CN114540355A - Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 - Google Patents

Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114540355A
CN114540355A CN202210171062.3A CN202210171062A CN114540355A CN 114540355 A CN114540355 A CN 114540355A CN 202210171062 A CN202210171062 A CN 202210171062A CN 114540355 A CN114540355 A CN 114540355A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
hhex
gene
knockout
generation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210171062.3A
Other languages
English (en)
Inventor
方美英
雒亚彪
薛明明
产舒恒
肖莲梅
许桥
汤启国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202210171062.3A priority Critical patent/CN114540355A/zh
Publication of CN114540355A publication Critical patent/CN114540355A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法，采用本发明所述方法构建得到的HHEX基因敲除小鼠模型，可用于探究HHEX基因在小鼠软骨发育中的重要功能和分子机制。所述模型小鼠是敲除HHEX基因中第2号和第3号外显子，通过打靶载体的构建和显微注射，构建F0代小鼠，F0小鼠与组织特异性Cre工具鼠杂交获得F1代敲除杂合子，最终F1代杂合子近交获得敲除纯合子小鼠模型。本发明对于HHEX基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，对完善软骨发育调控网络具有重大意义。

Description

HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
技术领域
本发明属于遗传学和生物技术领域，涉及HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型，以及该基因敲除小鼠模型的构建方法。
背景技术
体长性状是衡量猪体型最常用的指标之一。在家畜中，体长性状与动物的产肉量息息相关，它可作为改善家畜生产性能的重要指标，具有重要的经济价值。而体长与脊椎骨的发育直接相关，脊椎骨由软骨内固化发育而成，其长度直接由软骨的发育所决定。因此，挖掘调控软骨发育的重要候选基因并鉴定其功能，对于解析体长发育的分子机制，阐明体长发育的分子调控网络对畜禽分子育种和人类软骨发育疾病的治疗具有重要意义。
HHEX(Hematopoietically expressed homeobox protein，造血表达同源框蛋白)是一种含DNA结合同源域的分歧同源蛋白类转录因子。研究显示，HHEX是一种在造血细胞、血管***、肝脏、甲状腺、心脏、胰腺和皮肤发育过程中，通过调控细胞的增殖和分化而形成正常形态的关键转录因子。近年来，随着软骨发育机理研究的逐步深入，HHEX在软骨细胞中的作用正在逐步挖掘。
鉴于全身性敲除小鼠模型的研究不能用于特定细胞或特定组织中HHEX的作用，因此本发明采用CRISPR/Cas9技术通过构建带有loxP位点的小鼠，再与软骨组织特异性Cre工具鼠杂交后特异性敲除HHEX基因第2号和3号外显子，从而实现HHEX软骨组织特异性敲除，用于研究HHEX基因在软骨和骨伸长发育中的重要作用和分子机制。
发明内容
本发明的目的是提供一种敲除HHEX基因的软骨组织特异性小鼠模型，通过敲除第2号和第3号外显子，实现HHEX转录本编码序列缺失，从而达到HHEX基因敲除，该模型可用于HHEX软骨组织中功能和作用机制研究。
HHEX基因(NCBI reference sequence：NC_000085.7)位于小鼠第19号染色体，总大小为5891bp，目前共鉴定出4个外显子，1个转录本，转录本号为NM_008245.3(编码271个氨基酸)。
本发明第一方面提供HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，小鼠动物模型打靶载体构建策略如图1所示，通过以下方法获得：
(1))基于CRISPR/Cas9技术，根据HHEX基因信息确定C57BL/6N小鼠HHEX基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2；
具体地，gRNA1和gRNA2的敲除位点依次在小鼠HHEX基因的第一和第三内含子上；用以敲除小鼠HHEX基因的第2号和第3号外显子；所述gRNA1和gRNA2的序列分别为：
gRNA1：CTCACCGCTACAGGGATTTGGGG(SEQ ID NO.1)；
gRNA2：CACCCATAATAAAACCAGGCAGG(SEQ ID NO.2)。
(2)扩增C57BL/6N小鼠HHEX基因的同源臂和cKO区域，构建含有loxP位点的打靶载体；打靶载体包括：loxP序列、靶向HHEX第一内含子的左同源臂、靶向HHEX第三内含子的右同源臂和包含HHEX第2号与第3号外显子条件性敲除区域；
具体地，分别在HHEX基因第一内含子和第三内含子各取一段序列作为5’同源臂和3’同源臂，通过PCR扩增同源臂和cKO区域；其中5’同源臂与3’同源臂和cKO区域的克隆分别以BAC clone RP24-78O9和RP23-223K4为模板使用高保真酶通过PCR获得；5’同源臂长度为1617bp，3’同源臂长度为1559bp，cKO区域长度为1583bp。
使用高保真PCR扩增酶扩增5’同源臂、3’同源臂以及cKO区域，采用in-fusion方法***骨架载体中，构建含有loxP位点的打靶载体。
(3)将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和线性化的打靶载体显微注射入受精卵中，获得F0代小鼠；
具体地，回收线性化的打靶载体通过NotI酶切HHEX基因敲除打靶载体获得，所用受精***来源于C57BL/6N系小鼠。
(4)将(3)中性成熟的阳性F0代小鼠与软骨组织特异性表达的Cre工具鼠进行杂交繁殖一代，即可获得F1代HHEX基因组织特异性敲除杂合子小鼠；
具体地，所用的组织特异性表达Cre工具鼠，重组酶Cre基因由COL2A1基因启动子在软骨组织中特异性启动表达；
阳性克隆小鼠的检测方法包括，提取F0代小鼠尾部DNA，通过PCR对阳性克隆进行鉴定，进一步通过Southern blot鉴定和PCR鉴定是否为基因编辑杂合小鼠；Southern杂交所用的限制性内切酶为Bsu36I和EcoNI，条带大小分别为野生型8.92kb与突变型5.93kb和野生型5.95kb与4.90kb；
阳性克隆小鼠鉴定所用引物序列和产物大小为：
鉴定左loxP位点的引物:
F1(SEQ ID No.9):5’-CAGAATTATTAAGAGCCGCCTCCA-3’，
R1(SEQ ID No.10):5’-CTAGCAGAAACCCAAGGAAACCA-3’，
阳性克隆产物大小为283bp，野生型为211bp；
鉴定右loxP位点的引物：
F2(SEQ ID No.18):5’-CTATATCCATTATGCCAGGGCTTC-3’，
R2(SEQ ID No.19):5’-TTTTAAACAGCTGGCAGAGGATG-3’，
阳性克隆产物大小为376bp，野生型为312bp；
将中性成熟的阳性F0代小鼠与Col2a1-CreERT工具鼠进行杂交获得F1代小鼠，通过上述阳性克隆小鼠鉴定引物，采用PCR扩增验证小鼠基因型。
(5)将(4)获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为HHEX基因软骨组织特异性敲除小鼠动物模型。
根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述的构建方法得到的HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型在研究软骨发育机制中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所述模型小鼠通过特异性敲除HHEX基因第2号和第3号外显子，使小鼠HHEX转录本失去功能，从而实现了小鼠软骨组织中HHEX的功能确实，该模型的制备有利于阐明HHEX基因在小鼠软骨组织发育中的重要调控作用，此外，在本发明的基础上，通过与不同cre工具鼠的杂交，可以实现小鼠不同组织HHEX特异性敲除，有利于解析HHEX在小鼠各组织发育过程中的重要作用，具有重要的研究价值。
附图说明
图1是本发明HHEX基因敲除打靶载体构建策略示意图。
图2是本发明HHEX基因敲除打靶载体质粒图谱。
图3是本发明HHEX基因敲除打靶载体的酶切电泳图。
图4是本发明HHEX基因编辑小鼠F0代PCR产物电泳阳性鉴定结果。
图5是本发明HHEX基因编辑小鼠F0代阳性小鼠PCR产物测序鉴定结果。
图6是本发明HHEX基因编辑F0代小鼠Southern鉴定的酶切位点示意图。
图7是本发明HHEX基因编辑F0代小鼠Southern鉴定结果图。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明HHEX基因软骨组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，按照以下步骤具体实施：
1、基因敲除小鼠打靶载体的设计，具体步骤如下：
根据NCBI公布的C57BL/6N小鼠HHEX基因(NCBI reference sequence：NC_000085.7)信息，该基因共有4个外显子，其中ATG起始密码子位于外显子1，TGA终止密码子位于外显子4，选择第2号和第3号外显子为敲除区域，该区域的缺失会导致小鼠HHEX基因功能的丧失，且不会影响小鼠发挥其他生物功能。其第2号和第3号外显子编码区序列如下：
第2号外显子(SEQ ID No.16)：
GCAAGCCCTTGCTCTGGAGCCCCTTCCTCCAGCGACCTCTGCACAAAAGGAAAGGCGGTCAAGTGAGGTTCTCCAACGACCAGACCGTCGAGCTGGAGAAGAAGTTCGAGACTCAGAAATACCTCTCCCCACCCGAGAGAAAGCGTCTGGCCAAGATGTTACAGCTCAGTGAGAGACAG。
第3号外显子(SEQ ID No.17)：
GTCAAAACCTGGTTTCAGAATCGCCGAGCTAAATGGAGAAGACTGAAACAG
敲除的片段大小约为230bp。
常规的敲除选择靠前的外显子，只要发生突变即可，本发明选择第二第三外显子，优势有两点，第一点是HHEX蛋白的核心功能域由第二第三外显子所编码，第二点是，本发明发现，敲除两个外显子所造成的突变更大，对于基因敲除效果更好。
2、gRNA设计，具体步骤如下：
利用CRISPOR软件在线针对靶序列设计gRNA序列，并采用CasOFFinder检测潜在的拖靶位点，最终选择的gRNA序列如下：
gRNA1:CTCACCGCTACAGGGATTTGGGG；
gRNA2:CACCCATAATAAAACCAGGCAGG。
3、基因敲除打靶载体构建，根据条件性敲除区域，构建的条件性基因打靶载体如图2所示，序列信息如SEQ ID No.15所示。具体步骤如下：
采用来自C57BL/6N小鼠文库BAC克隆的RP24-78O9和RP23-223K4序列，通过PCR扩增获得HHEX基因的同源臂和cKO(第2号和第3号外显子)(conditional Knockout，条件性敲除)区域。采用in-fusion方法构建打靶载体，将两个loxP位点连接到cKO区域的两侧，通过PCR测序及酶切对打靶载体进行验证，酶切结果见图3，从图3中可以看出AfIII和XmnI双酶切后，载体被切为5kb、2.6kb、0.9kb和0.7kb的条带，AhdI和NcoI双酶切后，载体被切为4.3kb、2.4kb、1.9kb和0.6kb的条带，DrdI和EcoRI双酶切后，载体被切位3kb、2.4kb、1.9kb、1.5kb和0.3kb的条带，而用NotI单酶切，载体呈现9.2kb的线性条带，表明载体构大小正确，位点正确，没有突变。并利用酶切将该打靶载体质粒线性化。
4、显微注射及移植，具体步骤如下：
PMSG处理C57BL/6N雌性小鼠(6周龄，平均体重20g)，46h后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤2中的gRNA1、gRNA2(2-5pmo1/ul)，Cas9蛋白(30-100ng/uL)，以及步骤2得到的cKO区两侧含有1oxP位点的打靶载体，一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即F0代小鼠。
5、阳性克隆小鼠鉴定具体步骤如下：
提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物凝胶电泳和测序，鉴定是否为编辑鼠。
(1)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物跑胶鉴定；
剪取F0代断奶仔鼠尾部组织约0.5cm，加入100ul Mouse Tail Direct Pcr Kit试剂和5ul蛋白酶K(20mg/ml)，55度震荡水浴锅消化过夜，85度震荡消化45分钟，离心取上清放于-20度备用。
用于F0代小鼠HHEX基因PCR鉴定的特异性引物如下：
用于检测5’同源臂和3’loxP位点的引物序列如下：
P1(SEQ ID No.3):5’-ACGTCTTGTGACCTCCTCTTCG-3’；
P2(SEQ ID No.4):5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’。
条带大小为3.6kb；
用于检测3’同源臂和5’loxP位点的引物序列如下：
P3(SEQ ID No.5):5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；
P4(SEQ ID No.6):5’-CTTTGAGGATTCTCCTGGCGAT-3’。
条带大小为3.3kb；
PCR扩增体系及PCR反应程序见表1、表2。
表1 PCR体系如下：
Figure BDA0003517644170000061
表2 PCR反应程序如下：
Figure BDA0003517644170000062
PCR扩增产物电泳鉴定结果如图4所示，从图中可以看出，2、7、9和11号出现了特异性扩增片段，为HHEX基因敲除小鼠特异性扩增产物，代表gRNA1、gRNA2打靶成功；WT小鼠PCR产物没有此条带。
(2)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序鉴定；
用于鉴定3’loxP位点的测序引物序列如下：
P5(SEQ ID No.7):5’-CTAGCAGAAACCCAAGGAAACCA-3’
用于鉴定5’loxP位点的测序引物序列如下：
P6(SEQ ID No.8):5’-TCTCGCGTATTTCTTAACAAGGTCA-3’
电泳鉴定2号阳性小鼠PCR扩增产物测序结果图5所示。
采用Southern blot检测F0代小鼠基因型，鉴定示意图如图6所示。
①制备探针，通过PCR方法将Dig-dUTP渗入到新提取的DNA分子中；
其中，F0代小鼠Southern blot的探针引物如下：
5’端正向引物5’Probe forward primer(SEQ ID No.11):
5’-GCCCTTCTACATCGACGACATCTTG-3’；
5’端反向引物5’Probe reverse primer(SEQ ID No.12):
5’-AGTAGGGCGTGCGTGTAGTCGTT-3’；
3’端正向引物3’Probe forward primer(SEQ ID No.13):
5’-ACCCACAAAGAAATGTCCACACCTG-3’；
3’端反向引物3’Probe reverse primer(SEQ ID No.14):
5’-TCACTCTCCAGTCACCAAGTCTGCT-3’。
②分别采用限制酶Bsu36I和EcoNI进行酶切用于与5’和3’探针杂交。
③限制酶Bsu36I酶切杂交后预期条带大小为：野生型8.92kb和突变型5.93kb，限制酶EcoNI酶切杂交后预期条带大小为：野生型5.95kb和突变型4.90kb，电泳阳性F1代小鼠Southern blot鉴定结果如图7所示。
6、F1小鼠繁殖与鉴定，具体步骤如下：
(1)雄性嵌合体出生满8周，与8周龄母鼠Col2a1-CreERT工具鼠合笼；
(2)出生小仔放入新的笼盒，并进行编号，待1周龄左右剪小鼠脚趾送检PCR，进行一次鉴定；
(3)保留一次鉴定阳性小鼠，待2周龄左右剪鼠尾送检PCR,进行二次鉴定，经2次PCR鉴定阳性的小鼠，为正确打靶的杂合子小鼠，此部分鉴定引物如下：
P7(SEQ ID No.9):5’-CAGAATTATTAAGAGCCGCCTCCA-3’；
P8(SEQ ID No.10):5’-CTAGCAGAAACCCAAGGAAACCA-3’。
纯合HHEX基因敲除型条带大小为：283bp，杂合型条带大小为：211bp和283bp，野生型条带大小为：211bp，PCR反应体系和反应程序同第5步。
7、F1代杂合子小鼠近交获得F2代软骨组织特异性基因敲除纯合子小鼠，此部分鉴定引物及程序同第5步。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
<130> KHP201118475.9
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcaccgcta cagggatttg ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacccataat aaaaccaggc agg 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgtcttgtg acctcctctt cg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggattcgg accagtctga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgtaaacgg ccacaagttc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttgaggat tctcctggcg at 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagcagaaa cccaaggaaa cca 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctcgcgtat ttcttaacaa ggtca 25
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagaattatt aagagccgcc tcca 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctagcagaaa cccaaggaaa cca 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccttctac atcgacgaca tcttg 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtagggcgt gcgtgtagtc gtt 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acccacaaag aaatgtccac acctg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcactctcca gtcaccaagt ctgct 25
<210> 15
<211> 9172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtacggcgcg 660
ccgcgcagag cgcaaataaa tgtagcgcgg cgccgccggc cggcagctct ctgcgagggg 720
ctgcggagcg gccatgcagt tcccgcaccc ggggcccgcg gctgcgcccg ccgtgggagt 780
cccgctgtat gcgcccacgc cgctgctgca gcccgctcac ccgacgccct tctacatcga 840
cgacatcttg ggtcgcgggc ccgccgcccc cacgcccact cccacgctgc cgtcccccaa 900
ctcctccttc accagcctcg tgtcctccta ccggaccccg gtgtacgagc ccacgccggt 960
ccaccccgcc ttctcgcacc acccggccgc cgcgctggcc gccgcctacg gccccagtgg 1020
cttcggaggc cctctgtacc cgttcccgcg gacggtgaac gactacacgc acgccctact 1080
ccgccacgac cccctgggta aggcggccgg ggccgagtga gggcgtccgt gaggaaggcg 1140
ctcccggcgg gtggcagcgc gcgggaggcg gcaggggcgg acggacggga agcgcagtgg 1200
aaaagttgcg gcgagctctc ggagcgagcg gctcgcgggt gcatgcgggg ccccggtact 1260
gggaagctcg gcgactcaga ttgcttttcc tgcaccttgc agacgtcggg gcaagcgtag 1320
tcgggagaga cctggggctc ccggggaggt ggaggagggc ggccctggcc acgcgtgtcg 1380
ccccggggtg ggtgggggac tcccttagcg agcggcccgg agaagaggac gtcggggcgc 1440
cctgagcctg gcccctgcag ggcagggaga gctgcctgcc cgggcggttc ctgggctggg 1500
cttggttcaa caagcttgtg cagtgaagga gcctgaccct ttccgttcat acaggaaatc 1560
ttgagttctc gataggagta aatctggttt ctgaagctgt taagtgtttt cctggctgca 1620
tgaagcagac ccttcccccg gagtagtgca cgctgctgat tattttatcg acatcctcaa 1680
tacagacaaa ttcaggaaac actcgacgtc tgatagccag gatccgtttt tctgatattg 1740
ttcatttcct ctgtgtggga tgtgacttta tggcagctaa aataaccagt tgcttcctct 1800
ctgcctctcc cgccaccccc cacccccatc tttggaggct gttttgcacc aagtctgaag 1860
cctgacgcaa gcaaaatctc ggggggaaaa aaaaacaatg ccaactttca aaatgtttag 1920
gtgtaggtct gtggacatag ggacggacgg acggacagac gcaccaccat caatttggag 1980
aaggaaagtg cagaccccga acaaatacta agggctacac gttggcaatt tgggattttc 2040
gaggcttgtc ctcacaacat tcctaagaat aaatacgcga tggtgaccgg gttcagggcc 2100
tcagcctctg aaccagtggg gtctagagtg aataagaggg ggctccagag tttaaagtca 2160
acagtttggc agcttaactg gggacctggg agacaattaa cattttaatg aattggcatt 2220
ttaatgccag aattattaag agccgcctcc agcgctcctc tcttctcacc gctacagggc 2280
cctcggtgag gatgcatacg taaacggcca caagttcgaa taacttcgta tagcatacat 2340
tatacgaagt tatttggggt gtgagtgtta taattttgta cataaaattt gtatttaaat 2400
ttttcagcgt gcagaacatg agtgtgaccg gccgcaactc tgtaccctct ggggcaggag 2460
ggtacaacgt tttcacatag ctcgccctgg tttccttggg tttctgctag gcctgagcag 2520
aaggaagcaa attttttttt tttttttttt ttttttttga gacagaccaa caggaaacac 2580
attgacggaa atgttgccat agcccacggg gtggctttaa ctggccgccc ccgcaggccg 2640
agtgtgaaat cagaggaggc ccgggcgctc tccagccact ttggaggccc cactcgaggc 2700
ctaacacccg cgccctgtga gcgcttctgt gcgcccagca ggccttggga agtgctctca 2760
taaagagcgc accctgagtc ttttgcaaaa gttagtgcat acagaagagt cggttcggtt 2820
aaataagata aggtttaagg ccagcagggg ttcttggggg ttgaaaagat ttgtttgcat 2880
ttagccacag gtgtgctggg cgggtagtgc cgtgtcttga gtatccagag ctggtctggg 2940
tggtagaacg gctaatctga ctttgtgtgc attggtgagg agtgtggaaa catccattaa 3000
cctgagcatg tatgtgatag gaacatggtt gcgttctgga tcgtgtcact tgggaccagg 3060
tagatctggg aactgttcag agggtgccgg ggccttggtt aaccacagct cttctggccc 3120
acaggcaagc ccttgctctg gagccccttc ctccagcgac ctctgcacaa aaggaaaggc 3180
ggtcaagtga ggttctccaa cgaccagacc gtcgagctgg agaagaagtt cgagactcag 3240
aaatacctct ccccacccga gagaaagcgt ctggccaaga tgttacagct cagtgagaga 3300
caggtcagct tcccctcaca cccaaacaca ccatcaggct tccatggagc tagcggaaaa 3360
aagccactac tgtaagccac taccgcgcac tgccggcgca ttctgacccc ggcccagctg 3420
cagggcccca tagccccggc cccttctccc caggtccccc gggatttggg actttcttgc 3480
gaacctgttt tcttttctgt aggtcaaaac ctggtttcag aatcgccgag ctaaatggag 3540
aagactgaaa caggtatcga catggctctg tttctatgga aataaatgtt tgtatcatgt 3600
tatctaaatg cggagccctg ttatgggttg tatgcaaaag tcatttgaga gactatttaa 3660
cctcttcacc ttgattaaaa aagcaaatac tcctgccgaa attcaggatg agttgctcag 3720
gtgtcactaa tgctaaaagc cacctaatgc agttcctata tccattatgc cagggcttca 3780
cacactggcc agtaaacccg cctggctaat tgttttataa accccatatg ttgtttatct 3840
cattaacgca ggaaagataa agtaattgac agtaaatgac ttaagtagtt atctttggga 3900
gaaaattgtt tcttttattt acacacccat aataaaataa cttcgtatag catacattat 3960
acgaagttat gtcagactgg tccgaatcca cggtacccct caggggcagg actcaagggt 4020
aaatataaag acacaaacac ctttaagtcc tatttgcact ttttaagaaa aaagacttaa 4080
atatcaaaga gttctaaaag ttattaccca tcctctgcca gctgtttaaa atgaatatga 4140
aacccacaaa gaaatgtcca cacctgtttg gaaagtaact taaactcccg atagtctttc 4200
aatgaccttg ttaagaaata cgcgagagag gggaagggcc aagtcaccct ccagagcagc 4260
cctactgact tagagctaaa gatttgcttt tgctgtccca acctggatgt ttccagagtc 4320
atcggacaac tgctgaatgg ttcatttggc agagcttcaa ataacagtta aaatggtttg 4380
aaacaaaaca gtttagtaat gaggaaagct taatgtagat tttaaattgt attgctcatg 4440
ctttttttat atctgtatat attttaaatg ctgtcccaaa gaacattttg aaagaacaaa 4500
ataacttcct ggggcgtcat cgttcttaaa tatttgagga ttccctctct ctagccatgt 4560
acatccttag cagacttggt gactggagag tgacagtgtt tctagaaaat atttacattc 4620
atattcgacg tctacatact taaaaatcca ctggctggac ttggcttgga actagtttcc 4680
caaggacttt taaaatagtg ctttctatgt aatatggaaa aaaatatttt ttcccagaat 4740
tttttgccta gattttaagc aaattgcaaa ctctttttat caatattaat tttggttctg 4800
tgattttttt tttttgccat gattttgtaa tttggtacct atttatgtat gtgtgttctc 4860
gtaaatttac ttgagaaaac aaatggaaaa ggattcaatt gaatcatttt gcagcctctt 4920
aatttagttc atgttgttgg tctcttcttc ctcctcctcc tctcctcttc ctcctccccc 4980
ttgtccttct tttttttttt tttttttttt ttttggtttt tttgagacag ggtttctctg 5040
tgtagccctg gctgtcttgg aactcacttt gtagaccagg ctggcctcga actcagaaat 5100
cacctgcctc tgcctcccaa gtgctgggat taaaggcgtg cgccaccatg cccggcttcg 5160
tccttctctt ttttaggggg ttaggttttc gtgtaacaaa cccagccatt ttaatgattg 5220
ttcttttaaa atgctagaag accctgtttg gggtgatatc taaaagcatg agagctgcgc 5280
tgtctgaatt gaactgaggg tttttgtctt gttttgtatt tttctctcct aaacttctgc 5340
aaatcttgaa cccactggtc tgtgttaagt atataatctc tctctggtgt gacttcttcc 5400
ctcttctttc aaatggggaa acgaatcaca agtgtatctt cttaggaaaa agattttaac 5460
gaagaaaaca gttggtaaac tagactttgt aggcgtggta aaggctgaaa aaaaccaaaa 5520
ccaaaaccaa ctttgattgt tatgtctctg ctctcaccaa ctggcggccg cattctggta 5580
ccagggccca tcaagcttgc tacgtacgtc gacagcttga tatcgaattc cgaagttcct 5640
attctctaga aagtatagga acttcaggtc tgaagaggag tttacgtcca gccaagctag 5700
cttggctgca ggtcgtcgaa atctgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata 5760
gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc atgggatcgg ccattgaaca agatggattg 5820
cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 5880
acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 5940
tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 6000
tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 6060
ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 6120
gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 6180
ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 6240
atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 6300
gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc 6360
catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 6420
gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 6480
attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 6540
gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat 6600
caattctcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 6660
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6720
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 6780
ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 6840
gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctcgac tagagcttgc 6900
ggaacccttc atccacccct aggaggtatc gcgacggatg gatccaagaa ccagcccggg 6960
cggtggagct ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca 7020
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 7080
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 7140
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 7200
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 7260
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 7320
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7380
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7440
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7500
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7560
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7620
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7680
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7740
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 7800
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 7860
agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 7920
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 7980
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 8040
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 8100
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 8160
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 8220
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 8280
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 8340
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 8400
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 8460
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 8520
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 8580
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 8640
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 8700
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 8760
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 8820
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 8880
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 8940
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 9000
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 9060
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 9120
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 9172
<210> 16
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcaagccctt gctctggagc cccttcctcc agcgacctct gcacaaaagg aaaggcggtc 60
aagtgaggtt ctccaacgac cagaccgtcg agctggagaa gaagttcgag actcagaaat 120
acctctcccc acccgagaga aagcgtctgg ccaagatgtt acagctcagt gagagacag 179
<210> 17
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtcaaaacct ggtttcagaa tcgccgagct aaatggagaa gactgaaaca g 51

Claims (10)

1.HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，在所述构建方法中，gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA1的敲除位点在小鼠HHEX基因的第一内含子上；所述gRNA2的敲除位点在在小鼠HHEX基因的第三内含子上。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述gRNA1和gRNA2的序列为：
gRNA1：CTCACCGCTACAGGGATTTGGGG；
gRNA2：CACCCATAATAAAACCAGGCAGG。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法中，打靶载体包括：loxP序列、靶向HHEX第一内含子的左同源臂、靶向HHEX第三内含子的右同源臂和包含HHEX第2号与第3号外显子条件性敲除区域。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计gRNA1用于敲除小鼠HHEX基因的第2号外显子、gRNA2用于敲除小鼠HHEX基因的第3号外显子；
(2)扩增C57BL/6N小鼠HHEX基因的同源臂和cKO区域，构建含有loxP位点的打靶载体；
(3)将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和线性化的打靶载体显微注射入受精卵中，获得F0代小鼠；
(4)将(3)中性成熟的阳性F0代小鼠与软骨组织特异性表达的Cre工具鼠进行杂交繁殖一代，即可获得F1代HHEX基因组织特异性敲除杂合子小鼠；
(5)将(4)获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为HHEX基因软骨组织特异性敲除小鼠动物模型。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，打靶载体的构建包括：
(1)PCR扩增C57BL/6N小鼠HHEX基因的同源臂和cKO区域；
(2)采用in-fusion方法构建cKO区两端含有loxP位点的打靶质粒载体。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，受精***来源于C57BL/6N系小鼠。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，阳性小鼠鉴定所用引物序列和产物大小为：
(1)鉴定左loxP位点的引物:
F1:5’-CAGAATTATTAAGAGCCGCCTCCA-3’，
R1:5’-CTAGCAGAAACCCAAGGAAACCA-3’，
阳性克隆产物大小为283bp，野生型为211bp；
(2)鉴定右loxP位点的引物：
F2:5’-CTATATCCATTATGCCAGGGCTTC-3’，
R2:5’-TTTTAAACAGCTGGCAGAGGATG-3’，
阳性克隆产物大小为376bp，野生型为312bp。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所用的组织特异性表达Cre工具鼠，重组酶Cre基因由COL2A1基因启动子在软骨组织中特异性启动表达。
10.权利要求1-9任一所述的构建方法得到的HHEX软骨组织特异性敲除小鼠动物模型在研究软骨发育机制中的应用。
CN202210171062.3A 2022-02-23 2022-02-23 Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法 Pending CN114540355A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210171062.3A CN114540355A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210171062.3A CN114540355A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114540355A true CN114540355A (zh) 2022-05-27

Family

ID=81677342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210171062.3A Pending CN114540355A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540355A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114908098A (zh) * 2022-06-30 2022-08-16 上海海洋大学 斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804629A (zh) * 2019-11-15 2020-02-18 西安医学院 PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804629A (zh) * 2019-11-15 2020-02-18 西安医学院 PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MORIMOTO R等: "Homeoprotein Hex is expressed in mouse developing chondrocytes", 《J. BIOCHEM.》 *
OVCHINNIKOV DA等: "Col2a1-directed expression of Cre recombinase in differentiating chondrocytes in transgenic mice", 《GENESIS.》 *
未知: "Mus musculus strain C57BL/6J chromosome 19, GRCm39", 《GENBANK》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114908098A (zh) * 2022-06-30 2022-08-16 上海海洋大学 斑马鱼hoxb1a基因缺失突变体的制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112921054B (zh) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
CN104593413A (zh) 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法
US5286636A (en) DNA cloning vectors with in vivo excisable plasmids
CN105368732B (zh) 一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法
CN114540355A (zh) Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
CN107267538B (zh) 一种植物质体表达载体的构建方法及应用
CN110452893B (zh) 一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用
CN109234318B (zh) 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法
US6503712B1 (en) Methods and compositions for preparing a genomic library for knockout targeting vectors
CN112980799B (zh) 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用
CN113151276A (zh) 一种il-4基因缺失斑马鱼
CN110862443B (zh) 一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用
CN110117622B (zh) 一种CRISPR/Cas基因编辑***及其制备方法和应用
CN112159819B (zh) 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法
CN109777829A (zh) 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法
CN108949800B (zh) 一种高效便利定位基因***座位的丝状真菌遗传转化***及其应用
CN114317529B (zh) 一种寡核苷酸链随机拼合方法
CN114343086A (zh) 一种小黄鱼促生长饲料添加剂的制备、饲料添加和应用方法
CN107233574B (zh) Crebzf在治疗、预防和诊断代谢性疾病中的应用
KR102624832B1 (ko) 근육 특이적 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 델타(PPARδ) 과발현 형질전환 개 생산
CN110331170A (zh) 一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用
CN110790832B (zh) 一种提高小麦加工品质的方法
CN110938125B (zh) 一种提高小麦加工品质的高分子量麦谷蛋白亚基突变基因1Dx2m1的创制与应用
CN107501406A (zh) 一种重组牛β‑乳球蛋白及其制备方法和应用
KR101578431B1 (ko) 구제역 c형 euro-sa 지역형 유전형의 방어항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 그의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220527

RJ01 Rejection of invention patent application after publication