或蛋白的“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。
“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规四肽链结构抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，例如，常规四肽链结构抗体中，其由重链和轻链的链内二硫键所连接的两个β片层所组成。
“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区”和“CDR”区组成，其含有“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”，其中所述框架区由分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域因具有抗原结合位点而赋予其对抗原的特异性。
“抗体框架(FR)”，是指可变结构域的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。
对于“CDR”的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号***、Chothia编号***、AbM编号***、IMGT编号***。本文使用的方法可利用根据这些方法中的任一种定义的CDR。
“免疫球蛋白单一可变结构域”通常用于指可以在不与其他可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规四链单克隆抗体的VH和VL结构域之间所需要的VH/VL相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括VH、VHH或VL结构域)。“免疫球蛋白单一可变结构域”的实例包括纳米抗体(包括VHH、人源化VHH和/或骆驼化VH，例如骆驼化人VH)、IgNAR、结构域、作为VH结构域或衍生自VH结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)和作为VL结构域或衍生自VL结构域的(单结构域)抗体(诸如dAbsTM)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如VH或VHH结构域)的免疫球蛋白单一可变结构域通常是优选的。免疫球蛋白单一可变结构域的一个具体实例为如下文定义的“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。
“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、VHH抗体片段、VHH抗体、纳米抗体，是称为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白的可变结构域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，BendahmanN，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用术语“VHH结构域”以将所述可变结构域与存在于常规四肽链结构抗体中的重链可变结构域(其在本公开中称为“VH结构域”)以及轻链可变结构域(其在本公开中称为“VL结构域”)进行区分。VHH结构域特异性结合表位而无需其他抗原结合结构域(此与常规四肽链结构抗体中的VH或VL结构域相反，在该情况下表位由VL结构域与VH结构域一起识别)。VHH结构域为由单一免疫球蛋白结构域形成的小型稳定及高效的抗原识别单元。术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH结构域”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“结构域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。“VHH结构域”包括但不限于经骆驼科动物产生的天然抗体，也可以是骆驼科动物产生的抗体后再经人源化的，也可以是经噬菌体体展示技术筛选获得的。VHH结构域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本公开所述的目的。
“Fc变异体”或“变异体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。本公开的Fc变异体根据构成其的氨基酸修饰来定义。因此，举例来说，S228P或228P是相对于亲本Fc多肽在位置228处具有脯氨酸取代的Fc变异体，其中编号是根据EU索引。WT氨基酸的身份可以不指明，在此情况下前述变异体称为228P。
“人源化”的例子包括可将源自骆驼科的VHH结构域通过以人常规四肽链结构抗体VH结构域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而“人源化”(本公开中亦称为“序列优化”，除人源化外，“序列优化”也可涵盖通过提供VHH改良性质的一个或多个突变对序列进行的其他修饰，例如移除潜在的翻译后修饰位点)。人源化VHH结构域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在一些具体实施方案中，可含IGHV3的人框架区序列。“人源化”的又一例子包括将异源的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。人源化方法例如蛋白表面氨基酸人源化(resurfacing)及抗体人源化通用框架移植法(CDR grafting toa universal framework)，即将CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。此外，为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少回复突变或回复突变，以保持活性。
“亲和力成熟”的PD-1结合蛋白或PD-1抗体，在一个或多个CDR中具有一个或多个变化，所述变化导致对抗原的亲和力相比于其亲本抗体有所增加。亲和力成熟的抗体可通过例如由以下所述的本领域中已知的方法来制备：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KSJohnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。
通常，本公开的PD-1结合蛋白将以如于Biacore或KinExA或Fortibio测定中测量的优选10-7至10-10摩尔/升(M)、更优选10-8至10-10摩尔/升、甚至更优选10-9至10-10或更低的解离常数(KD)，和/或以至少10-7M、优选至少10-8M、更优选至少10-9M，更优选至少10-10M的缔合常数(KA)结合所要结合的抗原(即PD-1)。任何大于10-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以已知的任何适合方式来测定，包括例如本公开所述的表面等离子体共振术(SPR)测定、Scatchard测定和/或竞争性结合测定(例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)及夹心式竞争性测定。
“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。
“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人PD-1或其表位作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原或其表位结合，并且其与预定抗原或其表位结合的亲和力是其与预定抗原(或其表位)或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。
“氨基酸突变”包括氨基酸取代、缺失、***、修饰及其任意组合，以实现最终构建体，使得最终构建体拥有期望的特性，例如增强的稳定性、提高的活性。氨基酸序列缺失和***包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸***。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如抗PD-1抗体的结合特性，可以将非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变，包括定点诱变、PCR、基因合成、化学修饰等方法。氨基酸突变可以发生在抗体的CDR区、FR区或Fc区。
“回复突变”是指将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基，通常是为了避人源化抗体引起的免疫原性下降的同时，引起的活性下降，对所述的人源化抗体可变区可进行最少反向突变，以保持抗体的活性。
本公开的“PD-1结合蛋白”、“PD-1抗体”、“PD-1/CTLA-4结合蛋白”、“抗PD-1/CTLA-4抗体”可以例如缀和的方式包含一个或多个效应分子。所述“效应分子”包括例如抗肿瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱分析检测的化合物。
“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本公开需要进一步限定的解释。
“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸链，包括DNA和RNA。
“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
“药学可接受的载体”或“药学可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时，允许该成分保留生物学活性并且不与受试者的免疫***反应的任何材料。例子包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、和各种类型的润湿剂。在一些实施例中，用于气雾剂或肠胃外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制(参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，编辑，Mack PublishingCo.，Easton，PA，1990；以及R Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版MackPublishing，2000)。
“癌症”和“癌性”和“肿瘤”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，和肝细胞癌。还有，一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌，结肠直肠癌，成胶质细胞瘤和乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，包括那些癌症的转移性形式。
“预防癌症”是指在受试者中延迟、抑制或防止癌症发作，所述受试者中癌症发生或肿瘤发生的起始尚未得到证实，但是通过例如遗传筛查或其它方法确定，已鉴定了癌症易感性。该还包括治疗具有癌变前病症的受试者以终止所述癌变前病症向恶性肿瘤的进展或导致其消退。
“给予”、“施用”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触，例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”、“施用”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，诸如包含本公开的任一种抗体或其药物组合物作为治疗剂，所述受试者已经患有、疑似患有、倾向于患有一种或多种增殖性疾病或其症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床能测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个受试者中目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。本公开的受试者可以是动物或人类受试者。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
如本公开所用的“受试者”、“患者”意指哺乳动物，尤其灵长类动物，尤其是人。
具体实施方案
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：PD-1抗原及检测用蛋白的制备
PD-1抗原设计：
以人PD-1作为PD-1模板，设计PD-1抗原及检测用蛋白的氨基酸序列(以下PD-1抗原未特殊说明的均指人PD-1)。
人PD-1全长蛋白：
Figure BDA0003538252640000241
(注释：双横线部分为信号肽(Signal peptid)；划横线部分为PD-1胞外区(Extracellular domain)，其中35-144位为Ig-like V-type 1Domain，70-77位为Interaction with CD274；点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain)；斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain)。)
SEQ ID NO：1
猴PD-1全长氨基酸序列：
Figure BDA0003538252640000251
(注释：双横线部分为信号肽；划横线部分为PD-1胞外区，其中38-127位为V-SetDomain，39-125位为Ig-like；点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain)；斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain)。)
SEQ ID NO：2
筛选及检测用人PD-1抗原(为商业化产品(Sino Biological Cat.10377-H08H))：
LDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQD CRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQAHHHHHHHHHH(注释：划横线部分为PD-1胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：3
筛选及检测用人PD-1-Fc抗原(为商业化产品(百英生物：B3789))：LDSPDRPWNPPT FSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRA RRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(注释：划横线部分为胞外区；斜体部分为human Fc标记。)
SEQ ID NO：4
检测用人PD-L1抗原(为商业化产品(Sino Biological cat：10084-H08H-B))：FT VTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNA ALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQV LSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTAHHHHHHHHHH
(注释：划横线部分为PD-L1胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：5
检测用人PD-L2抗原(为商业化产品(Sino Biological cat：10292-H08H-B))：LF TVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDE GQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGL YQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPAHHHHHHHHHH(注释：划横线部分为PD-L2胞外区；斜体部分为His-tag标记。)
SEQ ID NO：6
实施例2.特异性结合人PD-1的阳性抗体序列的筛选
人PD-1蛋白(ACRO，Cat#PD-1-H5259和ACRO，Cat#PD-1-H5221)分别免疫两头双峰驼(Camelus dromedarius)，取免疫前的骆驼血清5mL并分离血清。将弗氏完全佐剂与抗原体积1：1混合后，对骆驼进行皮下多点免疫(免疫剂量为100μg蛋白/只/每次，第一次为弗氏完全佐剂，剩下的为弗氏不完全佐剂)。每两周进行一次加强免疫，免疫四次后测定效价。用5μg/mL PD-1-his蛋白包被平板(100μL/孔)，4℃过夜。第二天洗涤之后加入4％的脱脂奶粉进行封闭，37℃，2h。洗涤后加入不同梯度稀释的骆驼的血清，37℃，1h进行孵育。阴性对照为免疫前血清(1：1000稀释)和PBS溶液。孵育结束后用PBST洗涤三遍，加入HRP-抗骆驼抗体(1：5000稀释)，37℃孵育1小时。最后洗涤加入碱性磷酸酶显色液，用2M硫酸进行终止，450nm波长读取吸收值。1：25600倍稀释后检测到效价。效价合格，采集骆驼外周血进行建库。
骆驼外周血分离淋巴细胞，细胞计数为1.2×108，加入Trizol试剂重悬(1×107个细胞/mL Trizol)，以裂解细胞，冰上放置5min；13000rpm离心3min，取上清，弃沉淀；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡30-60s，冰浴静置2min；13000rpm离心10min，吸取上层水相层至新的1.5mL管中；加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min；13000rpm离心10min，去掉上清，保留沉淀；加入预冷的75％乙醇洗涤沉淀，室温放置5-10min；加入RNA酶去除的去离子水600μL，复溶，得到RNA，逆转录得到cDNA，进行噬菌体文库的构建。
通过噬菌体库的筛选来获得与PD-1抗原蛋白具有高亲和力的单域抗体，用20μg的PD-1-avi-生物素蛋白结合1mg Dynabeads MyOne链霉亲和素T1，37℃放置一小时后用2％脱脂奶室温封闭2小时，加入骆驼重链单域抗体噬菌展示文库，在室温下作用1小时。用PBST(0.05％Tween-20)溶液洗9遍，去除不结合的噬菌体。用1mg/mL的胰蛋白酶将与PD-1特异性结合的噬菌体洗脱，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。相同筛选过程重复2-3轮后。阳性的克隆被富集。
从筛选富集的阳性克隆中挑取96个单克隆菌落包装成噬菌体单链抗体，用于噬菌体ELISA测试。ELISA板上分别包被2μg/mL的PD-1-his蛋白，加入封闭液稀释的噬菌体上清，用抗M13 HRP检测。将ELISA结合测试到中OD450值大于0.5的克隆进行测序，得到51个特异性序列。
实施例3.完整单克隆抗体的构建
将实施例2通过噬菌体库筛选得到的51个特异性序列构建完整抗体，之后通过ELISA结合实验和ELISA竞争实验，确定其中25个抗体结合能力强，并能抑制PD-1与PD-L1的相互作用，结果如表1所示。
表1.PD-1抗体的ELISA检测结果
Figure BDA0003538252640000261
Figure BDA0003538252640000271
其完整的VHH序列如下：
>2
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLFCSPSGYTYSRDCMGWFRQAPGKEREGVAAICSSGRNTYYTYYADSVKG RFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADLRSSGGDLTYGLAPGPYEYKYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：7
>4
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：8
>6
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDRGGVASIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：9
>7
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLACASSRNTNRYNFMTWFRQAPGKEREGVAAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYHCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：10
>11
DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTDYADSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：11
>19
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTNYTNSVKGPFTISLDNAQNTLFLQMNILKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLDIVSS
SEQ ID NO：12
>32
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：13
>41
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTDYADSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：14
>54
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVATIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：15
>56
DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPRKDREGVASIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：16
>59
QVQLVESGGGSVQAEGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：17
>61
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSSLCMGWFRQAPGKEREGVATIYTGDSSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAAAYGRRWCERLYMYDSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：18
>62
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTDYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：19
>68
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQGPGKDREGVASIDSVGTTGYTDSVKGRFTISRDNAENTLFLQMNSLKPEDTGMYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：20
>104
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGATFSVYSMGWFRQAPGKEREAVVALYPTAGRTYYGDSVKGRFTISQDNAENTVYLQMNSLQPEDTAMYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：21
>106
EVQLVESGGGSAQAGGSLRLSCTSSTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVAVVDRFGGTIYAASVKGRFAISKDDAKNTLDLLMNSLKPEDTAMYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：22
>107
DVQLVGSGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGNEREGVAVINTGANTTYYADSVKGRF TISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCGVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：23
>108
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGATFSVYSMGWFRQAPGKERESVVALYPTAGRTYYADSVKGRFTVSQDNAENTVYLQMNSLQPEDTAMYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGIQVTVSS
SEQ ID NO：24
>109
HVQLVESGGDSVQAGGSLRLSCVVSGVTYSFRYMGWFRQAPGKERELVADIYTPSGQTYYGDSVKGRFTISHDYAKNTVHLQMNNLQPEDTAIYHCAAAEGVLGRPLTPAQYSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：25
>112
EVQLVESGGGSAQAGGSLRLSCTSSTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVAVVDRYGGIIYAASVKGRFAISKDDAKNTLDLLMNSLKAEDTAMYYCAAGSYTSDGSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：26
>113
DVQLVESGGGSAQAGGSLRLSCTSSTYTFRNKCMGWFRQAPRKEREGVAVVDRFGGTIYAASVKDRFTISKDDTKNTLDLLMNSLKPEDTAMYYCAAGSYTDAGSCHPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：27
>114
DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCTASKGYTYVRNLMAWFRQAPGNEREGVAVIYVGDTTYYADSVKGRFTISEDNAKNTIYLQMNGLKPEDTAMYYCAAKTGIIQVDDALQPNEYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：28
>116
DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCAASGATFSVYSMGWFRQAPGKEREAVAAIYPTAGRTYFADSVKGRFTISQDNAENTVYLQMNSLQAEDTAIYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：29
>118
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAGSGATFSVYSMGWFRQAPGKEREAVAAIYPTAGKTYYADSMRGRFTISQDNAENTVYLHMNSLQPEDTAMYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：30
>119
DVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCAGSGATFSVYSMGWFRQAPGKEREAVAAIYPTAGKTYYADSMKGRFTISQDNAENTVYLHMNSLQPEDTAMYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：31
>122
EVQLVESGGGSVQVGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGNEREGVAVINTGTNSTYYADSVKGRF TISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：32
>123
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGATFSVYSMGWFRQAPGKEREAVTAIYPTAGRTYFADSVKGRFTISQDNAENTVYLQMNSLQPEDTAMYYCAAGLTGRWWLPEADYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：33
以上序列SEQ ID NO：7-33中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。本公开提供的PD-1抗体的编号规则均为Kabat，将CDR序列总结如表2。
表2.PD-1单域抗体的CDR序列
Figure BDA0003538252640000301
Figure BDA0003538252640000311
将抗体序列融合一个人IgG1-Fc(CH2-CH3)段序列，并构建到PTT5表达载体中，所连接的人IgG1-Fc的序列可以如下所示：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：103
以下是抗体序列融合人Fc(CH2-CH3)段的全蛋白序列，单下划线是人IgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：103所示)，双下划线为连接子序列。蛋白序列如下(以32#、7#、106#、107#号为例，其他PD-1抗体也一样)：
32#-IgG1：
Figure BDA0003538252640000321
7#-IgG1：
Figure BDA0003538252640000322
106#-IgG1:
Figure BDA0003538252640000323
107#-IgG1:
Figure BDA0003538252640000324
实施例4.PD-1抗体的人源化改造
通过对选定的特异性PD-1单域抗体分子进行三维结构同源建模，结合与V-base人种系序列序列数据库，IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库进行比对的结果，挑选与筛选出来的抗体同源性高的重链可变区种系基因作为模板，将骆驼来源单域抗体的CDR移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。对移植后的单域抗体再次进行三维结构模拟并分析，将FR区中影响CDR区结构形态的特定位点进行回复突变。获得的人源化具体序列如下：
2#_Hu_1：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSRDCMGWFRQAPGKGLEGVSAICSSGRNTYYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADLRSSGGDLTYGLAPGPYEYKYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：35
7#_Hu_1：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMTWFRQAPGKEREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：36
7#_Hu_2：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMTWFRQAPGKGLEGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：37
7#_Hu_3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMTWFRQAPGKGREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：38
7#_Hu_4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMTWFRQAPGKEREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：39
7#_Hu_5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMSWFRQAPGKEREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：40
7#_Hu_6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNYMSWFRQAPGKEREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：41
32#_Hu_1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKGLEGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：42
32#_Hu_2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKGREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：43
32#_Hu_3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：44
32#_Hu_4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKGLEGVASIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：45
32#_Hu_5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFRYSPILMGWFRQAPGKGLEGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：46
32#_Hu_6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：123
32#_Hu_7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTYSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：124
61#_Hu_1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSSLCMGWFRQAPGKGLEGVSTIYTGDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAYGRRWCERLYMYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：47
61#_Hu_2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTYSSLCMGWFRQAPGKGLEGVSTIYTGDSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAAYGRRWCERLYMYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：48
106#_Hu_1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：49
106#_Hu_2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKGREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：50
106#_Hu_3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKGLEGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：51
106#_Hu_4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：52
106#_Hu_5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：53
106#_Hu_6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：125
106#_Hu_7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：126
106#_Hu_8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：127
106#_Hu_9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：128
107#_Hu_1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGKEREGVSVINTGANTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：54
107#_Hu_2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGKGREGVSVINTGANTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：55
107#_Hu_3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGKGLEGVSVINTGANTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：56
107#_Hu_4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGKEREGVSVINTGANTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：57
112#_Hu_1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGIIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSDGSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：58。
如上序列所示，在人源化和回复突变的过程中，部分抗体的CDR发生变化，如7#_Hu_5有T35S的突变，获的YNFMS(SEQ ID NO：113)所示的CDR1序列；7#_Hu_6有F33Y和T35S的突变，获的YNYMS(SEQ ID NO：114)所示的CDR1序列；106_hu_1至6有A61D的突变，获的VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71)所示的CDR2序列；112_hu_1有Y54F和A61D的突变，获的VVDRFGGIIYADSVKG(SEQ ID NO：93)所示的CDR2序列。
使用实施例4中的方法构建人源化PD-1单域抗体与hIgG1的Fc(CH2-CH3)段融合的全蛋白序列，单下划线是hIgG1-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：103所示)，双下划线为连接子序列。蛋白序列如下(以32_hu_3-IgG1为例，其他人源化PD-1单域抗体也一样)：
32#_hu_3-hIgG1：
Figure BDA0003538252640000361
使用实施例4中的方法构建人源化PD-1单域抗体与hIgG4的Fc(CH2-CH3)段融合的全蛋白序列，单下划线是hIgG4-Fc(CH2-CH3)段序列(SEQ ID NO：108所示)。
所连接的人IgG4-Fc的序列如下所示：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：108
获得的抗体序列如下：
32#_hu_3_hIgG4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：109
7#_hu_4_hIgG4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRNTNRYNFMTWFRQAPGKEREGVSAIYTGFGNTYYADSVKGRFTISQDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALRDGSWSSQNYDYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：110
106#_hu_1_hIgG4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：111
107#_hu_4_hIgG4：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTGNRRYCMGWFRQAPGKEREGVSVINTGANTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGVGWRALCEVNGYVYDSWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK SEQ ID NO：112
将质粒转染HEK293细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS平衡至A280读数降至基线。用pH 3.0-3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。经检测，获得本公开的PD-1单域抗体。
实施例5.PD-1抗体的糖基化改造及表达纯化
106#_hu_1_hIgG4序列中的CDR1(NKCMG)和CDR3(GSYTSANSCQPDAL)中含有两个N-糖糖基化位点(NXC)，分别是N31KC和N104SC，通过mapping(如下实施例6的具体方法)分析得到CDR1中的NKC发生糖基化的比例是11％，CDR3中的NSC发生糖基化的比例是30％，因此将N31进行如下氨基酸的突变：N31-D/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/S；N104进行如下氨基酸的突变：N104-A/E/F/G/H/K/P/Q/R/S；通过SPR(Biacore T200)的方法(如下实施例7的具体方法)筛选出亲和力变化不大的序列，分别是N31-D/G和N104-G/H。
其中106#_hu_1_hIgG4(N31-D，N104-G)命名为0076#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N31-G，N104-G)命名为0077#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N31-D，N104-H)命名为0078#_hIgG4；106#_hu_1_hIgG4(N31-G，N104-H)命名为0079#_hIgG4。CDR1和CDR2的序列总结如表3。
表3.糖基化改造PD-1抗体的CDR1、CDR2序列
(CDR2的序列均为VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71))
Figure BDA0003538252640000381
Figure BDA0003538252640000391
因此，本公开提供PD-1抗体，其CDR1为X22KCMG(SEQ ID NO：152)，其中，X22选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S；CDR2为VVDRFGGTIYADSVKG(SEQ ID NO：71)；CDR3为GSYTSAX23SCQPDAL(SEQ ID NO：153)，其中，X23选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S。
106#_hu_1糖基化改造后获得的抗体序列示例如下：
0076#
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：154
0077#
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKGKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：155
0078#
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAHSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：156
0079#
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKGKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAHSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：157
0076#_hIgG4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：184
0077#_hIgG4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKGKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：185
0078#_hIgG4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAHSCQPDALWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：186
0079#_hIgG4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKGKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAHSCQPDALWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：162
构建质粒转染Expi-CHO细胞，培养9天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS平衡至A280读数降至基线。用pH3.0-3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。经检测，制备获得本公开的PD-1抗体。
实施例6.PD-1抗体的质谱分析与糖基化分析
仪器设备：美国Agilent Q TOF 6530质谱仪，配有Dual AJS ESI离子源及数据分析软件Agilent MassHunter BioConfirm Software B.08.00，美国Agilent公司Agilent1290Infinity高效液相色谱***。
色谱条件：色谱柱为Agilent AdvanceBio C18(2.1x150mm，2.7um)肽谱分析色谱柱；流动相：A相为100％H2O-0.1％FA，B相为100％ACN-0.1％FA；色谱洗脱梯度为0-65min3％-35％B；65-68min 35％-95％B；68-70min 95％B；70-72min 95％-3％B；72-75min 3％B；流速为0.4mL/min；柱温60℃；进样量20ul。
质谱参数：质谱离子源为Dual AJS ESI电喷雾离子源；离子喷射电压:3.5KV；Gastemperature:250℃；Sheath Gas temperature:350℃；Sheath Gas Flow:12l/min；DryingGas:10l/min；Nebulizer:35psi；正离子方式检测；质量数范围为m/z 200-3000；采集速率为每秒钟5张质谱图；分离峰宽：中等(约4m/z)。
样品处理：每份样品中加入一定量的盐酸胍，加入还原剂DTT使得终浓度为20mmol/L，60℃孵育1h；加入烷化剂IAM使得终浓度为40mmol/L，避光反应1h；然后分别稀释样品至盐酸胍浓度在2mol/L以下，按照蛋白：胰蛋白酶质量比25:1加入胰蛋白酶，37℃过夜。
数据处理：使用数据分析软件Agilent MassHunter BioConfirm SoftwareB.08.00处理LC/MS/MS中采集的原始数据。在mAb序列中搜索结果，序列中包括烷基化(C)、氧化(M)、脱酰氨基化(NQ)、焦谷氨酸化(E)和糖基化(N)各种常见的修饰；质谱匹配的允许误差为±20ppm，MS/MS匹配的允许误差为±50ppm。允许两处胰蛋白酶漏切位点。结果如表4所示。
结果显示，106#_hu_1_hIgG4有三个糖基化修饰，而且VHH段的糖基化比例分别是11％和30％，导致了抗体蛋白的不均一性。改造后的0076#抗体只有一个糖基化修饰位点，蛋白均一性好。
表4.PD-1抗体的糖基化修饰比例
Figure BDA0003538252640000421
实施例7.PD-1抗体与PD-1蛋白结合的亲和力测定
为检测筛选到的PD-1单域抗体对于人PD-1蛋白和猴PD-1的体外结合能力，人PD-1(Sino Biological Cat.10377-H08H)和猴PD-1(Sino Biological Cat.90311-C08H)被用于通过ELISA结合实验进行体外结合检测。
本实施例的阴性对照为PBS，阳性对照使用Opdivo(购自上海睿智化学(chempartner)lot：180612001)，以及，部分实验使用了WO2017054646中的IgG4型PD-1Ab646(以下简称PD-1Ab646)作为阳性对照，序列如下：
PD-1抗体重链：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：121
PD-1抗体轻链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：122
用pH7.4的PBS缓冲液将带PD-1抗体蛋白稀释至2μg/mL，以100μL/孔的体积加入96孔酶标板(corning，9018 25/box 96well clear flat bottom plate)中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，用PBST(PH7.4，0.05％Tween-20)缓冲液洗板三次后，加入用PBS缓冲液稀释的2％BSA封闭液(300μL/孔)，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入初始浓度为30μg/mL的PD-1抗原(SinoBiological Cat.10377-H08H)蛋白，用PBS缓冲液三倍比稀释8个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次，每孔加入100μL/HRP标记的抗his的二抗(Abcam ab1187)(1:5000稀释)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入100μLTMB显色底物，室温孵育3-5min，加入100μL1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合EC50值。部分抗体的EC50结果如表3所示。结果显示，其均能与人、猴PD-1抗原有较好的结合力。
表5.PD-1抗体与人、猴PD-1抗原的结合力EC50(nM)
抗体编号 结合人PD-1的EC<sub>50</sub> 结合猴PD-1的EC<sub>50</sub>
7# 1.86 2.2
32# 1.99 4.8
32#_hu_1 4.08 6.2
32#_hu_2 3.43 2.3
32#_hu_3 2.98 1.2
61# 1.85 /
106# 2.56 0.67
107# 3.14 2.9
112# 2.51 1.5
阳性对照(Opdivo) 1.69 2.88
阴性对照(PBS) 0 0
(注：“/”表示未检测)
此外，还通过Biacore 8K(GE Healthcare)仪器测定PD-1抗体与PD-1蛋白的解离常数。首先将抗人IgG Fc抗体(GE Healthcare，Cat.#BR-1008-39)共价偶联到CM5 S系列芯片上，待检测PD-1抗体通过亲和捕获至芯片表面，然后于芯片表面流过不同浓度的PD-1蛋白(SEQ ID NO：3)，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合解离曲线，通过拟合获得结合力常数。实验使用溶液为HBS-P溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％P20，pH7.4)。每个实验循环结束时，用3M MgCl2溶液将芯片洗净再生。部分抗体的亲和力结果如表6所示。结果显示，本公开筛选获得的抗体与PD-1的亲和力与阳性对照相当。
表6.PD-1抗体与PD-1的亲和力
抗体编号 抗原 k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
7# PD-1 1.36E+05 2.81E-04 2.06E-09
32# PD-1 3.25E+05 2.07E-03 6.35E-09
32#_hu_1 PD-1 1.79E+05 2.91E-03 1.63E-08
32#_hu_2 PD-1 1.67E+05 1.56E-03 9.36E-09
32#_hu_3 PD-1 2.20E+05 2.01E-03 9.11E-09
32#_hu_4 PD-1 1.75E+05 3.53E-03 2.02E-08
32#_hu_5 PD-1 1.62E+05 3.19E-03 1.96E-08
61# PD-1 1.54E+05 8.19E-04 5.33E-09
61#_hu_1 PD-1 2.26E+05 4.61E-03 2.04E-08
106# PD-1 7.94E+04 4.77E-04 6.01E-09
107# PD-1 9.65E+04 7.82E-04 8.10E-09
Opdivo PD-1 5.91E+05 1.45E-03 2.45E-09
此外，还使用Biacore T200(GE Healthcare)仪器测定PD-1抗体与PD-1蛋白的解离常数。将proteinA(雅心RSPA05)共价偶联到CM5 S series芯片上，待检测抗体通过亲和捕获至芯片表面，然后于芯片表面流过不同浓度的PD-1蛋白(Sino BiologicalCat.10377-H08H)，实时检测反应信号从而获得结合解离曲线，通过拟合获得结合力常数。实验使用溶液为HBS-EP溶液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20，pH 7.4)。每个实验循环结束时，用10mM甘氨酸，PH＝1.5(GE，BR-1003-54)溶液将芯片洗净再生。结果参见表7和表8。
表7.PD-1抗体与人PD-1的亲和力KD
抗体编号 k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
32#_hu_3_hIgG4 1.05E+05 2.01E-03 1.92E-08
7#_hu_4_hIgG4 4.72E+04 5.84E-03 1.24E-07
106#_hu_1_hIgG4 8.17E+03 7.05E-04 8.63E-08
107#_hu_4_hIgG4 9.40E+03 1.20E-03 1.28E-07
PD-1Ab646 6.18E+04 4.79E-04 7.75E-09
表8.PD-1抗体与PD-1的亲和力KD
Figure BDA0003538252640000441
Figure BDA0003538252640000451
(注：“/”为检测具体数值未示出；亲和力等级“++”是指<3.00E-07，“+”是指≥3.00E-07)
实施例8.PD-1抗体阻断PD-1和PD-L1、PD-L2的结合
PD-1抗体的功能实验是通过阻断PD-1与PD-L1以及PD-L2之间结合的ELISA竞争实验来检测。
用PH7.4的PBS缓冲液稀释带Fc标签的PD-1融合蛋白至浓度为2μg/mL，以100μL/孔的体积加入96孔酶标板中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，用PBST(PH7.4，0.05％Tween-20)缓冲液洗板三次后，加入用PBS缓冲液稀释的2％BSA封闭液300μL/孔，37℃孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入带有生物素化的PD-L1和PD-L2蛋白，蛋白浓度为6μg/mL，每孔加入50μL，随后加入初始浓度为30μg/mL的PD-1抗体蛋白，用PBS缓冲液三倍比稀释6个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次，加入100μL/孔用PBS(0.5％BSA)稀释(1:500)的HRP标记的抗SA的二抗(Peroxidase-conjμgated Streptavidin，Jackson 136861)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入100μL/孔TMB显色底物，于室温孵育3-5min，加入1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合IC50值。部分抗体的IC50结果如表4所示。结果显示，所述抗体均能与PD-L1和PD-L2竞争结合PD-1，阴性对照为PBS，阳性对照使用Opdivo(本公开使用的Opdivo均购自上海睿智化学(chempartner)lot：180612001)。部分抗体阻断PD-1与PD-L1结合的结果如表9、表10所示。
表9.不同PD-1抗体竞争PD-1抗原与PD-L1和PD-L2的IC50(nM)
Figure BDA0003538252640000452
Figure BDA0003538252640000461
表10.不同PD-1抗体竞争PD-1抗原与PD-L1的IC50(nM)
抗体编号 阻断PD-1与PD-L1结合的IC<sub>50</sub>
32#_hu_3_hIgG4 2.42
7#_hu_4_hIgG4 1.22
106#_hu_1_hIgG4 3.14
PD-1Ab646 2.79
阴性对照(PBS) 9999
实施例9.PD-1抗体的体外细胞结合实验
将人PD-1全长基因PCR克隆到哺乳动物细胞表达载体pTargeT上，取线性化质粒电转染CHO-S细胞(电转仪自带的预设CHO细胞参数)，经1mg/ml G418筛选2周，再进行2次有限稀释，通过流式细胞分析仪检测细胞表面的PD-1基因，选出单克隆细胞株高表达human PD-1。命名为CHO-PD-1。
收集稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1，每孔5×105细胞。梯度稀释PD-1抗体为16.67μg/mL、5.55μg/mL、1.85μg/mL、0.617μg/mL、0.205μg/mL、0.069μg/mL，与CHO-PD-1冰上避光孵育1个小时。用PBS漂洗一次后，每孔加入FITC抗人IgG(1:100)冰上避光孵育1个小时。再用PBS漂洗一次后，以每管100μL PBS重悬，在BD C6 Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析PD-1抗体与CHO-PD-1细胞的结合。结果显示，PD-1抗体与CHO-PD-1细胞的结合强度呈抗体剂量依赖性。
部分抗体的结合力EC50结果如表11、表12和图1所示。结果显示，本公开筛选获得的抗体(如2#、32#、32#_hu_1、32#_hu_2、32#_hu_3、61#、32#_hu_3_hIgG4、7#_hu_4_hIgG4、106#_hu_1_hIgG4、107#_hu_4_hIgG4)与PD-1的结合力均显著优于阳性对照Opdivo。突变后的0076#和0078#等分子与PD-1的结合力相比106#_hu_1_hIgG4也没有降低。
本公开的阴性对照为NC时，其是与本公开PD-1抗体具有相同的恒定区IgG4，但可变区不识别抗原PD-1的抗体。阳性对照使用Opdivo。
表11.PD-1抗体与细胞表面抗原PD-1的结合EC50
Figure BDA0003538252640000462
Figure BDA0003538252640000471
表12.PD-1抗体与细胞表面抗原PD-1的结合EC50
Figure BDA0003538252640000472
实施例10.PD-1抗体阻断细胞上的PD-1与PD-L1结合
收集稳定高表达PD-1的细胞系CHO-PD-1，调整至每孔5×105细胞。梯度稀释PD-1抗体为50μg/mL、16.67μg/mL、5.55μg/mL、1.85μg/mL、0.617μg/mL、0.205μg/mL、0.069μg/mL，与CHO-PD-1细胞冰上共孵育1个小时。用PBS漂洗一次后，每管加入PD-L1-mIgG2a蛋白1μg/mL冰上孵育1小时，PBS再次清洗。清洗后每管加入PE抗小鼠IgG2a(1:300)冰上孵育1小时，用PBS漂洗一次后，以每管100uL PBS重悬，在BD C6 Plus流式细胞分析仪上进行荧光检测。使用Graphpad Prism9软件进行对抗体各剂量处理所得的平均荧光强度进行曲线拟合并作图，以定量分析PD-1抗体阻断细胞上的PD-1与PD-L1结合。
结果显示，PD-1抗体能阻断PD-L1蛋白与CHO-PD-1细胞结合，呈现抗体剂量依赖性，部分抗体的阻断IC50结果如表13、表14和图2所示。以及，本公开的抗体(如7、32、32_hu_1、32_hu_2、32_hu_3、106、107、112)，较之对照Opdivo有更强的阻断PD-L1与PD-1结合的能力。以及，突变后的0076#和0078#等分子阻断PD-L1与PD-1结合的能力相比106#_hu_1_hIgG4也没有降低。
表13.PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC50(nM)
Figure BDA0003538252640000473
Figure BDA0003538252640000481
表14.PD-1抗体阻断PD-L1蛋白与细胞表面抗原PD-1的IC50(nM)
Figure BDA0003538252640000482
实施例11.PD-1抗体在体外解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活实验
收集内源稳定高表达PD-L1和TCR激活分子的CHO-PD-L1 aAPC细胞系(购买自Promega，PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay，J1252)，用PD-L1阴性的CHO细胞作为对照，用完全培养基调整细胞密度为4×105/mL，每孔加入100uL，置于37℃5％CO2的培养箱培养20-24小时。
测试当天使用分析培养基将PD-1抗体梯度稀释为1000、250、62.5、15.6、3.91、0.98、0.24、0.06nM，每个浓度设置2个复孔。
收集内源稳定高表达PD-1的效应细胞Jurkat-PD-1(购买自Promega，PD-1/PD-L1Blockade Bioassay，J1252)，该细胞同时内源稳定表达NFAT启动的荧光素酶报告基因，用分析培养基调整细胞密度为1.25×106/mL。
取出前一天接种CHO-PD-L1 aAPC细胞的培养板，弃上清，将稀释好的抗体和调整好密度的效应细胞Jurkat-PD-1一次加入细胞培养板中，每孔各加入40uL，轻轻混匀，置于37℃5％CO2的培养箱培养6小时。
在抗体孵育期间，将Bio-GloTMReagent(Promega)取出使其温度恢复至室温。混合培养完成后取出细胞培养板，室温静置5-10分钟，然后每孔加入80uL Bio-GloTMReagent，轻轻混匀，使用Molecular Device SpectraMax多功能酶标仪读取化学发光数值，得到的数据用Graphpad Prism9软件进行曲线拟合分析并作图。部分抗体结果如表15和图3所示。
结果显示，0076#与106#_hu_1_hIgG4均能很好的解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活，0076#的效果优于106#_hu_1_hIgG4。
表15.PD-1抗体解除PD-1/PD-L1阻断的免疫激活的IC50
抗体编号 IC<sub>50</sub>(nM)
106#_hu_1_hIgG4 29.18
0076# 14.25
实施例12.PD-1抗体在体外促进混合淋巴细胞分泌细胞因子
将人新鲜或复苏的PBMCs通过EasySep人CD14阳性筛选试剂盒(STEMCELLtechnologies，17858)分离CD14+单核细胞。所分离的CD14+细胞按照单核细胞衍生的树突细胞分化试剂盒(R&D system，CDK004)的方法，通过加入IL-4和GM-CSF因子诱导6天后，再加入TNF-α进一步诱导3天，成为成熟DC。
人PBMC通过EasySep人CD3阳性筛选试剂盒(STEMCELL technologies，18051)分离CD3+T细胞(与DC不同供体来源)。将分离所得的T与DC细胞以10：1的比例混合培养，同时加入低内毒素控制的PD-1抗体，培养5天后，用人IFNγquantikine ELISA试剂盒(R&Dsystem，DIF50)检测激活T细胞的IFNγ分泌。
混合淋巴培养后，IFNγ分泌量如表16、表17和图4、图5所示。结果显示，筛选获得的多个PD-1抗体均能够有效增强T细胞激活并分泌IFNγ。
表16.PD-1抗体促IFNγ分泌量
抗体编号 IFNγ分泌量(pg/mL)
7# 963.5
32# 555.3
32#_hu_3 1031.5
106# 1164.2
107# 1776.6
阴性对照(NC) 49
阳性对照(Opdivo) 1181.5
表17.PD-1抗体促IFNγ分泌量
Figure BDA0003538252640000491
Figure BDA0003538252640000501
实施例13.PD-1抗体抑制小鼠结肠癌模型中肿瘤生长
动物实验由上海艾费医药科技有限公司完成，使用HuPD-1人源化转基因小鼠，雌性，6-8周龄，购买于南京银河生物医药有限公司。
将PBS重悬的小鼠结肠癌细胞系MC38细胞以5×105个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于HuPD-1人源化小鼠的右侧胁肋部皮下。当平均肿瘤体积达到100mm3(70-120mm3)时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠入组，以右侧肿瘤体积为分组依据。分组当天开始给药，给药剂量均为0.3mg/kg；给药频率是每三天注射一次，一共注射三周；给药方式是静脉注射。
PD-1抗体抑制小鼠结肠癌肿瘤生长结果如表18和图6A、图6B所示。结果显示，第24天，阳性对照的抑瘤比率为47.3％；32#_hu_3_hIgG4的抑瘤比率为50.8％；7#_hu_4_hIgG4的抑瘤比率为68.4％；106#_hu_3_hIgG4的抑瘤比率为64.4％，均能够有效抑制小鼠体内肿瘤的生长。
表18.PD-1抗体抑制小鼠结肠癌肿瘤生长结果
Figure BDA0003538252640000502
实施例14.PD-1/CTLA-4双特异性抗体的构建、表达与纯化
1、结合PD-1/CTLA4的双特异性抗体的结构
将本公开的PD-1抗体与伊匹单抗(ipilimumab)构建靶向PD-1和CTLA4的双特异性抗体PR2001、PR2009和PR2011，PR2004、PR2012和PR2014。上述抗体的Fc部分均在IgG1的基础上引入了L234F/L235E两点突变以消除Fc介导的细胞杀伤作用。伊匹单抗的CDR如表19所示。
表19.伊匹单抗CDR
Figure BDA0003538252640000511
伊匹单抗VH：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：164
伊匹单抗VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：165
伊匹单抗重链全长：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：166
伊匹单抗轻链全长：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：167
PR2001、PR2009、PR2011这3个分子的结构如图7A所示，PR2004、PR2012、PR2014这3个分子的结构如图7B所示。PR2001、PR2009和PR2011，PR2004、PR2012和PR2014的不同之处在于所用PD-1的抗体序列不同。PR2001和PR2004，PR2009和PR2012，PR2011和PR2014的不同之处在于所用的抗体形式不同。PR2001、PR2009、PR2011的双抗结构中使用的连接子1(linker-1)的序列结构为(G4S)4(即GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。PR2004、PR2012、PR2014的Fc与PD-1单域抗体之间连接子2为(G4S)6(即GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)。这4个双特异性抗体所用的轻链相同。各抗体序列如下：
PR2001第一多肽链(下划线处为linker)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：168
PR2004第一多肽链(下划线处为linker)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFRYSPILMGWFRQAPGKDREGVSSIDSVGATDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALMRTYLPLQPRQYDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：169
PR2009的第一条多肽链(下划线处为linker)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：170
PR2012的第一条多肽链(下划线处为linker)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKNKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSANSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：171
PR2011的第一条多肽链(下划线处为linker)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGGTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：172
PR2014的第一条多肽链(下划线处为linker)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTFKDKCMGWFRQAPGKEREGVSVVDRFGG
TIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSYTSAGSCQPDALWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：173
PR2001、PR2009和PR2011，PR2004、PR2012和PR2014的第二多肽链均为SEQ ID NO：167。
2、结合PD-1/CTLA4双特异性抗体的制备
用生长状态良好，处于对数生长期的CHO-S细胞(购自Thermo公司，货号A29133)，离心并按照6×106细胞/mL接种250mL。将溶液2(用培养液9.2mL稀释800ul转染试剂，混匀)加入溶液1(用培养液10mL稀释250μg质粒，混匀)中，总体积为20mL，轻柔混匀后室温孵育1-5分钟，不超过5分钟，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加。然后将培养瓶置于5％CO2，32℃的摇床培养，18-22个小时加辅料Feed(购自Thermo公司，货号A29133)16mL，增强剂Enhancer(购自Thermo公司，货号A29133)0.6mL。第五天加辅料Feed(购自Thermo公司，货号A29133)16mL，123rpm，5％CO2，32℃培养，待第12-14天离心收集上清。通过亲和层析法(Protein A)和离子交换两步法进行重组抗体的纯化。制备获得了PD-1/CTLA4双特异性抗体PR2001、PR2009和PR2011，PR2004、PR2012和PR2014。经10％的SDS-PAGE凝胶电泳检测，如图8所示。
结果显示，该双抗理论分子量为174kDa，第一多肽链为64kDa，第二多肽链为23kDa，由SDS-PAGE凝胶电泳的非还原条带大小和还原条带大小来判断，条带大小符合预期，说明该重组双特异性抗体能够正确装配和表达，而且无明显聚集降解。
实施例15.PD-1/CTLA-4双抗对人PD-1、对人CTLA-4的亲和力检测
用流式细胞术来检测抗体与JURKAT-PD-1细胞(购自Promega，CS187102)的结合。选取对数生长期的JURKAT细胞，收集细胞，PBS清洗后离心，2％FBS PBS重悬细胞。每孔用100μl的2×105细胞铺板，400g离心5分钟。加入不同浓度的待检抗体，冰上孵育1h后，PBS洗涤，400g离心5min。加入带有荧光基团的二抗Alexa Fluor 647mouse anti-human lgG，FcγFragment Specific(购自Jackson)冰浴染色1h，PBS清洗后上机检测。如图9所示，所检测的抗PD-1纳米抗体均可和JURKAT-PD-1细胞结合。表20为结合的EC50值。
表20.双抗与PD-1结合的EC50(FACS)
抗体编号 EC<sub>50</sub>(nM)
PR2001 0.198
PR2004 0.755
PR2009 0.632
PR2012 2.010
用流式细胞术来检测抗体与CHOK1-CTLA4细胞的结合。选取对数生长期的CHOK1细胞，Lipo2000(购自Invitrogen)转染CTLA4质粒(购自义翘神州)，48h后去培养基，PBS清洗后离心，加入适量0.25％胰酶(购自Invitrogen)消化，补加完全培养基终止消化后，离心收集细胞，2％FBS PBS重悬细胞。每孔用100μl 2×105细胞铺板，400g离心5分钟。加入不同浓度的待检抗体，冰上孵育1h后，PBS洗涤，400g离心5min。加入带有荧光基团的二抗AlexaFluor 647mouse anti-human lgG，FcγFragment Specific冰浴染色1h，PBS清洗后上机检测。如图10所示，所检测的本公开的抗体均可和CHOK1-CTLA4细胞结合。表21为结合的EC50值。
表21.双抗与CTLA4结合的EC50(FACS)
抗体编号 EC<sub>50</sub>(nM)
伊匹单抗 2.334
PR2001 2.967
PR2004 3.047
PR2009 3.856
PR2012 2.669
实施例16.PD-1/CTLA-4双抗对PD-1/PD-L1信号的抑制活性的检测
本实验采用了两株细胞工程株，GloResponse NFAT-luc2/PD1 Jurkat(购自Promega，CS187102)和PD-L1-CHOK1(购自Promega，CS187108)。GloResponse NFAT-luc2/PD1 Jurkat细胞是稳定表达PD1的Jurkat细胞，并同时稳转了TCR信号通路下游的NFAT启动子/Luciferase报告基因***载体。PD-L1-CHOK1细胞是稳定表达PD-L1的CHO-K1细胞株，同时也能够激活Jurkat细胞的TCR(T cell receptor)信号。当GloResponse NFAT-luc2/PD1Jurkat细胞和PD-L1-CHOK1共孵育时，由于PD-1和PD-L1结合而抑制了TCR信号，加入PD-1抗体时，能够阻断PD-1和PD-L1的结合，解除对TCR信号的抑制，从而诱导Luciferase报告基因表达。
PD-L1-CHOK1在PBS清洗后，加入适量0.25％胰酶(购自Gibico)消化，补加F-12完全培养基(购自Gibico)终止消化后，离心收集细胞，F-12完全培养基重悬细胞至2×105/mL，向96孔板(Perkinelmer 6005680)中加入调整好细胞密度的PD-L1-CHOK1细胞悬液，100μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。收集GloResponse NFAT-luc2/PD1 Jurkat细胞，PBS清洗后离心，RPMI1640分析培养基(购自Gibico)重悬细胞。取出PD-L1-CHOK1的细胞培养板，去上清，然后将稀释好的抗体和调整好密度的GloResponse NFAT-luc2/PD1Jurkat细胞依次加入细胞培养板中，各40μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。将Bright-GloTMReagent(购自Promega，E-2620)取出使其温度恢复至室温。取出细胞培养板，置于室温放置10min，然后每孔加入40μL Bright-GloTMReagent，置于室温避光孵育5min，使用多功能酶标仪读取光度值。如图11所示，所检测抗体PR2009有对PD-1/PD-L1信号的抑制活性。
实施例17.葡萄球菌毒素(SEB)实验检测PD-1/CTLA-4双抗的T细胞激活活性
通过检测外周血单核细胞的IL-2分泌，检测在SEB刺激下，抗体分子对T细胞激活的活性。复苏冻存PBMC(购自ALLCELLS)，加入适量RPMI1640完全培养基，400g离心5分钟。加入含有100ng/ml SEB(购自康博贝宁2090681)的RPMI1640完全培养基重悬细胞至2×106/mL。将细胞加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，再加入RPMI1640完全培养基稀释好的抗体，100μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h。收取上清，用Human IL2 kits(购自Cisbio，62HIL02PEG)检测IL-2的浓度。如图12所示，检测抗体PR2009有对SEB刺激下T细胞的激活活性。
实施例18.混合淋巴细胞反应(MLR)实验检测PD-1/CTLA-4双抗的T细胞激活活性
新鲜PBMC(购自ALLCELLS)加入autoMACS Running buffer(购自Miltenyi130-091-221)洗一次，400g离心5分钟。加入1.6ml buffer重悬，再加入400ul human CD14MicroBeads(购自Miltenyi#130-050-201)，4℃孵育15mins。补加适量buffer后，离心去上清，2ml buffer重悬。准备柱子(购自Miltenyi)上架，2ml buffer洗柱子，上样，2ml buffer洗柱子。取下柱子，2ml buffer洗脱柱子，收下CD14+cells，400g离心5分钟。加入含有250U/ml IL-4(购自Peprotech 200-04)和500U/ml GMCSF(购自Peprotech 300-03)RPMI1640完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养5天。加入终浓度为1μg/ml LPS(购自Sigma#L2880)，培养48h，收集细胞，RPMI1640完全培养基洗一次后，RPMI1640完全培养基重悬至4×105/mL。复苏冻存PBMC(购自ALLCELLS)，加入autoMACS Running buffer洗一次，400g离心5分钟，去上清。用EasySepTMHuman CD4+T Cell Isolation Kit(购自Stemcell#17952)分离CD4+T细胞，RPMI1640完全培养基重悬至2×106/mL。等体积混合稀释好的成熟DC和CD4+T细胞，将细胞加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，再加入RPMI1640完全培养基稀释好的抗体，50μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h。收取上清，用Human IL2 kits(购自Cisbio，62HIL02PEG)检测IL-2的浓度。如图13所示，检测抗体PR2009有对MLR中CD4+T细胞的激活活性。
实施例19.小鼠皮下瘤模型检测PD-1/CTLA-4双抗的抗肿瘤活性
利用B-hPD-1/hCTLA4人源化小鼠的MC38-hPD-L1结肠癌动物模型进行药物药效实验(北京百奥赛图)，检测抗体PR2009的体内抗肿瘤活性。将PBS重悬的MC38-hPD-L1结肠癌细胞以5×105个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于B-hPD-1/hCTLA4人源化小鼠的右侧皮下。当平均肿瘤体积达到大约100mm3时，挑选个体肿瘤体积合适的24只小鼠入组主实验组，将动物按肿瘤体积随机分配到4个实验组中，每组6只，分别为G1 hIgG1(1mg/kg)组，G2SHR1901(1mg/kg)组，G3 SHR1901+伊匹单抗(1+0.3mg/kg)组和G4 PR2009(1.3mg/kg)组。所有组给药途径均为腹腔注射，每3天给药1次，连续给药3次后一周给药1次。给药和观察期间每周测量2次小鼠肿瘤体积，并记录测量值。如图14A和14B所示，检测抗体PR2009具有体内抗肿瘤活性。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京拓界生物医药科技有限公司
<120> PD-1/CTLA-4结合蛋白及其医药用途
<150> CN202110261228.6
<151> 2021-03-10
<150> CN202110259670.5
<151> 2021-03-10
<160> 187
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
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Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 2
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro
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Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Pro Arg Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
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<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 商业化人PD-1抗原
<400> 3
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
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Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
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Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
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Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala
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His His His His His His His His His His
145 150
<210> 4
<211> 375
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 商业化抗人PD-1-Fc抗原
<400> 4
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
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Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Glu
130 135 140
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
180 185 190
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
195 200 205
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
210 215 220
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
225 230 235 240
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
245 250 255
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
260 265 270
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
275 280 285
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
340 345 350
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 商业化人PD-L1抗原
<400> 5
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Ala His His
210 215 220
His His His His His His His His
225 230
<210> 6
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 商业化人PD-L2抗原
<400> 6
Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly
1 5 10 15
Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn
20 25 30
Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser
35 40 45
Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly
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Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln
65 70 75 80
Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu
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Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu
100 105 110
Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn
130 135 140
Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val
145 150 155 160
Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp
165 170 175
Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser
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Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Ala His His His His His His His
195 200 205
His His His
210
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Phe Cys Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Asp
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Cys Ser Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Arg Ser Ser Gly Gly Asp Leu Thr Tyr
100 105 110
Gly Leu Ala Pro Gly Pro Tyr Glu Tyr Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Gln Val Thr Val Ser Ser
130
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 9
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Gly Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 10
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ser Ser Arg Asn Thr Asn Arg Tyr Asn
20 25 30
Phe Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Arg Asp Gly Ser Trp Ser Ser Gln Asn Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
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Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
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35 40 45
Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
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<213> Camelus dromedarius
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His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
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Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asn Tyr Thr Asn Ser Val Lys
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Gln Met Asn Ile Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Phe Leu
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<213> Camelus dromedarius
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
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Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
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Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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<213> Camelus dromedarius
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His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
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Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
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Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
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<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 16
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
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Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Arg Lys Asp Arg Glu Gly Val
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Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys
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<220>
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<400> 42
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_2
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_3
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_4
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_5
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Leu
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Leu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 49
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_Hu_5
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Val Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly
35 40 45
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Val Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 107#_Hu_4
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Gly Val Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 112#_Hu_1
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Ile Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 59
Arg Asp Cys Met Gly
1 5
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 60
Ala Ile Cys Ser Ser Gly Arg Asn Thr Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly
20
<210> 61
<211> 22
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 61
Asp Leu Arg Ser Ser Gly Gly Asp Leu Thr Tyr Gly Leu Ala Pro Gly
1 5 10 15
Pro Tyr Glu Tyr Lys Tyr
20
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 62
Pro Ile Leu Met Gly
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 63
Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 64
Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp Phe
1 5 10 15
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 65
Asn Phe Met Thr
1
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 66
Ala Ile Tyr Thr Gly Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 67
Ala Leu Arg Asp Gly Ser Trp Ser Ser Gln Asn Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 68
Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 69
Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asn Tyr Thr Asn Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 70
Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 72
Thr Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 73
Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp Phe
1 5 10 15
Trp Gly
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 74
Ser Leu Cys Met Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 75
Thr Ile Tyr Thr Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 76
Ala Tyr Gly Arg Arg Trp Cys Glu Arg Leu Tyr Met Tyr Asp Ser
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<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 77
Ser Ile Asp Ser Val Gly Thr Thr Gly Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 78
Val Tyr Ser Met Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 79
Ala Leu Tyr Pro Thr Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 13
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 80
Gly Leu Thr Gly Arg Trp Trp Leu Pro Glu Ala Asp Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 81
Asn Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 82
Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 83
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 84
Arg Tyr Cys Met Gly
1 5
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 85
Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 86
Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr Asp Ser
1 5 10 15
<210> 87
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 87
Leu Tyr Pro Thr Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 88
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 88
Phe Arg Tyr Met Gly
1 5
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 89
Asp Ile Tyr Thr Pro Ser Gly Gln Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 90
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 90
Ala Glu Gly Val Leu Gly Arg Pro Leu Thr Pro Ala Gln Tyr Ser Tyr
1 5 10 15
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 91
Val Val Asp Arg Tyr Gly Gly Ile Ile Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 92
Gly Ser Tyr Thr Ser Asp Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 112_hu_1 CDR2
<400> 93
Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Ile Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 94
Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Ala Ser Val Lys Asp
1 5 10 15
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 95
Gly Ser Tyr Thr Asp Ala Gly Ser Cys His Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 96
Arg Asn Leu Met Ala
1 5
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 97
Val Ile Tyr Val Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 98
Lys Thr Gly Ile Ile Gln Val Asp Asp Ala Leu Gln Pro Asn Glu Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 99
Ala Ile Tyr Pro Thr Ala Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 100
Ala Ile Tyr Pro Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Met Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 101
Ala Ile Tyr Pro Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Met Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<400> 102
Val Ile Asn Thr Gly Thr Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 103
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 104
<211> 359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7#-IgG1
<400> 104
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ser Ser Arg Asn Thr Asn Arg Tyr Asn
20 25 30
Phe Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Arg Asp Gly Ser Trp Ser Ser Gln Asn Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ser Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#-IgG1
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Lys Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Asp Leu
65 70 75 80
Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ser Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
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<211> 361
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 107#-IgG1
<400> 106
Asp Val Gln Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ala Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Val Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly
115 120 125
Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
130 135 140
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145 150 155 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
165 170 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
180 185 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
210 215 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
245 250 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
260 265 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
275 280 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
290 295 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
325 330 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
340 345 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 107
<211> 360
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_hu_3-hIgG1
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ser
115 120 125
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 108
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 108
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 109
<211> 353
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_hu_3_hIgG4
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr
115 120 125
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145 150 155 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
165 170 175
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
180 185 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
195 200 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
210 215 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
245 250 255
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
260 265 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
275 280 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
290 295 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
305 310 315 320
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
325 330 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
340 345 350
Lys
<210> 110
<211> 352
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7#_hu_4_hIgG4
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asn Thr Asn Arg Tyr Asn
20 25 30
Phe Met Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ala Ile Tyr Thr Gly Phe Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Arg Asp Gly Ser Trp Ser Ser Gln Asn Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
145 150 155 160
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
165 170 175
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
180 185 190
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
195 200 205
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
210 215 220
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
225 230 235 240
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
245 250 255
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
260 265 270
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
275 280 285
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
290 295 300
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
305 310 315 320
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
325 330 335
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345 350
<210> 111
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345 350
<210> 112
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 107#_hu_4_hIgG4
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Asn Arg Arg
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ser Val Ile Asn Thr Gly Ala Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Val Gly Trp Arg Ala Leu Cys Glu Val Asn Gly Tyr Val Tyr
100 105 110
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
115 120 125
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
225 230 235 240
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
340 345 350
Gly Lys
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7#_Hu_5 CDR1
<400> 113
Tyr Asn Phe Met Ser
1 5
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7#_Hu_6 CDR2
<400> 114
Tyr Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 115
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自S或T
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自T或A
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa选自D、N或G
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa选自T或A
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa选自N或D
<400> 115
Xaa Ile Asp Ser Val Gly Xaa Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Y或F
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自I或T
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa选自A或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(16)
<223> Xaa选自K或D
<400> 116
Val Val Asp Arg Xaa Gly Gly Xaa Ile Tyr Ala Xaa Ser Val Lys Xaa
1 5 10 15
<210> 117
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自A或D
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自N或G
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自Q或H
<400> 117
Gly Ser Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Ser Cys Xaa Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自F或Y
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自S或T
<400> 118
Tyr Asn Xaa Met Xaa
1 5
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自A或T
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自S或T
<400> 119
Val Ile Asn Thr Gly Xaa Asn Xaa Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自L或I
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自R或K
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自Y或F
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa选自G或A
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa选自M或V
<400> 120
Xaa Tyr Pro Thr Ala Gly Xaa Thr Tyr Xaa Xaa Asp Ser Xaa Lys Gly
1 5 10 15
<210> 121
<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体重链
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 122
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1抗体轻链
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 123
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_6
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 124
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 32#_Hu_7
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 125
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_Hu_6
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_Hu_7
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 127
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_Hu_8
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 128
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_Hu_9
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-D） CDR1
<400> 129
Asp Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-E） CDR1
<400> 130
Glu Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-F） CDR1
<400> 131
Phe Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-G） CDR1
<400> 132
Gly Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-H） CDR1
<400> 133
His Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-I） CDR1
<400> 134
Ile Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-K） CDR1
<400> 135
Lys Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-L） CDR1
<400> 136
Leu Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-M） CDR1
<400> 137
Met Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-P） CDR1
<400> 138
Pro Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-Q） CDR1
<400> 139
Gln Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-R） CDR1
<400> 140
Arg Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N31-S） CDR1
<400> 141
Ser Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 142
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-A） CDR3
<400> 142
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Ala Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 143
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-E） CDR3
<400> 143
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Glu Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 144
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-F） CDR3
<400> 144
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Phe Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 145
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-G） CDR3
<400> 145
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 146
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-H） CDR3
<400> 146
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala His Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 147
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-K） CDR3
<400> 147
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Lys Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-P） CDR3
<400> 148
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Pro Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 149
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-Q）
<400> 149
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gln Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 150
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-R） CDR3
<400> 150
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Arg Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 151
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 106#_hu_1_hIgG4（N104-S） CDR1
<400> 151
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Ser Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自N、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R或S
<400> 152
Xaa Lys Cys Met Gly
1 5
<210> 153
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自N、A、E、F、G、H、K、P、Q、R或S
<400> 153
Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Xaa Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu
1 5 10
<210> 154
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0076#
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 155
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0077#
<400> 155
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Gly Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 156
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0078#
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala His Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 157
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0079#
<400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Gly Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala His Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 7
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<223> 伊匹单抗HCDR1
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<213> Artificial Sequence
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<400> 159
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<220>
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<400> 162
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Gly Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala His Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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340 345 350
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<223> 伊匹单抗LCDR3
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<223> 伊匹单抗VH
<400> 164
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> Artificial Sequence
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<400> 165
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 伊匹单抗重链
<400> 166
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
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180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 167
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 伊匹单抗轻链
<400> 167
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 168
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2001第一多肽链
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile
20 25 30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Leu Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
260 265 270
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
275 280 285
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
290 295 300
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
340 345 350
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
355 360 365
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
370 375 380
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
385 390 395 400
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
405 410 415
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
420 425 430
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
435 440 445
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
450 455 460
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
465 470 475 480
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
485 490 495
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
500 505 510
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
515 520 525
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
530 535 540
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
545 550 555 560
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
565 570 575
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585 590
<210> 169
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2004第一多肽链
<400> 169
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
465 470 475 480
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
485 490 495
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Tyr Ser Pro Ile Leu Met Gly
500 505 510
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Gly Val Ser Ser Ile
515 520 525
Asp Ser Val Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
530 535 540
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
545 550 555 560
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Leu
565 570 575
Met Arg Thr Tyr Leu Pro Leu Gln Pro Arg Gln Tyr Asp Phe Trp Gly
580 585 590
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595 600
<210> 170
<211> 590
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2009的第一条多肽链
<400> 170
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
130 135 140
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
165 170 175
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe
180 185 190
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
225 230 235 240
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
260 265 270
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
275 280 285
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
290 295 300
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
325 330 335
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
340 345 350
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
355 360 365
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
370 375 380
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
385 390 395 400
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
405 410 415
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
420 425 430
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
435 440 445
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
450 455 460
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
465 470 475 480
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
485 490 495
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
500 505 510
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
530 535 540
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
545 550 555 560
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
565 570 575
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585 590
<210> 171
<211> 599
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2012的第一条多肽链
<400> 171
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
485 490 495
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Lys Cys Met Gly
500 505 510
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Val Val
515 520 525
Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
530 535 540
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
545 550 555 560
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser
565 570 575
Tyr Thr Ser Ala Asn Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp Gly Gln Gly
580 585 590
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595
<210> 172
<211> 590
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2011的第一条多肽链
<400> 172
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
130 135 140
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
145 150 155 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
165 170 175
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe
180 185 190
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
225 230 235 240
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
245 250 255
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
260 265 270
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
275 280 285
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
290 295 300
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
325 330 335
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
340 345 350
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
355 360 365
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
370 375 380
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
385 390 395 400
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
405 410 415
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
420 425 430
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
435 440 445
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
450 455 460
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
465 470 475 480
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
485 490 495
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
500 505 510
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
530 535 540
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
545 550 555 560
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
565 570 575
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585 590
<210> 173
<211> 599
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR2014的第一条多肽链
<400> 173
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
465 470 475 480
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
485 490 495
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Met Gly
500 505 510
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Val Val
515 520 525
Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
530 535 540
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
545 550 555 560
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser
565 570 575
Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp Gly Gln Gly
580 585 590
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
595
<210> 174
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 174
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 175
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 175
Leu Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 176
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 177
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 177
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 178
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 179
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 180
Leu Glu Pro Lys Ser Ser
1 5
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 181
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 182
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 183
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接子
<400> 183
Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
<210> 184
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0076#_hIgG4
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345 350
<210> 185
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0077#_hIgG4
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Gly Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala Gly Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345 350
<210> 186
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0078#_hIgG4
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Tyr Thr Phe Lys Asp Lys
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Tyr Thr Ser Ala His Ser Cys Gln Pro Asp Ala Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
115 120 125
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
340 345 350
<210> 187
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa选自A或D
<400> 187
Val Val Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Xaa Ser Val Lys Gly
1 5 10 15

Claims (11)

1.PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含：
特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域、和
特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域，
所述特异性结合PD-1的第一抗原结合结构域包含至少一个免疫球蛋白单一可变结构域，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中：所述免疫球蛋白单一可变结构域包含如下的CDR1、CDR2和CDR3：
1）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：129所示的氨基酸序列，CDR2的氨基酸序列如SEQID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：145所示；或
2）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：129-141任一所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示；或
3）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：142-151任一所示；或
4）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：132所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：145所示；或
5）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：129所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：146所示；或
6）CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：132所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：146所示；或
7）CDR1的氨基酸序列SEQ ID NO：81所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示，CDR3的氨基酸序列SEQ ID NO：83所示。
2.如权利要求1所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述免疫球蛋白单一可变结构域包含如SEQ ID NO：154-157、49-53、125-128任一所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中：
VH包含分别如SEQ ID NO：158-160所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；VL包含分别如SEQ ID NO：161、163所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR3，以及GAF氨基酸序列所示的LCDR2。
4.如权利要求3所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述VH包含如SEQ ID NO：164所示氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：165所示氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述特异性结合CTLA-4的第二抗原结合结构域包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中：
VH包含分别如SEQ ID NO：158-160所示氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；VL包含分别如SEQ ID NO：161、163所示氨基酸序列的LCDR1、LCDR3，以及GAF氨基酸序列所示的LCDR2。
6.如权利要求5所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，所述VH包含如SEQ ID NO：164所示氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：165所示氨基酸序列。
7.如前权利要求任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中：
第一多肽链包含如SEQ ID NO：170-173任一所示的氨基酸序列，
第二多肽链包含如SEQ ID NO：167所示的氨基酸序列。
8.多核苷酸，其编码权利要求1-7任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白。
9.药物组合物，其包含：一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂，以及权利要求1-7任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白。
10.权利要求1-7任一项所述的PD-1/CTLA-4结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肠癌。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述肠癌选自结肠癌、直肠癌。
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Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016355568A1 (en) * 2015-11-18 2018-06-21 Merck Sharp & Dohme Llc PD1/CTLA4 Binders
AR108377A1 (es) * 2016-05-06 2018-08-15 Medimmune Llc Proteínas de unión biespecíficas y sus usos
WO2018014260A1 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
CN111836832A (zh) * 2018-01-08 2020-10-27 南京传奇生物科技有限公司 多特异性抗原结合蛋白及其使用方法
EP3740507A4 (en) * 2018-01-15 2022-08-24 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST PD-1
WO2019179391A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
EP3733708A1 (en) * 2019-05-02 2020-11-04 Randox Laboratories Ltd Immune checkpoint molecule inhibitor
CN116987191A (zh) * 2019-06-27 2023-11-03 启愈生物技术(上海)有限公司 抗PD-L1纳米抗体及其Fc融合蛋白和应用
CN114222759B (zh) * 2019-09-06 2023-06-06 北京拓界生物医药科技有限公司 抗pd-1单域抗体、其衍生蛋白及其医药用途
CN113637075B (zh) * 2020-04-27 2024-04-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 双特异性抗原结合分子及其医药用途

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