CN102839165A

CN102839165A - 基因突变型重组蛋白酶k及其工业化生产方法

Info

Publication number: CN102839165A
Application number: CN2012103637008A
Authority: CN
Inventors: 安海谦; 鲁刚伟; 冉波; 任玉珍
Original assignee: Kim Puno Biotechnology (suzhou) Co Ltd
Current assignee: Jiangsu jinpunuoan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102839165B

Abstract

本发明涉及一种基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法。更具体而言，本发明涉及一种经过基因改造和蛋白质工程化得到的酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上的基因突变型重组蛋白酶K；以及利用酵母细胞大规模培养表达外源蛋白，制备所述基因突变型重组蛋白酶K的工业化生产方法和工艺过程。

Description

基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法

技术领域

背景技术

蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）的提取物中发现（Ebeling W等，Eur J Biochem.1974Aug 15;47(1):91-7）。由于该酶能够消化富含二硫键的天然角蛋白，林伯氏白色念球菌能够以角蛋白作为唯一的碳源/氮源生长，蛋白酶K也由此得名。

蛋白酶K最大的特点在于对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力，是现有蛋白酶中活性最高的一种。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特别是丙氨酸的羧基端肽键。

此外，蛋白酶K还是一种稳定性非常出色的酶，在pH 4~pH 12、20℃~60℃的条件下均有活性，在多种能够使蛋白质变性的化学试剂（如SDS、尿素、螯合剂（如EDTA）及巯基试剂（如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂））中也具有切割蛋白质的能力。

由于细胞裂解过程中通常使用SDS溶液，而蛋白酶K在0.5%（w/v）的SDS溶液中依然能够维持完全的活性，使得其可应用于核酸提取中，通过快速降解细胞裂解释放出的胞内核酸酶，分离得到完整的核酸片段。在先研究还表明，蛋白酶K在去污剂（如Triton X-100）中也具有出色的稳定性，因而还被广泛用于膜蛋白及跨膜蛋白的研究中。

近年来，蛋白酶K的应用并不仅仅局限在医疗诊断及科研领域，在工业制革、造纸、饲料等领域中也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料。因此，得到高活性、低造价的蛋白酶K具有实际意义。

然而，天然蛋白酶K依靠传统发酵提取，产量很低，成本较高，不适合今后该产品的大规模运用。因此，目前本领域的研究焦点集中在利用基因工程技术和蛋白质工程技术，改造蛋白质的分子结构，期望得到活性更高、成本更低的蛋白酶K。

迄今为止，现有工业化生产的基因重组蛋白酶K是以原核细胞为宿主，譬如大肠杆菌表达***，其优点是简便、经济。然而，该***表达得到的蛋白酶K活性不高或者没有活性，达不到天然蛋白酶K的水平，这可能是由于蛋白酶K需要转录或翻译后处理过程，原核***无法实现这个功能。此外，利用原核细胞进行外源蛋白表达的产量过低，因而难以满足市场需求。

此外，若想获得商品化的蛋白酶K产品，下游纯化和冻干技术非常重要，目前在这方面并没有可以借鉴的资料。例如，利用已经报道的纯化方法均不能得到大批量、高产率的蛋白酶K。经过本发明人的测试，这些纯化方法在规模化生产中实用价值不高。

为解决上述问题，本发明人进行了深入的研究，结合了基因突变和真核细胞-酵母外分泌表达技术，从改造蛋白酶K分子结构入手，得到活性提高的基因突变型重组蛋白酶K；优化表达***，利用酵母细胞外分泌表达技术，大规模发酵高效表达基因突变型重组蛋白酶K，进一步提高蛋白酶K的活性及产量；采用新型蛋白纯化方式，提高蛋白酶K纯化过程中的收率，从而实现了规模化和连续化生产，完成了本发明。目前在专利文件和非专利文件中均未发现关于基因突变型重组蛋白酶K在酵母中工业化生产的报道。

发明内容

野生型蛋白酶K前体由384个氨基酸组成（SEQ ID NO.1，UniProtKB/Swiss-Prot:P06873.2），包括15个氨基酸长度的信号肽、90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K。

经过国外科学家研究，相比于野生型蛋白酶K，基因突变型重组蛋白酶K可以具有较高的活性。本发明人从野生型蛋白酶K的氨基酸序列（SEQ ID NO.2，由369个氨基酸组成，包括90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K）中挑选了八个关键位点，合成基因并在真核***表达成功，得到了酶活大大提高的基因突变型重组蛋白酶K。

因此，本发明的第一方面在于提供一种基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于：

（1）将野生型蛋白酶K氨基酸序列（SEQ ID NO.2）中第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N；任选地，还进行下述任意1种以上的突变：

（2）将第123位的S突变为A；

（3）将第180位的L突变为I。

本发明另一方面在于提供编码上述基因突变型重组蛋白酶K的DNA。

本发明另一方面在于提供包含上述DNA的表达载体。

本发明又一方面在于提供导入上述表达载体的转化细胞。

本发明再一方面在于提供含有上述基因突变型重组蛋白酶K、DNA、表达载体和/或转化细胞的试剂盒。

本发明另一方面在于提供利用真核细胞制备上述基因突变型重组蛋白酶K的方法，该方法包含如下步骤：在培养基中培养含有本发明的基因突变型重组蛋白酶K的转化细胞；以及收集所述培养基中的所述基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于，所述转化细胞是酵母细胞。

此外，本发明人通过选择不同树脂材料脱色、不同层析介质纯化、不同保护剂和冻干工艺冷冻干燥，得到了商品化的基因突变型重组蛋白酶K产品。

因此，本发明另一方面提供了发酵生产蛋白酶K后，采用新型纯化方式处理提高得率及批量冷冻干燥的技术。

附图说明

从与附图结合的下列详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：

图1表示显示本发明的基因突变型重组蛋白酶K mutProK6、mutProK7-1、mutProK7-2及mutProK8氨基酸序列中突变位点的概要图。

图2表示酵母表达载体pPIC9K的载体图谱。

图3表示利用SDS-PAGE检测本发明的基因突变型重组蛋白酶K mutProK8在GS115酵母细胞中的表达的结果（实验室规模；摇瓶发酵）。

图4表示利用Western印迹检测本发明的基因突变型重组蛋白酶K mutProK8在GS115酵母细胞中的表达的结果（实验室规模；摇瓶发酵及30L发酵罐发酵）。

图5表示基因突变型蛋白酶K mutProK8和野生型蛋白酶K的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果（实验室规模；摇瓶发酵）。

图6表示基因突变型蛋白酶K mutProK8消化牛血清白蛋白（BSA）的定性实验结果。

图7表示利用F-C分析法对本发明的基因突变型重组蛋白酶K的酶活性进行定性检测时所得到的酪氨酸标准曲线。

图8表示利用SDS-PAGE检测2吨发酵罐培养毕赤酵母不同时间产酶量的结果。

图9表示利用电泳对经纯化冻干后的基因突变型重组蛋白酶K的纯度进行检测的结果：图9A：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；图9B：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图10表示本发明的基因突变型重组蛋白酶K的稳定性结果。

具体实施方式

下文将详细阐述本发明。

一.本发明的基因突变型重组蛋白酶K以及活性测定

本发明的基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于：

（1）将野生型蛋白酶K氨基酸序列（SEQ ID NO.2）中第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N；任选地还进行下述任意1种以上的突变：

（2）将第123位的S突变为A；

（3）将第180位的L突变为I。

在本发明中，“123位”、“151位”、“180位”、“208位”、“273位”、“293位”、“332位”及“337位”并不是必然表示从所述蛋白酶K的N端起的绝对位置，而是表示与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比的相对位置。例如，在含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的蛋白酶中，当该蛋白酶123位的N端某一位置缺失了一个氨基酸，上述的123位即变为122位。即使在这一情况下，所述从N端残基起计数为122位的氨基酸在本发明中仍为“123位”的氨基酸。通过将感兴趣的蛋白酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.2的氨基酸序列进行比对而确定所述氨基酸的相对位置。

与对应的野生型蛋白酶（SEQ IDNO.2）的酶活性相比，本发明的基因突变型重组蛋白酶K的酶活性更高。

根据本发明一个优选的实施方式，可通过下述方法测定本发明的重组蛋白酶的活性。

将干酪素溶于磷酸钾溶液中并调节pH值制备底物溶液。将试样加入上述底物溶液中。使该混合物在37℃下反应，然后加入反应终止液终止反应。通过离心得到上清，加入无水碳酸钠，然后加入酚试剂（Folin-Ciocalteu试剂）。反应后在660nm下测定吸光度。将用试样的吸光度值减去空白的吸光度值得到的值转化为游离酪氨酸的含量，以计算出蛋白活性值。蛋白活性的单位为U/mL（单位/毫升）。该1单位是指在上述方法中，在1分钟（min）内使得相当于1μmol酪氨酸的酚试剂显色物增加的酶的量。通过制作酪氨酸的校准曲线得到酪氨酸和酚试剂显色物的关联方程。

二.编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA

本发明的DNA是编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA。根据本发明一个优选的实施方式，本发明的DNA可通过以下方式获得：例如采用PCR等方法获得野生型蛋白酶K基因（例如，如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列），通过定点突变法等将目的突变导入，制备编码各基因突变型重组蛋白酶K的DNA。

对于定点突变法并没有特别限定，例如，可以使用市售的QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene公司制造）等进行。作为引入定点突变的方法，例如，Gapped duplex法和Kunkel法都是已知的。

根据本发明另一个优选的实施方式，也可以通过化学合成得到本发明的DNA。根据本发明一个特别优选的实施方式，为提高重组蛋白在宿主细胞内的表达效率，可将野生型蛋白酶K的编码序列（SEQ ID NO.3）替换为宿主细胞偏爱密码子组成的DNA序列，引入目的突变后，再通过化学合成的方式制备本发明的DNA。根据本发明一个最优选的实施方式，所述宿主细胞偏爱密码子为酵母偏爱密码子。

优选地，作为编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA，例如为具有SEQ ID NO.6-9所表示的第7-1113位的核苷酸序列的DNA。但是，只要编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K，则并不限于这些。

另外，编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的多核苷酸，也可以是编码下述基因突变型重组蛋白酶K的多核苷酸：与SEQ ID NO.6-9所表示的第7-1113位的核苷酸序列的互补序列在严格条件下进行杂交、且编码具有上述特定的突变并具有上述所希望的活性的基因突变型重组蛋白酶K。

严格条件是指形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。尽管该条件因核苷酸序列或其长度而不同，其实例包括具有高同源性（例如，具有不低于75%、优选不低于90%、进一步优选不低于95%的同源性）的DNA相互杂交，而同源性低于上述标准的DNA不杂交的条件；或Southern杂交中用于漂洗的常用条件的杂交条件（60℃和1×SSC、0.1%SDS，优选0.1×SSC和相当于0.1%SDS的盐浓度）。

三.本发明的表达载体

本发明的表达载体是用于表达本发明的基因突变型重组蛋白酶K的表达载体。根据本发明一个优选的实施方式，所述表达载体可具有如下的结构：控制所述DNA表达的启动子序列连接到编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA的上游。此外，还可以将终止子连接到所述DNA的下游。

作为酵母细胞中的表达载体，可使用pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K中的任何类型。从拷贝数和稳定性的角度来看，优选pPIC9K。

根据本发明一个优选的实施方式，用于挑选重组体的选择标记基因或用于检测导入基因表达的报告基因也可***本发明的表达载体中。选择标记基因的实例包括但不限于潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。报告基因的实例包括但不限于β-葡糖醛酸酶（GUS）基因、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因、荧光素酶（LUC）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因。

根据本发明另一个优选的实施方式，为了分泌表达本发明的基因突变型重组蛋白酶K、或为了便于纯化所表达的蛋白酶K，本发明的表达载体中可包含附加序列。在这种情况下，本发明的蛋白酶K以融合蛋白（与附加序列编码的蛋白或肽融合）的形式表达。所述附加序列的实例包括但不限于编码信号肽或前肽的核苷酸序列；以及编码His标签或GST标签的核苷酸序列。

四.本发明的转化细胞

本发明的转化细胞是导入本发明的表达载体的细胞，该细胞能生产本发明的基因突变型重组蛋白酶K。尽管该转化细胞可以是原核细胞或可以是真核细胞，优选为真核细胞。

所述真核细胞的实例包括但不限于酵母细胞。根据本发明一个优选的实施方式，所述真核细胞为酵母细胞。根据本发明再一个优选的实施方式，所述酵母细胞为毕赤酵母（Pichia）细胞、假丝酵母（Candida）细胞、多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）细胞、球拟酵母（Torulopsis）细胞、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）细胞和克鲁维酵母（Kluyveromyces）细胞。

根据本发明一个尤其优选的实施方式，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞。由于目前对毕赤酵母的发酵条件有着更深入的研究，且所述毕赤酵母细胞在发酵制备中成本最低，能够满足技术需求和产品市场化的需求，因而毕赤酵母细胞被认为是基因突变型重组蛋白酶K生产中最为优选的转化细胞。

根据本发明一个优选的实施方式，所述毕赤酵母细胞是GS115酵母细胞（美国Gproan Protein Engineering,Inc.赠送）。

可根据转化细胞的类型适当选择将表达载体导入转化细胞的方法。这些方法都是本领域技术人员已知的。

根据本发明一个优选的实施方式，可通过以下方法获得毕赤酵母的转化体：采用电击转化的方法，将线性化表达载体转化到酵母感受态细胞中。随后将菌体悬液涂布于平板上，并培养平板直至出现单个菌落。

五.本发明的试剂盒

本发明的试剂盒是包含本发明的基因突变型重组蛋白酶K、编码本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA、本发明的表达载体及本发明的转化细胞中的一种或多种的试剂盒。

通常，所述试剂盒包含容器和在该容器上或与该容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。该容器可由多种材料形成，如玻璃或塑料。所述标签和包装说明书指示了该试剂盒的使用方法及用途。

任选地，本发明的试剂盒还可另外包括一种或多种组分，所述组分选自于由试管、反应缓冲液、PCR引物、dNTP、Taq聚合酶、逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC水和无菌水构成的组，但不总限于此。

六.本发明的基因突变型重组蛋白酶K的制备方法（实验室规模）

通过培养本发明的转化细胞，可生产本发明的基因突变型重组蛋白酶K，通过与信号肽融合的融合蛋白的形式表达本发明的基因突变型重组蛋白酶K以用于分泌，本发明的蛋白酶可在培养基中积累。当使用诱导型启动子时，优选在培养期间进行诱导。尽管培养所述转化细胞的方法随细胞的类型而不同，但可以使用传统方法。

根据本发明一个优选的实施方式，培养所述毕赤酵母转化体的方法的实例如下所述：

挑取酵母单菌落至YPD培养基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L）中培养。离心收集菌体。用MM培养基（13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5mL/L甲醇）重悬菌体后振荡培养，开始诱导表达。每24小时向诱导表达的发酵液中补加终浓度为1%（v/v）的甲醇。

七.本发明的基因突变型重组蛋白酶K的制备方法（工业规模）

从挑取的转化子中得到基因突变型重组蛋白酶K表达量最高的3个菌株。摇瓶培养三株工程菌株，离心收获发酵上清液进行酶活、表达产量、消化BSA等试验，进一步选取一株最好菌株进行中试放大试验。在30升发酵罐水平进行基因工程菌株最佳培养条件探索，包括培养基配方、溶氧量、诱导时间和诱导剂甲醇的用量等。

根据本发明一个优选的实施方式，所述中试放大实验可在如下条件下进行：采用与摇瓶发酵中相同的培养基，甲醇诱导时间为48~168小时，溶氧量为20%~40%，诱导剂甲醇的用量为0.5%~3%（v/v）。

将30升发酵罐得到的技术方案，移植到2吨罐生产规模试验，完全复制中试发酵条件，连续发酵培养48~168小时，随时在线监控各项发酵指标和电泳测定蛋白表达水平。

根据本发明一个最为优选的实施方式，甲醇诱导时间为72小时。

下罐离心分离菌体和发酵液，当所述基因突变型重组蛋白酶K（分泌到培养基中的蛋白酶）处在存在于发酵液上清中的状态时，可被使用；也可通过浓缩所述发酵液上清使用所述蛋白酶。可纯化或部分纯化所述基因突变型重组蛋白酶K（分泌到培养基中的蛋白酶）。

利用蛋白纯化的一般方法，可实现纯化或部分纯化。例如，可以使用包括色谱（如离子交换或凝胶过滤）、硫酸铵盐析或有机溶剂沉析技术。还可通过冻干、超滤膜和有机溶剂沉析等浓缩所述纯化后的酶。

根据本发明一个优选的实施方式，利用在本发明基因突变型重组蛋白酶K的C端添加的六聚组氨酸标签，发酵液首先经过离心分离，上清液经过金属离子螯合亲和层析纯化，然后再经过弱阳离子交换层析纯化，再冻干成为成品酶，避免了传统纯化方法中采用超滤-阳离子柱-超滤-阴离子柱进行纯化时蛋白在超滤时大部分沉淀出来而导致收率降低的缺陷，从而使得综合收率相比现有技术提高了80%。

实施例

借助于下述实施例可更好地理解本发明，这些实施例仅用于举例说明本发明，不应被解释为对本发明的限制。

此外，所有的基因操作可按Molecular Cloning（Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)）所记载的进行。

实施例1蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK和pPIC9K-mutProK的构建

将野生型蛋白酶K的编码序列（SEQ ID NO.3）替换为毕赤酵母偏爱密码子组成的DNA序列，在其5’端添加SnaB I酶切位点TACGTA，3’端顺次添加六聚组氨酸标签CACCATCACCACCATCAC（SEQ ID NO.4）、终止密码子TAA及NotI酶切位点GCGGCCGC，利用化学方法合成所得的序列（SEQ ID NO.5）。将5’端添加的SnaB I酶切位点TACGTA替换为EcoR I酶切位点GAATTC，并进一步引入相应突变后（如图1所示），利用化学方法合成所得的序列（SEQ ID NO.6-9）（加拿大基因合成技术服务公司BioBasic Inc.）。上述化学合成的序列均已克隆至pUC57质粒中（加拿大基因合成技术服务公司BioBasic Inc.）。

扩增pUC57/ProK质粒和pUC57/mutProK质粒，分别用限制性内切酶SnaB I、Not I和EcoR I、Not I将ProK和mutProK编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体（美国Invitrogen公司）连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，分别用限制性内切酶SnaB I、Not I或EcoR I、Not I鉴定质粒。

通过上述方法，将编码野生型蛋白酶K和本发明的基因突变型重组蛋白酶K的DNA片段亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中（如图2所示），从而构建出野生型蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK及本发明的基因突变型重组蛋白酶K表达载体pPIC9K-mutProK：pPIC9K-mutProK6（Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N）、pPIC9K-mutProK7-1（S123A、Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N）、pPIC9K-mutProK7-2（Y151A、L180I、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N）及pPIC9K-mutProK8（S123A、Y151A、L180I、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N）（如图1所示）。

测序结果表明，目标片段均正确***上述表达载体中。实施例2蛋白酶K表达载体pPIC9K-ProK和pPIC9K-mutProK的转化

利用限制性内切酶Sal I酶切实施例1中所构建的重组质粒，使之线性化，然后用TE缓冲液（pH 8.0）溶解至1μg/μL的浓度，取20μL溶解的质粒与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯（两极间隙0.1cm）中，冰浴5min。采用电击转化的方法，利用电转化仪内置的毕赤酵母转化参数进行电击，将上述表达载体转化到GS115酵母感受态细胞中。

电击完毕后，迅速向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，轻轻混匀，转至1.5mL EP管中。将菌体悬液涂布于MD平板（13.4g/L酵母基础氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，1.5%琼脂）上，每500μL涂布一块平板。将平板置于30℃环境培养，直至出现单个菌落，得到GS115/pPIC9K-ProK和GS115/pPIC9K-mutProK。

实施例3高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-ProK和GS115/pPIC9K-mutProK的筛选

分别配制四个G418浓度梯度（0.75mg/mL、1mg/mL、1.75mg/mL、2.0mg/mL）的YPD筛选平板（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，1.5%琼脂）。对于在实施例2中进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取70个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号。每个克隆均做4个梯度的筛选。

pPIC9K表达载体能够赋予毕赤酵母遗传霉素抗性，其抗性水平主要依赖于整合的kan基因的拷贝数。单拷贝的pPIC9K整合到毕赤酵母基因组后，可赋予毕赤酵母约0.25mg/mL的遗传霉素抗性水平。由于kan基因与表达盒（pAOX1及目的基因）之间存在遗传连锁，因而可根据遗传霉素的抗性水平来大致推断该克隆所包含的目标蛋白编码基因拷贝数。

通过观察上述筛选平板，初步判定GS115/pPIC9K-ProK和GS115/pPIC9K-mutProK酵母克隆是否含有高拷贝数的目标蛋白编码基因。筛选平板中G418的含量越高，且酵母菌落生长外形越大，表明该酵母单克隆中含有较多目标蛋白基因的拷贝，能够耐受较高浓度的G418。

同时，对上述单克隆进行PCR鉴定。引物为5'AOX1（SEQ ID NO.10）、3'AOX1（SEQ ID NO.11）。

5'AOX1：GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3'AOX1：GCAAATGGCATTCTGACATCC

PCR体系（20μL）：

PCR程序：

94℃5min；

94℃30s，55℃1min，72℃2min 15s，30个循环；

72℃6min。

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。用Sal I线性化质粒转化GS115后，大多在HIS4位点上发生重组，大多数转化子是Mut⁺表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生Mut^S转化子。因此，理论上，若目的片段***成功且表型为Mut⁺，应有2200bp左右、1632bp左右的两条条带；若只有1632bp一条条带，则表型可能为Mut^S。

PCR结果显示可以扩增出2200bp左右的条带，表明目的片段均***成功，且表型为Mut⁺。

实施例4基因突变型重组蛋白酶K在酵母细胞中的表达及检测（实验室规模）

将实施例3中筛选得到的高拷贝数和Mut⁺表型的GS115/pPIC9K-ProK和GS115/pPIC9K-mutProK的酵母单菌落接种至20mL YPD培养基（酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L）中，30℃，250rpm培养24h。1500g离心收集菌体。用10mL MM培养基（13.4g/LYNB，4×10^-4g/L生物素，5mL/L甲醇）重悬菌体。随后在30℃，250rpm下摇瓶（2L）诱导表达。每4小时从发酵液中取样以备检测，并向诱导表达的发酵液中补加终浓度为1%（v/v）的甲醇。连续5天，共培养120小时。

进而，利用30升发酵罐进行中试放大试验，参考美国Invitrogen公司的毕赤酵母培养方案（www.invitrogen.com），采用与摇瓶发酵中相同的培养基，将甲醇诱导时间设定为120小时，溶氧量控制在30%，诱导剂甲醇的用量为1%（v/v），每4小时从发酵液中取样以备检测。

培养后，离心培养基，从而得到含有上述基因突变型重组蛋白酶K的发酵液上清，并置于-70℃保存。

利用SDS-PAGE、Western印迹法及Native-PAGE检测本发明的基因突变型重组蛋白酶K在酵母细胞中的表达。

1.SDS-PAGE检测

依照如下实验方案进行SDS-PAGE检测：

1.1制备SDS-PAGE凝胶：

1.1.1分离胶的制备：

在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。

1.1.2浓缩胶的制备：

在小烧杯中依次加入所需溶液成分，灌入双层玻璃板间已凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。

1.2将GS115/pPIC9K-mutProK8的培养基上清由-70℃取出，冰上融化后以沸水浴处理10min。12000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的样品孔道中，上样量为20μL。同时加入蛋白质分子量标准（Unstained Protein MolecularWeight Marker，Fermentas）。

1.3200V恒压电泳1.5h。

1.4卸下凝胶。按下表所示配制染色液和脱色液，进行考马斯亮蓝染色，以观察样品中的目的蛋白条带。

考马斯亮蓝染色液：脱色液：

结果如图3所示，培养3.5小时即可在发酵液上清（摇瓶发酵）中观察到明显的目的蛋白条带。其中，各泳道中的样品如下：

第1道：蛋白质分子量标准；

第2道：诱导表达51.5小时；

第3道：诱导表达47.5小时；

第4道：诱导表达31.5小时；

第5道：诱导表达27.5小时；

第6道：诱导表达23.5小时；

第7道：诱导表达7.5小时；

第8道：诱导表达3.5小时；

第9道：诱导前的对照。

其中，蛋白质分子量标准（Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas）的7条蛋白条带分别表示116 kD、66.2 kD、45 kD、35 kD、25 kD、18.4 kD及14.4 kD的蛋白大小。

2.Western印迹

（1）转印：将电泳后的胶取出，浸入转移缓冲液后，在摇床上缓慢摇30min；裁取硝酸纤维素膜，浸入转移缓冲液至少5min；用转移缓冲液润湿一张滤纸，铺于转印仪的底层电极板上，将膜铺于滤纸上，勿留气泡，将凝胶贴于膜上，不留气泡；润湿另一张滤纸，盖在凝胶上面，用玻璃试管赶去气泡；盖上顶层电极板，接通正负极电源，转膜50V、4℃过夜。

（2）杂交：转膜后，取出转印膜，室温，25mL TBS洗膜5min；转印膜浸入封闭25mL缓冲液，室温孵育1h；取出转印膜用TBST洗三次，每次5min，每次15mL；膜与一抗稀释液10mL杂交，4℃震荡过夜；取出转印膜用TBST洗三次，每次5min，每次15mL；与二抗稀释液孵育10mL杂交，室温震荡1h；取出转印膜用TBST洗三次，每次5min，每次15mL；倒掉洗膜液，将膜夹于吸水纸中间吸去多余的液体，铺于玻璃板上；用保鲜膜包好膜，勿留气泡，蛋白侧向上，固定于片夹内准备曝光。

（3）洗片：裁好底片，压片，曝光1-3min；显影3min，水中漂洗几次，定影10~15min，清水冲洗；根据显影效果确定曝光时间。

结果如图4所示，可以观察到明显的蛋白表达。其中，取诱导后72小时的摇瓶发酵上清液及30L发酵上清液进行分析。除蛋白质分子量标准（5μL）外，各泳道样品均上样20μL，各泳道中的样品如下：

第1道：摇瓶发酵上清液，浓缩20倍；

第2道：摇瓶发酵上清液，浓缩10倍；

第3道：摇瓶发酵上清液，浓缩5倍；

第4道：摇瓶发酵上清液；

第5道：30L发酵上清液；

第6道：30L发酵上清液，浓缩5倍；

第7道：30L发酵上清液；

第8道：蛋白质分子量标准。

其中，蛋白质分子量标准（Precision Plus Protein Dual Color Standards,Bio-Rad）的10条蛋白条带分别表示250kD、150kD、100kD、75kD、50kD、37kD、25kD、20kD、15kD、10kD的蛋白大小。

利用GS115/mutProK6、GS115/mutProK7-1及GS115/mutProK7-2得到的结果与GS115/mutProK8类似（数据未示出）。

由此可见，本发明的基因突变型重组蛋白酶K能够在酵母细胞中有效表达。

3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）

3.1实验原理：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（碱性蛋白活性电泳）是本领域技术人员所熟知的蛋白分析中使用的一种常规方法。该方法利用低pH凝胶***分离碱性蛋白，依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用而完成。

3.2仪器、试剂：

3.2.1仪器：

电泳仪、离心机、pH计等。

3.2.2试剂与溶液：

30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺（Acr）29g，N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）1g，混匀后加蒸馏水20mL，37℃溶解，定容至100mL，棕色瓶中4℃保存。

4×分离胶缓冲液：称取1.35g KOH，溶于80mL水中，用冰乙酸调节pH＝4.3，加水定容至100mL，于4℃保存。

8×堆积胶缓冲液：称取2.7g KOH，溶于80mL水中，用冰乙酸调节pH＝6.8，加水定容至100mL，于4℃保存。

1×电泳缓冲液：称取L-丙氨酸31.185g，加适量水溶解，用冰乙酸调节pH＝4.3~4.5，加水定容至1000mL，于4℃保存。

5×上样缓冲液：2.5mL 8×分离胶缓冲液，3.625mL甘油，加水定容至10mL，甲基绿适量，-20℃保存。

10%过硫酸铵溶液：分析纯过硫酸铵1g，加水溶解，定容至10mL，于4℃保存。（过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制或配好后放在小离心管中，-20℃保存，用时取出一小管使用）。

TEMED（N,N,N,N－四甲基乙二胺）溶液：试剂原液取少量，置于棕色小瓶中，于4℃保存。

考马斯亮兰R-250染色液：考马斯亮兰（Coomassie blue R-250）0.5g，200mL脱色液。

脱色液：乙醇450mL，冰醋酸100mL，水450mL。

50mmol/L HAc-NaAc缓冲液（pH＝4.0）（稀释样品用）。

3.3操作方法：

3.3.1制板：将玻璃板洗净，按要求将玻璃板固定在塑料的模具上。

配制15%分离胶（下层胶）10mL，配方如下：

溶液成分	添加量（mL）
		蒸馏水	-
30%丙烯酰胺溶液	5.05
		50%甘油	2.27
4×分离胶缓冲液	2.54
		8×堆积胶缓冲液	-
10%过硫酸铵溶液	0.121
		TEMED溶液	0.015
总体积	10

将配方中的组分加入到50mL烧杯中，混合均匀，用1mL移液枪，沿玻璃板缓缓的加入到胶片槽内，每个板内加5.0mL。分离胶加完后，用洗瓶轻轻的在胶面上加水，使之水封。室温放置约30min，待胶自然凝聚后，慢慢将水倾去，用滤纸吸干水分。

配制5%堆积胶（上层胶）3mL、5mL，配方如下：

溶液成分	添加量（mL）	添加量（mL）
			蒸馏水	2.07	3.45
30%丙烯酰胺溶液	0.498	0.83
			50%甘油	-	-
4×分离胶缓冲液	-	-
			8×堆积胶缓冲液	0.378	0.63
10%过硫酸铵溶液	0.03	0.05
			TEMED溶液	0.003	0.005
总体积（mL）	3	5

将配方中的组分加入到50mL烧杯中，迅速混合均匀，迅速沿着玻璃板缓缓加入到分离胶片上，加满为止。将梳子轻轻***上层胶中。待胶凝固后，将模具放入水中，慢慢拨出梳子。

3.3.2样品处理：

取所得到的发酵液2mL，10000r/min离心1.5min。用枪头吸取80μL离心后的样品上清于小离心管中，加入20μL5×上样缓冲液，混合均匀。

3.3.3上样：

将装置放入电泳槽中，在电泳槽外加入1×电泳缓冲液，在两个玻璃夹板中间槽内也注满此液（以浸没胶条上样孔为准）。用枪头小心将20μL处理后的样品加入到上样孔中。

3.3.4电泳：

将电泳仪的接线，红色接负极，黑色接正极（碱性蛋白用反向电流），连接电源，开机。调节输出电压至180V。当显示电流为0时，电泳样品行至凝胶最底部为止。

3.3.5染色：

用考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，室温下，摇床上振荡染色。

3.3.6脱色：

将染色液倒出，用蒸馏水洗去多余染色液，加入脱色液，脱色至样品条带显示清晰。

结果参见图5。其中，对照ProK为Merck公司的商品化蛋白酶K（原核细胞表达的野生型蛋白酶K）。可见，本发明的基因突变型重组蛋白酶K能够在酵母细胞中有效表达。

实施例5基因突变型重组蛋白酶K活性的检测

利用实施例4中所得到的摇瓶培养发酵液上清，用Bradford法测定蛋白质浓度，用PBS将发酵液上清的蛋白浓度调整到0.97mg/mL。

反应底物为盐酸胍变性的BSA：将5mg BSA溶于6M盐酸胍、50mM Tris-Cl（pH 8.0）、5mM DTT，终体积为1mL。95℃水浴20min；降至室温后，加入50mM Tris-Cl（pH 7.5）及5mM CaCl₂，使盐酸胍的终浓度降至2M以下。

反应温度：55℃；反应体系（100μL）如下表所示：

样品	3	4	5	6	7	8	10
								BSA（μL）	90	90	70	70	50	50	100
mutProK8（μL）	10	10	30	30	50	50	0
								反应时间	2h	过夜	2h	过夜	2h	过夜	2h

反应结束后加入25μL5×上样缓冲液，上样30μL，100V电泳90min。

样品1：100μL mutProK8发酵上清加25μL 5×上样缓冲液，上样20μL。

样品2：100μL经纯化浓缩的mutProK8加25μL 5×上样缓冲液，上样20μL。

样品9：10μL未变性BSA加2.5μL 5×上样缓冲液，上样2μL。

如图6A所示，加入本发明的基因突变型重组蛋白酶K后，BSA均被完全降解。仅含对照BSA和仅含mutProK8的样品未降解。

此外，如图6B所示，仅0.01μgmutProK8就能完全降解16μgBSA，表明本发明所得到的基因突变型重组蛋白酶K具有出色的活性。其中，各泳道中样品如下：

第1道：蛋白质分子量标准；

第2道：BSA 16μg，野生型蛋白酶K；

第3道：BSA 16μg，0.01μg mutProK8；

第4道：BSA 16μg，0.1μg mutProK8；

第5道：BSA 16μg，1.0μgmutProK8。

其中，分子量标准（Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas）的7条蛋白条带分别表示116kD、66.2kD、45kD、35kD、25kD、18.4kD及14.4kD的蛋白大小。

mutProK6、mutProK7-1及mutProK7-2得到的结果与mutProK8类似（数据未示出）。

上述结果初步表明本发明的基因突变型重组蛋白酶K粗制品具有明显的蛋白酶活性。

实施例6基因突变型重组蛋白酶K的比活性的定量检测

通过如下方法检测利用实施例4中的实验方案得到的本发明的基因突变型重组蛋白酶K的酶活性：

反应程序：

用50mM磷酸钾溶液配制0.65%（w/v）干酪素溶液，缓慢加热直至形成单一均匀的分散体，在37℃下用1M HCl溶液或NaOH溶液调节pH至7.5。配制含10mM NaAc和5mM Ca(Ac)₂的溶液，在37℃下用0.1M HCl或NaOH调节pH至7.5。用冷却至室温的含10mM NaAc和5mM Ca(Ac)₂的溶液配制浓度为0.1~0.2U/mL的蛋白酶K（野生型蛋白酶K（ProK）或本发明的基因突变型重组蛋白酶K（mutProK））溶液，此溶液为用前配制。

按照下列顺序依次加入各试剂（mL）：

37℃孵育30min并间歇地手动混匀，用50号滤纸过滤并收集澄清液进行下一步实验。

标准曲线制作及比色反应：

1.标准曲线：

将10mL福林酚试剂用水稀释至40mL，配制0.5N F-C试剂。缓慢加热直至酪氨酸溶解并冷却至室温，配制1.1mM L-酪氨酸标准品溶液。

按照下列顺序依次加入各试剂（mL）：

2.样品测定：

在4个小瓶中，分别按照下列顺序依次加入各试剂（mL）：

37℃孵育并间歇地手动混匀，30min后取出小瓶冷却至室温。如果溶液呈现混浊状，用0.45μm滤膜过滤后有利于吸光度值测定。将反应液转移至玻璃容器中，用分光光度计在660nm处测定Std 1~4、Std空白、样品及对照的吸光度值。结果计算：

1.标准曲线：

△_660nm Std＝A_660nm Std－A_660nm Std空白

用△_660nm Std和L-酪氨酸的量（μmol）绘制标准曲线图。

所得标准曲线如图7所示。

2.样品测定：

△_660nm样品＝A_660nm试样－A_660nm空白

利用标准曲线计算出释放的L-酪氨酸的量（μmol）。

酶活性（U/mL）＝（释放的L-酪氨酸的量（μmol））×11/（1×10×2）。

其中，11＝反应终止时的总体积（mL）

10＝反应时间（min）

1＝反应时酶试剂体积（mL）

2＝比色时所用反应液体积（mL）

U/mg固体＝（U/mL酶）/（mg固体/mL酶）

U/mg蛋白＝（U/mL酶）/（mg蛋白/mL酶）

酶活性定义

1个酶活性单位定义为，在pH 7.5，37℃条件下，每分钟从干酪素中分解出1.0μmol（181μg）的L-酪氨酸。（福林酚法进行比色）

最终试剂浓度

在6mL的反应体系中，试剂终浓度为：42mM磷酸钾，0.54%（w/v）干酪素，1.7mM NaAc，0.8mM Ca(Ac)₂和0.1~0.2U/mL的蛋白酶K溶液。

结果如下表所示：

	mutProK6	mutProK7-1	mutProK7-2	mutProK8	ProK
						活性（U/mg）	38.5	45.0	43.5	66.5	31.0

可见，本发明制备得到的基因突变型重组蛋白酶K可显示出明显优于天然蛋白酶K的酶活性，其中，八个关键位点全部突变的mutProK8显示出天然蛋白酶K酶活性2倍以上的出色酶活性；进而，相比于在mutProK6的基础上进一步将第123位的S突变为A（mutProK7-1）或进一步将第180位的L突变为I（mutProK7-2）的重组蛋白酶K的酶活性而言，同时将这两个关键位点进行突变的mutProK8令人惊讶地显示出了大幅提高的酶活性（66.5U/mg）。

实施例7基因突变型重组蛋白酶K的工业化大规模生产及纯化

从挑取的转化子中得到基因突变型重组蛋白酶K表达量最高的3个菌株。利用如实施例4中所述的实验方案，摇瓶培养三株工程菌株，从发酵液中纯化蛋白酶K并进行酶活、表达产量、消化BSA等试验，进一步选取一株最好菌株进行中试放大试验。

在30升发酵罐水平进行基因工程菌株最佳培养条件探索，参考美国Invitrogen公司的毕赤酵母培养方案（www.invitrogen.com），采用与摇瓶发酵中相同的培养基，甲醇诱导时间为120小时，溶氧量控制在30%，诱导剂甲醇的用量为1%（v/v），诱导后每8小时取样，电泳分析蛋白酶K表达量。

将30升发酵罐得到的技术方案，移植到2吨罐生产规模试验，完全复制中试发酵条件，连续发酵培养72小时，随时在线监控各项发酵指标和电泳测定蛋白表达水平。下罐离心分离菌体和发酵液。

取诱导前的mutProK8的发酵液上清作为对照，分别取诱导后8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h的发酵液上清样品进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图8所示。其中，各泳道中样品如下：

第1道：诱导前对照；

第2道：诱导后8小时；

第3道：诱导后16小时；

第4道：诱导后24小时；

第5道：诱导后32小时；

第6道：诱导后40小时；

第7道：诱导后48小时；

第8道：诱导后56小时；

第9道：诱导后64小时；

第10道：诱导后72小时。

可见，利用该工业化大规模生产方式，可有效提高本发明的基因突变型重组蛋白酶K的产率（高于1.3g/L发酵液）。该产率优于目前现有的蛋白酶K工业生产方法的产率（0.3-0.5g/L发酵液），从而使得后期纯化、冻干的高收率成为可能，为规模化工业生产提供了条件。

利用在重组蛋白酶K的C端添加的六聚组氨酸标签，极大减少了非特异性结合到纯化柱中的无关杂蛋白和核酸以及其它非特异性结合分子，发酵液经过10,000rpm高速离心分离、金属螯合柱层析和弱阳离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色处理和冻干后成为成品酶，避免了传统纯化方法中采用超滤-阳离子柱-超滤-阴离子柱进行纯化时蛋白在超滤时大部分沉淀出来而导致收率降低的缺陷，纯化后的收率高于500mg/L初始发酵液，从而使得综合收率相比现有技术提高了80%。

利用SDS-PAGE和非变性PAGE检测经上述工艺纯化冻干后的蛋白酶K的纯度。结果如图9所示。可以看出，纯化冻干后的重组蛋白酶K具有极高的纯度（99%）。

实施例8基因突变型重组蛋白酶K的稳定性

对以溶液形式存放于－20℃的mutProK8和以冻干粉形式存放于4℃的mutProK8的酶活稳定性进行了检测。

结果如图10所示。可以看出，冻干粉的酶活力在一年内基本保持不变，溶液形式的mutProK8在一年后也保留了大约98.5%的酶活，表明利用本发明的方法制备的基因突变型重组蛋白酶K具有极高的稳定性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而非限制，尽管为了说明的目的公开了本发明的优选实施方式，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行各种修改、添加或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

工业实用性

本发明的基因突变型重组蛋白酶K应用基因工程技术大量生产生物活性物质，可以克服天然产品产量低、费用高的缺陷。结合蛋白质工程技术，改造蛋白质的分子结构，得到功能更加强大的蛋白酶产品，并降低造价，这些新技术在工业用酶制剂中具有广泛的用途。

Claims

1.基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于：将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N。

2.如权利要求1所述的基因突变型重组蛋白酶K，其中，所述基因突变型重组蛋白酶K还具有下述任意一种以上的突变：

（1）第123位的S突变为A；

（2）第180位的L突变为I。

3.如权利要求1或2所述的基因突变型重组蛋白酶K，其中，所述基因突变型重组蛋白酶K的C端还具有六聚组氨酸标签。

4.编码如权利要求1-3中任一项所述的基因突变型重组蛋白酶K的DNA。

5.如权利要求4所述的DNA，其中，所述DNA为SEQ ID NO.6-9所表示的核苷酸序列的全部或部分，所述部分至少具有SEQ ID NO.6-9第7-1113位的核苷酸序列。

6.包含如权利要求4或5所述的DNA的表达载体，其中，所述表达载体优选为pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPIC9K。

7.导入权利要求6所述的表达载体的转化细胞，其特征在于，所述转化细胞为毕赤酵母（Pichia）细胞、假丝酵母（Candida）细胞、多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）细胞、球拟酵母（Torulopsis）细胞、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）细胞和克鲁维酵母（Kluyveromyces）细胞，其中，所述转化细胞优选为毕赤酵母细胞。

8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含选自于如下物质中的一种或多种：权利要求1-3任一项所述的基因突变型重组蛋白酶K；权利要求4或5所述的DNA；权利要求6所述的表达载体；及权利要求7所述的转化细胞。

9.制备如权利要求1-3任一项所述的基因突变型重组蛋白酶K的方法，所述方法包括如下步骤：在培养基中培养如权利要求7所述的转化细胞；以及收集所述培养基中的所述基因突变型重组蛋白酶K。

10.如权利要求9所述的方法，该方法进一步包括所述基因突变型重组蛋白酶K的纯化工艺过程，所述纯化工艺过程包括离心分离、层析分离、脱色处理和冻干，其中，所述层析分离优选为利用组氨酸标签进行的金属离子螯合亲和层析。