CN114560911B - 一种抗真菌肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗真菌肽技术领域，具体涉及一种抗真菌肽及其制备方法。本发明提供的抗真菌肽具有良好的抗真菌活性，同时，其活性不受融合标签蛋白的影响，能够在表达后不切去SUMO标签蛋白的情况下有效抑制饲料霉变，具有制备方法简单的优势，显著降低了生产成本。利用本发明提供的信号肽可实现该抗真菌肽在大肠杆菌中高效分泌表达，表达的抗真菌肽直接分泌至胞外上清液中，无需进行纯化，提高了抗真菌肽的表达量，降低了内毒素的污染。

Description

一种抗真菌肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗真菌肽技术领域，具体涉及一种抗真菌肽及其制备方法。
背景技术
在饲料的加工、运输和储存过程中，由于包装破损或储存不当等诸多因素，饲料霉变情况极为严重，使得饲料营养价值大大降低。而且动物采食霉变的饲料后，会引起中毒，轻者影响生产性能，重者直接死亡，给整个畜禽产业造成极大的经济损失。抗真菌肽是一类具有杀灭真菌作用的抗菌肽，将其开发为饲料防腐剂，在防止饲料霉变的同时还能提供额外的氨基酸作为营养物质，是一种理想的选择。
目前通过基因工程手段外源表达抗真菌肽还存在着诸多问题，例如用毕赤酵母或芽孢杆菌为宿主菌，存在表达量低、培养时间长和培养基成本高等缺点；用大肠杆菌为宿主菌虽然可以克服表达量、培养时间和培养成本的问题，但却很难实现胞外分泌表达，而且胞内表达的纯化步骤繁琐复杂，成本较高，因此限制了抗真菌肽的应用。另外，抗真菌肽分子量较低，在大肠杆菌中往往会融合标签蛋白表达，标签蛋白会在很大程度上抑制抗真菌肽活性，需要使用标签蛋白酶切去标签才能使得抗真菌肽发挥完整活性，这无疑会进一步增加制备成本。因此，提供一种高表达量、低成本、制备方法简便的胞外分泌表达抗真菌肽的方法和抑制饲料霉变活性不受融合的标签蛋白影响的抗真菌肽具有重要的推广应用价值。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种信号肽及其应用。
本发明的第二目的是提供一种抗真菌肽及其应用。
本发明的第三目的是提供用于制备该抗真菌肽的大肠杆菌基因工程菌株以及该抗真菌肽的制备方法。
为解决目前抗真菌肽外源表达、制备存在的问题，本发明开发了能够使得抗真菌肽高效分泌表达的信号肽，以及活性不受融合标签蛋白影响的抗真菌肽。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种信号肽，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明通过对多种信号肽分子进行筛选，发现信号肽SX相较于其它信号肽能够更好地促进多肽在大肠杆菌中分泌表达，尤其能够促进抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C及其形成的融合多肽分泌表达。
第二方面，本发明提供编码所述信号肽的核酸分子。
根据上述提供的信号肽的氨基酸序列，本领域技术人员可以确定其编码核酸分子的核苷酸序列。优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.5所示。
第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的载体。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
优选地，所述载体含有顺次连接的编码所述信号肽的核酸分子以及编码SUMO标签蛋白的的核酸分子的pET22b载体。
进一步优选地，在所述SUMO标签蛋白的核酸分子的下游还连接有编码抗真菌肽的核酸分子。所述抗真菌肽优选为抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C或由抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C中的至少两个形成的融合多肽。
本发明还提供含有所述载体的大肠杆菌。所述大肠杆菌为大肠杆菌Origami(DE3)或BL21(DE3)菌株。
第四方面，本发明提供所述信号肽在大肠杆菌分泌表达多肽中的应用。
优选地，所述多肽为抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C或由抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C中的至少两个形成的融合多肽。
第五方面，本发明提供一种抗真菌肽，其为将抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin和LsGRP1中的任意两种或三种经柔性linker连接得到。
优选地，所述抗真菌肽为将抗真菌肽Metchnikowin和Drosomycin经柔性linker连接得到。
所述抗真菌肽的结构为Metchnikowin-linker-Drosomycin。
所述柔性linker优选为GGGGGS(SEQ ID NO.4)。
在上述抗真菌肽之间加入该柔性Linker，可以有效地将两种抗真菌肽结构域分开，改变抗真菌肽之间以及和融合标签蛋白之间的相对空间位置,从而降低融合标签对抗真菌肽活性的影响，有利于改善串联抗真菌肽的活性。
柔性linker的编码核酸分子序列优选如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述抗真菌肽具有如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
其中，如SEQ ID NO.2所示的序列为抗真菌肽Metchnikowin和Drosomycin经柔性linker序列GGGGGS顺次连接得到，该融合多肽命名为抗真菌肽MD。
SEQ ID NO.2所示的抗真菌肽可以融合SUMO标签和所述信号肽后分泌表达至大肠杆菌胞外。
如SEQ ID NO.3所示的序列为在SEQ ID NO.2所示的序列的N端连接SUMO标签蛋白序列得到。
本发明发现，将抗真菌肽Metchnikowin和Drosomycin经柔性linker序列GGGGGS连接得到的新型串联抗真菌肽具有较好的抗真菌活性，可显著抑制饲料霉变，而将该融合多肽进一步融合SUMO标签后，不会对其抗真菌活性造成不利影响，融合SUMO标签的多肽仍具有较好的抗真菌、抑制饲料霉变的活性。因此，该融合多肽在融合SUMO标签表达后，无需切除SUMO标签，极大地简化了制备过程。
第六方面，本发明提供编码所述抗真菌肽的核酸分子。
优选地，编码所述抗真菌肽的核酸分子的序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
第七方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译元件(包括但不限于启动子、终止子等)可操作性地连接得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。
优选地，所述载体为含有顺次连接的编码所述信号肽的核酸分子和编码所述抗真菌肽的核酸分子的pET22b质粒。
进一步优选地，所述载体为含有顺次连接的编码所述信号肽的核酸分子、编码SUMO标签蛋白的核酸分子以及编码SEQ ID NO.2所示的抗真菌肽的核酸分子。经转录和翻译后，得到由N端至C端依次为信号肽、SUMO标签蛋白和抗真菌肽的融合多肽。
上述宿主细胞为选自微生物细胞、动物细胞中的任一种。其中，所述微生物优选为大肠杆菌。
第八方面，本发明提供一种大肠杆菌基因工程菌株，其为含有重组表达质粒的大肠杆菌，所述重组表达质粒含有编码所述抗真菌肽的核酸分子。
优选地，所述重组表达质粒含有顺次连接的编码所述信号肽的核酸分子和编码所述抗真菌肽的核酸分子。
上述表达质粒优选为pET22b。大肠杆菌优选为Origami(DE3)。
优选地，上述重组表达质粒为将顺次连接的编码所述信号肽的核酸分子和编码所述抗真菌肽的核酸分子连接至pET22b质粒得到。
上述大肠杆菌基因工程菌株为将所述重组表达质粒导入大肠杆菌Origami(DE3)得到。
第九方面，本发明提供所述抗真菌肽在抑制真菌生长繁殖或制备防霉剂中的应用。
优选地，所述真菌为黄曲霉。所述防霉剂为饲料防霉剂。
第十方面，本发明提供所述抗真菌肽的制备方法，所述方法包括：培养所述大肠杆菌基因工程菌株，收集培养液上清。
优选地，所述培养使用的培养基包括如下组分：0.8-1.2％的蛋白胨，0.8-1.2％的氯化钠，0.4-0.6％的酵母提取物，0.1-0.4％的果糖，0.3-0.9％的硫酸铵，0.75-1.5％的乙醇，0.05-0.2％的微量元素混合液以及0.1-0.5％的甘氨酸。
其中，所述微量元素混合液包括如下组分(g/L)：FeSO4·7H2O 2.5-3.0，MnCl2·4H2O 1.8-2.2，CoSO4·7H2O 2.5-3.0，CaCl2·2H2O 1.3-1.8，CuCl2·2H2O 0.18-0.25，ZnSO4·7H2O 0.25-0.35。
通过在培养基中添加一定浓度的甘氨酸能够加快抗真菌肽的胞外融合分泌表达，表达所需时间至少缩短12h。
更优选的培养基包括如下组分：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，0.1％果糖，0.7％硫酸铵，1.25％乙醇，0.15％微量元素混合液以及0.5％甘氨酸。
优选地，所述培养的条件如下：37℃，220rpm。本发明的抗真菌肽及其重组表达载体在上述培养条件下即可高效诱导抗真菌肽胞外融合分泌表达，无需低温或降速诱导，降低了对实验条件的要求。
优选地，在培养过程中加入蛋白诱导剂IPTG诱导抗真菌肽的表达，优选的IPTG浓度为0.5mM。
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的信号肽能够有效促进抗真菌肽在大肠杆菌中实现胞外分泌表达。
2、本发明提供的抗真菌肽具有良好的抗真菌活性，同时，其活性不受融合标签蛋白的影响，在融合SUMO标签蛋白后，仍具有较高的抗真菌活性，能够在表达后不切去SUMO标签蛋白的情况下有效抑制饲料霉变，具有制备方法简单的优势，显著降低了生产成本。利用本发明提供的信号肽可实现该抗真菌肽在大肠杆菌中高效分泌表达，表达的抗真菌肽直接分泌至胞外上清液中(分泌表达量达到200mg/L)，无需进行纯化，降低了抗真菌肽在胞内的过度积累，减少包涵体的形成，提高了抗真菌肽的表达量；而且无需破碎大肠杆菌菌体即可获得抗真菌肽，降低了内毒素的污染；
3、本发明提供的信号肽、抗真菌肽及其制备方法在推广抗真菌肽作为饲料防霉剂使用中具有非常积极的作用，也为其他抗真菌肽或抗菌肽在大肠杆菌中的外源表达提供了参考。
附图说明
图1为本发明实施例1中抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin和LsGRP1-C和SUMO标签在大肠杆菌中的融合分泌表达上清液SDS-PAGE电泳图。
图2为本发明实施例2中串联抗真菌肽基因构建流程图。
图3为本发明实施例2中串联抗真菌肽DL，DM，LD，LM，ML，MD，DLM，DML，LDM，LMD和SUMO标签在大肠杆菌中的融合分泌表达上清液SDS-PAGE电泳图。
图4为本发明实施例2中串联抗真菌肽饲料抑菌试验第四天的饲料外观图。
图5为本发明实施例3中抗真菌肽MD培养基碳源优化结果图。
图6为本发明实施例3中抗真菌肽MD培养基成分优化结果图。
图7为本发明实施例3中培养的第0h或8h添加1％甘氨酸对抗真菌肽MD融合分泌表达影响的SDS-PAGE电泳图；其中，泳道1，4，7是对照组；泳道2，5，8是在培养基0h添加1％甘氨酸；泳道3，6，9是在培养基8h添加1％甘氨酸。
图8为本发明实施例3中不同浓度甘氨酸对抗真菌肽MD融合分泌表达影响SDS-PAGE电泳图，其中，CON代表培养基中未添加甘氨酸，泳道3-8代表分别在培养基中添加0.125％，0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％甘氨酸。
具体实施方式
抗真菌肽在大肠杆菌中的外源表达主要是在胞内表达，纯化成本较高，限制了下游应用，本发明的第一个目的是提供一种可以将抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌培养基上清液中的信号肽、载体和大肠杆菌基因工程菌株。
抗真菌肽与表达标签的融合表达往往会影响抗真菌肽的活性，而使用标签蛋白酶切割标签释放活性又会进一步增加制备成本。为了解决上述问题，本发明通过串联抗真菌肽改变其三维相对空间结构来减少融合标签对抗真菌肽活性的影响，成功筛选到一种活性不受融合标签蛋白影响的抗真菌肽。因此，本发明的第二个目的是提供一种抑制饲料霉变能力不受融合标签影响的新型串联抗真菌肽。在此基础上，本发明还对该抗真菌肽的表达方法(包括培养基成分等)进行了优化。
本发明提供大肠杆菌胞外分泌表达抗真菌肽的表达载体和工程菌株的构建，具体如下：
(1)通过重叠PCR技术将多种信号肽连接至SUMO标签的N端，进一步将该融合基因连接至pET22b的RBS下游，得到大肠杆菌胞外融合分泌表达载体pET22b-SP-SUMO。
(2)随后将抗真菌肽基因构建至SUMO标签的C端，得到胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达质粒pET22b-SP-SUMO-AFP，将含有二硫键的抗真菌肽的表达质粒转化至大肠杆菌Origami(DE3)；将不含有二硫键的抗真菌肽的表达质粒转化至BL21(DE3)菌株即可得到胞外分泌表达抗真菌肽的工程菌株。
(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达24h，收集上清液进行SDS-PAGE电泳，检测上述信号肽是否能使抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌胞外。
应用上述方法，成功地筛选出了信号肽SX，该信号肽可以将抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C以及下述的串联抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌胞外。
本发明提供的表达载体和工程菌株可以将抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌胞外培养基上清液中，但并不局限于本发明提到的抗真菌肽。
本发明进一步通过筛选获得了活性不受融合标签蛋白影响的串联抗真菌肽，并提供了表达融合SUMO标签蛋白的有活性的串联抗真菌肽的方法，具体如下：
(1)通过Overlap PCR的方法将抗真菌肽Drosomycin、Metchnikowin、LsGRP1-C中的两种或三种串联，并在抗真菌肽间加入一段柔性Linker，可以改变抗真菌肽之间以及和融合标签蛋白之间的相对空间位置,从而降低融合标签对抗真菌肽活性的影响。其中，柔性Linker的碱基序列为：GGTGGTGGTGGTGGTTCT；氨基酸序列为：GGGGGS。
(2)将上述(1)中得到的串联抗真菌肽基因连接至上述表达载体中，得到胞外融合分泌表达串联抗真菌肽的表达质粒，转化至大肠杆菌Origami(DE3)菌株，得到胞外分泌表达串联抗真菌肽的工程菌株。
(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达24h。表达结束后，菌液于4℃下，13000rpm离心10min取上清液，过0.45μm滤膜，进行饲料抑菌试验。
应用上述方法，通过饲料抑菌试验成功地筛选到了一种新型串联抗真菌肽MD，抗真菌肽MD可以和SUMO融合分泌表达至大肠杆菌培养基上清液中，而且活性不受SUMO标签的影响，不切除SUMO标签，也具有抑制饲料霉变的活性。
本发明还对抗真菌肽MD在大肠杆菌中的融合分泌表达的培养基成分进行了优化，具体如下：
(1)通过优化抗真菌肽MD表达培养基中的碳源，硫酸铵，硫酸镁，微量元素混合溶液和乙醇添加浓度，得出抗真菌肽MD表达用最适培养基成分：1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，0.1％果糖，0.7％硫酸铵，1.25％乙醇和0.15％微量元素混合液。
(2)在培养基中添加0.5％甘氨酸可以加速抗真菌肽MD的胞外融合分泌表达，分泌表达时间缩短12h左右。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1在大肠杆菌胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达载体、工程菌株及表达方法
为解决抗真菌肽在大肠杆菌胞外分泌表达难的问题，本发明提供了一种可以在大肠杆菌胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达载体、工程菌株和表达方法，具体如下：
1、大肠杆菌胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达载体及工程菌株的构建
(1)设计融合分泌表达抗真菌肽表达载体RBS下游区域结构，其中抗真菌肽基因融合至SUMO标签的C端，SUMO标签的N端融合不同来源的信号肽。
(2)选择大肠杆菌来源或其它细菌来源的外膜蛋白或能够改变细胞膜通透性的蛋白酶的信号肽，包括：AnsBII，Endolanase，LamB，L-asparaginaseII，lpp，LTB，phoA，phoE，PelB，OmpA，OmpF，OmpT，MalE和SX(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；通过重叠PCR技术将这些不同来源的信号肽融合至SUMO标签的N端，各信号肽的引物序列见表1。
表1
Figure BDA0003513173610000041
Figure BDA0003513173610000051
重叠PCR反应步骤为：以pCOLD-SUMO载体为模板，以表1中的各F1和SUMO-R为引物，进行第一轮PCR反应；回收PCR产物后，以此为模板，以表1中的各F2和SUMO-R为引物，进行第二轮PCR反应，回收PCR产物，即可获得N端融合不同来源信号肽的SUMO标签基因片段。
(3)对pET22b载体和步骤(2)中N端融合不同来源信号肽的SUMO标签基因片段进行NdeI和BamHI双酶切反应，反应体系为：载体或融合基因2μg，NdeI 1μL，BamHI 1μL，cutsmart 5μL，补水至50μL；37℃酶切4h。
(4)胶回收酶切后的pET22b载体和融合基因使用T4DNA连接酶进行连接反应，反应体系为：载体1μL，融合基因2μL，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，补水至10μL；室温连接2h。
(5)连接反应结束的产物热击转化至大肠杆菌DH5α中，涂布至氨苄青霉素抗性LB固体培养基平板，37℃过夜培养。
(6)第二天，挑取氨苄青霉素抗性平板上的单菌落至5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h左右，进行质粒小提。
(7)使用NdeI和BamHI对小提的质粒进行双酶切鉴定，反应体系为：质粒500ng，NdeI 0.2μL，BamHI0.2μL，cutsmart 1μL，补水至10μL；37℃酶切2h。
(8)双酶切鉴定正确的质粒送去北京睿博兴科生物公司测序，测序正确的质粒命名为：pET22b-SP-SUMO，获得表达N端融合了不同来源信号肽的SUMO标签的表达载体。
(9)将抗真菌肽基因Drosomycin、Metchnikowin和LsGRP1-C连接至pET22b-SP-SUMO表达载体上的BamHI和HindIII间，连接步骤同(3)-(8)。将测序正确的质粒命名为：pET22b-SP-SUMO-Drosomycin、pET22b-SP-SUMO-Metchnikowin和pET22b-SP-SUMO-LsGRP1-C，获得了胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达载体。
(10)将上述表达载体转化入大肠杆菌中，其中因Drosomycin和LsGRP1-C基因中含有多个二硫键，转化至胞内还原环境敲除的Origami(DE3)菌株中；Metchnikowin为线性抗真菌肽，转化至BL21(DE3)菌株中。转化结束后涂布至氨苄青霉素抗性LB固体培养基平板，37℃过夜培养，获得可胞外融合分泌表达抗真菌肽的工程菌株。
2、大肠杆菌胞外融合分泌表达抗真菌肽的表达方法及效率检测
(1)挑取上述1中构建的工程菌株的单菌落至5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h左右。接种至100mL液体LB培养基中，接种比例为1:100，37℃，220rpm培养。
(2)培养至OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达，诱导表达条件为37℃，220rpm。
(4)在诱导后的不同时间点取样进行SDS-PAGE电泳，取样步骤为：吸取1mL菌液，于4℃下，13000rpm离心10min，吸取上清液，加入5×蛋白loading buffer，于95℃下煮10min，上样进行SDS-PAGE电泳，检测抗真菌肽融合分泌表达效率。
(5)SDS-PAGE电泳结果显示，含有信号肽SX的pET22b-SX-SUMO载体可以将抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌胞外培养基中，而其它信号肽在培养基上清液中表达量过低或未检测到表达。如图1所示，SUMO-Drosomycin在诱导33h后分泌量达到最高，SUMO-Metchnikowin在诱导48h后分泌量达到最高，SUMO-LsGRP1-C在诱导20h后分泌量达到最高，表达量均在100mg/L左右。然而，对上述表达的抗真菌肽进行活性检测发现，这三种融合分泌表达的抗真菌肽均没有活性，切去SUMO标签后才具有抑制黄曲霉生长和饲料霉变的作用，说明融合表达的抗真菌肽受到了SUMO标签的影响，需要切去标签才可以发挥活性。但SUMO蛋白酶Ulp1的价格较贵，这在一定程度上限制了抗真菌肽的实际应用，而且纯化步骤较为复杂，也增加了制备成本。
实施例2融合SUMO标签蛋白的串联抗真菌肽的筛选及其在大肠杆菌中的融合分泌表达
由于抗真菌肽分子量较小，抗真菌肽与表达标签的融合表达往往会影响到抗真菌肽的活性，本实施例设计多种抗真菌肽串联的方式，并在串联的抗真菌肽之间设计一段柔性Linker，以期可以改变抗真菌肽之间及其与表达标签之间的相对空间位置，得到抑菌能力不受融合标签影响的抗真菌肽，具体如下：
1、串联抗真菌肽基因、融合表达载体及菌株的构建
(1)使用Overlap PCR技术构建串联抗真菌肽，并在抗真菌肽之间加入一段柔性Linker(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，构建方法如图2所示。首先设计适宜的引物进行PCR反应得到具有互补末端的两条DNA片段。然后进行第二次PCR反应(分为两轮)：第一轮PCR反应体系为47μL，其中两条DNA片段按照等摩尔比添加，PCR高保真酶25μL，补水至47μL，反应循环数为8；第一轮反应结束后立即加入各1.5μL的上下游引物，进行第二轮PCR，反应循环数为35。引物见表2。利用上述方法分别构建由Drosomycin和Metchnikowin串联得到的抗真菌肽DM(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)和MD(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)；由Drosomycin和LsGRP1-C串联得到的抗真菌肽DL(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)和LD(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)；由Metchnikowin和LsGRP1-C串联得到的抗真菌肽ML(氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)和LM(氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)；由Drosomycin、Metchnikowin和LsGRP1-C串联得到的抗真菌肽DML(氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)，DLM(氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示)，MLD(氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示)，MDL(氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示)，LMD(氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示)，LDM(氨基酸序列如SEQID NO.19所示)。
表2
Figure BDA0003513173610000061
Figure BDA0003513173610000071
(2)对上述(1)中得到的融合基因连接至实施例1构建的pET22b-SX-SUMO载体，使用实施例1的方法，构建表达载体。经过测序确认后，获得多种融合表达串联抗真菌肽的表达载体：pET22b-SX-SUMO-DM，pET22b-SX-SUMO-MD，pET22b-SX-SUMO-DL，pET22b-SX-SUMO-LD，pET22b-SX-SUMO-ML，pET22b-SX-SUMO-LM，pET22b-SX-SUMO-DML，pET22b-SX-SUMO-DLM，pET22b-SX-SUMO-MLD，pET22b-SX-SUMO-MDL，pET22b-SX-SUMO-LMD，pET22b-SX-SUMO-LDM。
(3)将上述(2)中的表达载体转化至大肠杆菌Origami(DE3)菌株中，转化结束后涂布至氨苄青霉素抗性LB固体培养基平板，37℃过夜培养。获得可融合表达串联抗真菌肽的大肠杆菌菌株。
2、串联抗真菌肽在大肠杆菌中的融合分泌表达
(1)分别挑取上述1中所述含不同表达载体的菌株平板上的单菌落至5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h左右。接种至100mL液体LB培养基中，接种比例为1:100，37℃，220rpm培养。
(2)培养至OD600在0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导表达。诱导表达条件为：37℃，220rpm。对照组不加入IPTG，不进行诱导表达。
(3)诱导表达24h后，于4℃下，13000rpm离心10min，吸取上清液，加入5×蛋白loading buffer，于95℃下煮10min，上样进行SDS-PAGE电泳，检测串联抗真菌肽融合分泌表达效率。
(4)SDS-PAGE电泳结果如图3所示，构建的多种串联抗真菌肽均可以融合分泌表达至大肠杆菌胞外培养基中，表达量在100mg/L左右。
3、大肠杆菌胞外分泌表达串联抗真菌肽活性鉴定
(1)将上述2中诱导表达24h后的菌液，于4℃下，13000rpm离心10min，收集上清液，过0.45μm滤膜，进行饲料抑菌试验。
(2)饲料抑菌试验：在10g饲料中加入8mL串联抗真菌肽融合分泌表达24h后的上清液，混匀后转移至培养皿中，放置于室温***凉处培养，对照组加入等体积的不加IPTG诱导表达的上清液。
(3)结果如图4所示，在试验第四天，只有抗真菌肽MD分泌表达上清液可以明显抑制饲料霉变，抑菌率达89％，其他串联抗真菌肽分泌表达上清液均无抑制霉变的效果。因此，经上述筛选获得了一种串联抗真菌肽MD，该串联抗真菌肽即使在与SUMO标签融合表达(SUMO-MD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的情况下，仍具有较强的抑制饲料霉变的能力，具有较强的推广应用潜力。
实施例3抗真菌肽MD在大肠杆菌中分泌表达条件的优化
1、培养基成分优化
(1)在初始LB培养基中补充不同浓度的碳源：葡萄糖、甘油、木糖、麦芽糖、蔗糖和果糖，以及不同浓度的硫酸铵，硫酸镁，微量元素混合溶液和乙醇，具体添加量如图5和图6所示。其中，微量元素混合溶液各组分浓度(g/L)：FeSO4·7H2O 2.8，MnCl2·4H2O 2，CoSO4·7H2O 2.8，CaCl2·2H2O 1.5，CuCl2·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O0.3。表达条件为37℃，220rpm，表达时间为24h。
(2)表达结束后，取1mL菌液，于4℃下，13000rpm离心10min，收集上清液，加入5×蛋白loading buffer后，于95℃下煮5min，进行SDS-PAGE电泳，检测添加碳源对抗真菌肽MD融合分泌表达的影响。
(3)如图5所示，添加葡萄糖、甘油和木糖会引起培养基pH值的迅速下降，导致抗真菌肽MD无法分泌至培养基中；添加麦芽糖和蔗糖对培养基pH值没有显著影响，但并没有促进抗真菌肽MD的分泌表达；添加果糖会引起培养基pH值的微弱下降，但是会提高抗真菌肽MD的分泌表达产量。因此，果糖是抗真菌肽MD分泌表达中的最适碳源。
(4)如图6所示，培养基中添加硫酸铵会提高抗真菌肽MD的表达量，而且随着硫酸铵添加量的增加，MD的表达产量也随之上升；培养基中补充少量乙醇可以提高MD表达量，补充微量元素混合液对表达量的影响不明显，补充硫酸镁对表达量存在负面影响。
(5)根据上述结果设计正交试验，在LB培养基中补充不同浓度的果糖，硫酸铵，乙醇和微量元素混合液，筛选最适合抗真菌肽MD表达的培养基。正交试验设计和结果如表3所示，其中，相对表达量为相对于在LB培养基中的MD的表达量。经筛选，最适培养基成分是1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取物，0.1％果糖，0.7％硫酸铵，1.25％乙醇和0.15％微量元素混合液，MD的表达量可以提高59％，达到159mg/L。
表3
编号 果糖(％) 硫酸铵％ 乙醇％ 微量元素％ 相对表达量
1 0.1 0.3 0.75 0.05 1.56
2 0.1 0.5 1 0.1 1.47
3 0.1 0.7 1.25 0.15 1.59
4 0.1 0.9 1.5 0.2 1.43
5 0.2 0.3 1 0.15 1.22
6 0.2 0.5 0.75 0.2 1.41
7 0.2 0.7 1.5 0.05 1.08
8 0.2 0.9 1.25 0.1 1.50
9 0.3 0.3 1.25 0.2 0.94
10 0.3 0.5 1.5 0.15 0.77
11 0.3 0.7 0.75 0.1 1.13
12 0.3 0.9 1 0.05 1.27
13 0.4 0.3 1.5 0.1 0.45
14 0.4 0.5 1.25 0.05 0.29
15 0.4 0.7 1 0.2 0.55
16 0.4 0.9 0.75 0.15 0.95
2、甘氨酸促进抗真菌肽MD分泌表达添加条件优化
(1)在培养的第0h和第8h添加1％甘氨酸至上述1中确定的最适培养基中，探究甘氨酸对抗真菌肽MD表达的影响。诱导表达条件为37℃，220rpm，在表达第8h，20h和32h分别取样进行SDS-PAGE电泳。
(2)结果如图7所示，诱导表达8h时，抗真菌肽MD在对照组培养基上清中还检测不到，但在添加1％甘氨酸培养基上清中可以明显观察到抗真菌肽MD的分泌表达，而且在第0h添加1％甘氨酸表的达量更高。结果表明，甘氨酸可以加速抗真菌肽MD的分泌表达，缩短诱导时间，其中，培养第0h添加甘氨酸是最适添加时间。
(3)在培养的第0h添加浓度分别为：0.125％，0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％甘氨酸至步骤1中确定的最适培养基中，探究甘氨酸加速抗真菌肽MD表达的最适浓度。诱导表达条件不变，在表达第9h取样进行SDS-PAGE电泳。
(4)结果如图8所示，0.5％是甘氨酸加速抗真菌肽MD分泌表达的最适浓度，表达产量达到200mg/L左右。
综上所述，本发明提供的方法可以成功将多种抗真菌肽及串联抗真菌肽融合分泌表达至大肠杆菌培养基中；本发明利用串联抗真菌肽的方法成功筛选到一种活性不受SUMO表达标签影响的抗真菌肽MD，可以有效抑制饲料霉变；本发明进一步优化了抗真菌肽MD的表达条件，在实验室摇瓶(250mL)培养条件下表达量高达200mg/L，为后续大规模发酵生产提供了良好的基础。本发明在推广抗真菌肽作为饲料防霉剂使用中具有非常积极的作用，也为其他抗真菌肽或抗菌肽在大肠杆菌中的外源表达提供了参考。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种抗真菌肽及其制备方法
<130> KHP221110629.4
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Ile Gly Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Pro Trp
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
        35                  40                  45
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
    50                  55                  60
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65                  70                  75
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
            20                  25                  30
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
        35                  40                  45
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp
65                  70                  75                  80
Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
                85                  90                  95
Gly Gly Ser His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser
            100                 105                 110
Pro Phe Asn Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val
    130                 135                 140
Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser
145                 150                 155                 160
Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
                165                 170                 175
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacaatga tcactaacag tagtagtgta ccgatcggag cagcaagagc accatgg 57
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggtggtg gtggttct 18
<210> 7
<211> 228
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcgtcatc agggtccgat ttttgatacc cgtccgagcc cgtttaatcc gaatcagccg 60
cgtccgggtc cgatttatgg tggtggtggt ggttctgact gcctgtctgg tcgttacaaa 120
ggtccgtgcg ctgtttggga caacgaaacc tgccgtcgtg tttgcaaaga agaaggtcgt 180
tcttctggtc actgctctcc gtctctgaaa tgctggtgcg aaggttgc 228
<210> 8
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60
gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120
aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180
gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaatccaag ctgatcagac ccctgaagat 240
ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggatcccat 300
cgtcatcagg gtccgatttt tgatacccgt ccgagcccgt ttaatccgaa tcagccgcgt 360
ccgggtccga tttatggtgg tggtggtggt tctgactgcc tgtctggtcg ttacaaaggt 420
ccgtgcgctg tttgggacaa cgaaacctgc cgtcgtgttt gcaaagaaga aggtcgttct 480
tctggtcact gctctccgtc tctgaaatgc tggtgcgaag gttgc 525
<210> 9
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1               5                   10                  15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Gly Ser His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro
    50                  55                  60
Phe Asn Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr
65                  70                  75
<210> 10
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1               5                   10                  15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Gly Ser Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly
    50                  55                  60
Cys Arg Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Ala Tyr Gly His Pro
                85
<210> 11
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
1               5                   10                  15
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
            20                  25                  30
Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys Leu Ser
        35                  40                  45
Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg
    50                  55                  60
Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
                85
<210> 12
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
        35                  40                  45
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
    50                  55                  60
Pro Ala Tyr Gly His Pro
65                  70
<210> 13
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
1               5                   10                  15
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
            20                  25                  30
Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser His Arg His Gln
        35                  40                  45
Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn Pro Asn Gln Pro
    50                  55                  60
Arg Pro Gly Pro Ile Tyr
65                  70
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1               5                   10                  15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Gly Ser His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro
    50                  55                  60
Phe Asn Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ser Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly
                85                  90                  95
Cys Arg Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg
            100                 105                 110
Ala Glu Pro Ala Tyr Gly His Pro
        115                 120
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1               5                   10                  15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
            20                  25                  30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Gly Ser Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly
    50                  55                  60
Cys Arg Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Ala Glu Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser His Arg
                85                  90                  95
His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr
        115                 120
<210> 16
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
        35                  40                  45
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
    50                  55                  60
Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg
                85                  90                  95
Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
        115                 120
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
His Arg His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn
1               5                   10                  15
Pro Asn Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
            20                  25                  30
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
        35                  40                  45
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
    50                  55                  60
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ser Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly
                85                  90                  95
Cys Arg Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg
            100                 105                 110
Ala Glu Pro Ala Tyr Gly His Pro
        115                 120
<210> 18
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
1               5                   10                  15
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
            20                  25                  30
Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser His Arg His Gln
        35                  40                  45
Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn Pro Asn Gln Pro
    50                  55                  60
Arg Pro Gly Pro Ile Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg
                85                  90                  95
Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser
            100                 105                 110
Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
        115                 120
<210> 19
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Arg Cys Tyr Asn Gly Cys Cys Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Gly Cys Arg
1               5                   10                  15
Cys Cys Ala His Pro Asp Glu Ile Pro Asp Pro Glu Tyr Arg Ala Glu
            20                  25                  30
Pro Ala Tyr Gly His Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys Leu Ser
        35                  40                  45
Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg
    50                  55                  60
Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser His Arg
                85                  90                  95
His Gln Gly Pro Ile Phe Asp Thr Arg Pro Ser Pro Phe Asn Pro Asn
            100                 105                 110
Gln Pro Arg Pro Gly Pro Ile Tyr
        115                 120
<210> 20
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
actggttatg ggttttagtg gtgcagcgct agccatgtcg gactcagaag tca 53
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcgcatatg gattttttca aaaagacggc acttgccgca ctggttatgg gttttagtgg 60
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcagctttca tgagtatcag catgttttcg gcaaccgcct ctgcatgtcg gactcagaa 59
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atcgcatatg tttaagttta aaaagaaatt cttagttgga ttaacggcag ctttcatgag 60
tatcag 66
<210> 24
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtcgcagcg ggcgtaatgt ctgctcaggc aatggctatg tcggactcag aagtcaa 57
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atcgcatatg atgattactc tgcgcaaact tcctctggcg gttgccgtcg cagcgggcgt 60
aat 63
<210> 26
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actggttatg ggttttagtg gtgcagcatt ggcaatgtcg gactcagaag tcaa 54
<210> 27
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atcgcatatg gagtttttca aaaagacggc acttgccgca ctggttatgg gttttagtgg 60
tg 62
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt atgtcggact cagaagtcaa 50
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atcgcatatg aaagctacta aactggtact gggcgcggta atcctgggtt ctactctg 58
<210> 30
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cggcgttact atcctctcta tatgcccatg gaatgtcgga ctcagaagtc aatc 54
<210> 31
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atcgcatatg aataaagtaa aatgttatgt tttatttacg gcgttactat cctctctata 60
tg 62
<210> 32
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcattaacga cgatgatgtt ttccgcctcg gctctcgcca tgtcggactc agaagtcaa 59
<210> 33
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atcgcatatg aaaataaaaa caggtgcacg catcctcgca ttatccgcat taacgacgat 60
gat 63
<210> 34
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cactagcagg attcgccaca gtagcacaag caatgtcgga ctcagaagtc aat 53
<210> 35
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atcgcatatg aagaagacag ctatagcaat agcagtagca ctagcaggat tcgccacagt 60
a 61
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgctctgtt agtagcaggt actgcaaacg ctatgtcgga ctcagaagtc aa 52
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atcgcatatg aagcgcaata ttctggcagt gatcgtccct gctctgttag tagcaggta 59
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
caggactatt cccagaagtt tcgcccgcat atgtcggact cagaagtcaa t 51
<210> 39
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atcgcatagc aaaagagctg atcgcaatag gggttgtcag gactattccc agaagttt 58
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
taccgttact gtttacccct gtgacaaaag ccatgtcgga ctcagaagtc aa 52
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
atcgcatatg aaacaaagca ctattgcact ggcactctta ccgttactgt ttacccctgt 60
<210> 42
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
catcaccact aatgccagag tgctcttttt catatgtcgg actcagaagt caa 53
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
atcgcatggc ctgtacggat gcagatgcca caatgcccat caccactaat gccagagtg 59
<210> 44
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ctgctgctcc tcgctgccca gccggcgatg gccatgtcgg actcagaagt caatc 55
<210> 45
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
atcgcatatg aaatacctgc tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca 60
gc 62
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgtaccgatc ggagcagcaa gagcaatgtc ggactcagaa gtcaa 45
<210> 47
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atcgcataca atgatcacta acagtagtag tgtaccgatc ggagcagcaa ga 52
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atcgggatcc accaatctgt tctctgtgag 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atcgggatcc gactgcctgt ctggtcgtta 30
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggtggtggtg gtggttctga ctgcctgtct ggtcgtta 38
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agaaccacca ccaccaccgc aaccttcgca ccagc 35
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
atcgaagctt ttagctggtg cgaaggttgc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atcgggatcc catcgtcatc agggtccgat 30
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ggtggtggtg gtggttctca tcgtcatcag ggtcc 35
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
agaaccacca ccaccaccat aaatcggacc cggacgcg 38
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atcgaagctt ttaataaatc ggacccggac g 31
<210> 57
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
atcgggatcc cgttgctaca acggttgc 28
<210> 58
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ggtggtggtg gtggttctcg ttgctacaac ggttgc 36
<210> 59
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agaaccacca ccaccacccg ggtgaccgta agcc 34
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
atcgaagctt ttacgggtga ccgtaagcc 29

Claims (10)

1.一种抗真菌肽，其特征在于，其为将抗真菌肽Metchnikowin和Drosomycin经柔性linker连接得到。
2.根据权利要求1所述的抗真菌肽，其特征在于，所述抗真菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ IDNO.3所示。
3.编码权利要求1或2所述的抗真菌肽的核酸分子。
4.含有权利要求3所述的核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
5.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，其为含有重组表达质粒的大肠杆菌，所述重组表达质粒含有权利要求3所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，所述重组表达质粒含有顺次连接的编码信号肽的核酸分子和权利要求3所述的核酸分子；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求5或6所述的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，所述表达质粒为pET22b，和/或，所述大肠杆菌为Origami(DE3)。
8.权利要求1或2所述的抗真菌肽在抑制真菌生长繁殖或制备防霉剂中的应用。
9.权利要求1或2所述的抗真菌肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求5～7任一项所述的大肠杆菌基因工程菌株，收集培养液上清。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养使用的培养基包括如下组分：0.8-1.2％的蛋白胨，0.8-1.2％的氯化钠，0.4-0.6％的酵母提取物，0.1-0.4％的果糖，0.3-0.9％的硫酸铵，0.75-1.5％的乙醇，0.05-0.2％的微量元素混合液以及0.1-0.5％的甘氨酸。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1500810A (zh) * 1996-12-27 2004-06-02 暨南大学生物工程研究所 成纤维细胞生长因子-2结构类似物,其生产方法及应用
EP1814904A2 (en) * 2004-11-10 2007-08-08 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Antibiotic drosocin derivatives
CN110305887A (zh) * 2018-03-27 2019-10-08 华南农业大学 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1500810A (zh) * 1996-12-27 2004-06-02 暨南大学生物工程研究所 成纤维细胞生长因子-2结构类似物,其生产方法及应用
EP1814904A2 (en) * 2004-11-10 2007-08-08 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Antibiotic drosocin derivatives
CN110305887A (zh) * 2018-03-27 2019-10-08 华南农业大学 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王德成 ; 佘敏 ; 佘锐萍 ; 李文贵 ; 王英华 ; 孙泉 ; .抗菌肽的构效关系及其基因表达调控的研究进展.中国兽医科学.(第03期), *

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