CN110804629A - PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法，通过以下方法获得：基于CRISPR/Cas9技术，将C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构；将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9酶和制备好的含有cKO区、同源臂和loxP位点打靶载体显微注射入***小鼠受精卵中获得F0代小鼠，再依次获得F1代杂合子小鼠、F2代纯合子小鼠，即得到本发明PirB基因敲除小鼠的模型。本发明对于PirB基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，特别是敲除PirB后对AD表型和病理学症状的研究具有很高的研究价值。
Description
技术领域
本发明属于遗传学和生物技术领域，具体涉及PirB基因敲除小鼠动物模型，还涉及该小鼠动物模型的构建方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经***退行性疾病。随着世界人口老龄化不断加剧，AD发病率也在逐年上升，给患者及家属带来极大的生理痛苦和经济负担。AD典型的病理学症状之一是β-淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)沉积引起的细胞外老年斑，研究发现Aβ沉积，特别是Aβ42寡聚体会导致神经元退行性病变，包括神经元轴突回缩和突触丢失等。
成对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B， PirB)，是Aβ42寡聚体的高亲和力受体，亲和力达到纳摩尔水平。PirB 广泛表达于神经元和星形胶质细胞。免疫组织化学染色结果发现， PirB在富含肌动蛋白(actin)的轴突生长锥前缘和突触蛋白(synapsin) 免疫阳性的囊泡中表达，呈点状分布。文献表明，PirB表达随年龄增加而增加，且PirB表达与轴突再生和突触可塑性负相关。PirB胞外段有6个免疫球蛋白(IgG)样结构域，其前两个IgG结构域介导了 Aβ42寡聚体和PirB的相互作用，导致丝切蛋白(cofilin)信号通路增强，引起轴突生长锥塌陷，轴突生长抑制。研究表明Aβ与PirB相互作用导致海马长时程增强(LTP)抑制，在AD转基因模型中，PirB 不仅参与成年小鼠记忆缺失，而且介导青年视皮层突触可塑性的丢失。这些研究均提示我们PirB参与突触可塑性，引起神经功能下降。因此阻断PirB通路增强突触可塑性可能是预防或改善AD的有效途径。
PirB基因(NCBI reference sequence：NM_011095.2)位于小鼠的7号染色体，总大小为8.97kb，编码841个氨基酸，目前鉴定出 15个外显子(转录本：Pirb-201ENSMUST00000078451.6)。以往文献报道了敲除PirB跨膜区(外显子10)和部分胞内段(外显子11-13) 的C57BL/6小鼠，也有文献采用基因重组的方法敲除PirB靠近跨膜区的胞外段(外显子6)，在这些小鼠动物模型中，PirB均被全身性的敲除，不能用于研究特定细胞或脑区中PirB的作用，更不利于研究PirB在阿尔茨海默病中的作用研究。因此，本发明采用CRISPR/Cas9技术建立能够进行条件敲除PirB的FloxP小鼠，将外显子10-15作为条件敲除的区域，跟特定脑组织和不同神经细胞类型的Cre小鼠杂交后，用于研究PirB条件性敲除参与AD发病的机制，并探索PirB条件性敲除改善AD症状和病理学变化的可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PirB基因敲除小鼠动物模型，该模型可以用于研究不同脑组织或不同类型神经细胞PirB基因敲除后的变化和下游机制。
本发明的另一目的在于提供上述小鼠动物模型的构建方法。
本发明所采用的第一种技术方案是：PirB基因敲除小鼠动物模型，小鼠动物模型是通过以下方法获得：
步骤1、基于CRISPR/Cas9技术，根据PirB基因信息确定 C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2， gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO 区域，采用in-fusion方法构建含有loxP位点的打靶载体；
步骤3、将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和含有loxP位点的打靶载体显微注射入***小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
步骤4、将步骤3中性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型小鼠交配繁殖一代，获得F1代杂合子小鼠；
步骤5、将步骤4获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的PirB基因敲除小鼠的模型。
本发明所采用第一种技术方案的特点还在于，
gRNA1、gRNA2的敲除位点依次为小鼠PirB基因编码区的第10 个外显子上和15个外显子上。
注射进入受精卵的gRNA1、gRNA2的浓度为2～5pmol/ul，Cas9 蛋白的浓度为30～100ng/μL。
步骤1中将得到的gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。
本发明所采用的第二种技术方案为：PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、分别获取C57BL/6J小鼠PirB基因序列的第10、15号外显子的基因序列，基于CRISPR/Cas9***构建第10号外显子的 gRNA1，gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，基于CRISPR/Cas9 ***构建第15号外显子的gRNA2，gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min 形成发夹结构；
步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO 区域，采用in-fusion方法构建cKO区两端含有loxP位点的打靶质粒载体，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切将该打靶载体质粒线性化。
步骤3、将步骤1得到的gRNA1、gRNA2、步骤2得到的线性化的含有loxP位点打靶载体和Cas9蛋白注射进入***C57BL/6J小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；
步骤4、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体；
步骤5、将步骤4中性成熟的阳性F0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，PCR扩增、测序和Southern杂交，验证小鼠基因型；
步骤6、将步骤5中F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠 PirB-/-，即为本发明构建的小鼠动物模型。
本发明所采用第二种技术方案的特点还在于，
步骤1中得到gRNA1和gRNA2后，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。
步骤5中Southern杂交所用的限制性内切酶为Bsu36I，浓度为 10000U/mL，用量0.5mL，片段大小如下：4.13kb-WT,3.56kb-PirB KO。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种采用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建PirB基因敲除小鼠的方法，本发明对于PirB基因功能的研究和在体验证提供了良好的基础，特别是通过本动物模型与不同类型Cre小鼠的杂交，再与AD模型小鼠杂交，可以研究AD不同脑区比如海马或皮层，或者不同类型的脑细胞比如神经元或胶质细胞的PirB的调节作用和机制，以及敲除PirB后对AD症状和病理学变化的潜在修复作用。
附图说明
图1为本发明PirB基因敲除小鼠的流程图；
图2为本发明F1代PirB基因敲除小鼠cKO区两端连接loxP位点的打靶质粒载体的构建图：
图3为本发明F1代PirB基因敲除鼠的基因型PCR结果鉴定电泳图；
图4为本发明F1代PirB基因敲除鼠PirB基因敲除效果的测序峰图；
图5为本发明F1代PirB基因敲除鼠进行Southern鉴定的酶切位点示意图；
图6为本发明F1代PirB基因敲除鼠进行Southern鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步阐述。
本发明PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，按照以下步骤具体实施：
步骤1、根据C57BL/6J小鼠PirB基因第10、15号外显子序列，利用Cas-Desigher软件在小鼠PirB基因(Gene Bank：NM_011095.2) 第10、15外显子分别设计gRNA靶序列，并搜索小鼠DBM-DB基因组数据库基因，采用CRISPR脱靶效应检测软件Cas-OFFinder检测潜在的脱靶位点，最终选取的两个gRNA序列如下：
gRNA1:GACCAAGTCAAGCTATCTAGAGG
gRNA2:GCAATGACCCCCTGCCTGCCAGG
将上述gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。
步骤2、采用来自C57BL/6小鼠文库BAC克隆的RP23-146B24 和RP23-264J8序列，通过PCR扩增获得PirB基因的同源臂和cKO (第10-15号外显子)(conditional Knockout，条件性敲除)区域。采用in-fusion方法构建打靶载体，将两个loxP位点连接到cKO区域的两侧，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切将该打靶载体质粒线性化。根据条件性敲除区，构建的条件性基因打靶载体如图1所示。
步骤3、PMSG处理C57BL/6雌性小鼠(6周龄，平均体重20g)， 46h后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1的gRNA1、gRNA2(2-5pmol/ul)，Cas9蛋白(30-100ng/μL)，以及步骤2得到的cKO区两侧含有loxP位点的打靶载体，一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即F0代小鼠。
Cas9蛋白购自New England Biolabs公司，货号为M0386M。
步骤4、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体。
用于F0代小鼠PirB基因PCR鉴定的特异性引物如下：
PCR Primers 1(Annealing Temperature 60.0℃):
5’arm forward primer(F1):
5’-TACAGATGCTATGGTGCACACAAC-3’
3’loxP reverse primer(R1):5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’
PCR Primers 2(Annealing Temperature 60.0℃):
3’loxP forward primer(F2):
5’-CAGAGGAGCCCAGTGTATATGC-3’
3’arm reverse primer(R2):
5’-GCTATACACCACCATTCCAAACTTTC-3’
其中Primers1对应的扩增产物大小为4.1kb，Primers2对应的扩增产物为1.4kb。
步骤5、将步骤4中鉴定为嵌合体的8周龄F0代小鼠与同品系野生型异性小鼠交配获得杂合子小鼠F1代，小鼠出生后7天进行PCR 鉴定、测序和Southern验证，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。图2为本发明F1代PirB基因敲除小鼠建立的流程图。
(1)通过PCR方法对获得的F1代小鼠进行基因型的鉴定：
(A)DNA的提取：
采用TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNAExtraction kit (Ver.5.0_CodeNo.9765)试剂盒来提取高纯度的基因组DNA。
步骤a、F1代所有小鼠剪下一段尾巴(2～5mm)，放入离心管中，加入180μLBufferGL，20μL蛋白激酶K和10μLRNase A。
步骤b、将离心管内样品于56℃孵育过夜。
步骤c、12000rpm离心2min去除杂质。
步骤d、再往离心管中加入200μLBuffer GB和200μL无水乙醇，充分混匀。
步骤e、将吸附柱放在收集管上，将步骤d中样品加到吸附柱里， 12000rpm离心2min，弃掉收集管中液体。
步骤f、在吸附柱中加入500μLBuffer WA，12000rpm离心1min。弃掉收集管中液体。
步骤g、在收集管中加入700μL Buffer WB，12000rpm离心1min。弃掉收集管中液体。
(注意：BufferWB需要与100％乙醇预混，沿管壁加入Buffer WB 冲走残余的盐。)
步骤h、重复步骤步骤g一次。
步骤i、将吸附柱放入收集管，于12000rpm离心2min。
步骤j、将吸附柱放到一个新的1.5mL的离心管，在吸附柱膜中央加入50-200μL灭菌水或者洗脱液，停留5min。(将无菌水或者洗脱液加热到65℃能够增加洗脱的得率)。
步骤k、采用Nanodrop核酸测定仪对基因组DNA定量。
(B)长链PCR反应：
长链引物：
PCR Primers 1(Annealing Temperature 60.0℃):扩增片段：4.1kb
5’arm forward primer(F1):
5’-TACAGATGCTATGGTGCACACAAC-3’
3’loxP reverse primer(R1):5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’
PCR Primers 2(Annealing Temperature 60.0℃):扩增片段：1.4kb
3’loxP forward primer(F2):
5’-CAGAGGAGCCCAGTGTATATGC-3’
3’arm reverse primer(R2):
5’-GCTATACACCACCATTCCAAACTTTC-3’
PirB基因敲除型有上述两条扩增片段，而野生型等位基因没有扩增产物。
PCR Mix：
反应条件：
(C)短链PCR反应
短链PCR反应引物如下：
Primers for pair1(Annealing Temperature 60.0℃):
Forward primer(F3):
5’-GCTACAGCAGGGAGATTCAGAGAG-3’
Reverse primer(R4):5’-TACTCAGAGGAACAGCAGCCTAG-3’
PirB基因敲除型：355bp野生型等位基因:286bp
Primers for pair2(Annealing Temperature 60.0℃):
Forward primer(F2):5’-CAGAGGAGCCCAGTGTATATGC-3’
Reverse primer(R3):
5’-CACTCAATGTAAAACCTTCCCTTCC-3’
PirB基因敲除型:296bp野生型等位基因:241bp
PCR体系：
反应条件：
PCR扩增产物电泳鉴定结果如图3所示，从图中可以看出，17、 19、22、23号为PirB基因敲除小鼠在4.1kb、1.4kb有特异性扩增产物，WT小鼠PCR产物没有这两个扩增产物。
(2)通过PCR扩增后测序鉴定小鼠基因型：
如图4所示，为17号PirB基因敲除小鼠测序峰图，PCR所用引物如下：
Sequencing Primer for PCR product 1:
5’Sequence primer(F3):
5’-GCTACAGCAGGGAGATTCAGAGAG-3’
Sequencing Primer for PCR product 2:
3’Sequence primer(R3):
5’-CACTCAATGTAAAACCTTCCCTTCC-3’
(3)采用Southern杂交检测F1代小鼠基因型：
步骤a、提取F1代小鼠尾部DNA得到新合成的DNA分子。
步骤b、制备探针，通过PCR方法将Dig-dUTP渗入到步骤a新合成的DNA分子中。
其中，F1代小鼠southern印记的5’探针引物如下：
5’Probe forward primer:
5’-GGCTTGCATCTAATCCTCGTCCTCT-3’
5’Probe reverse primer:
5’-GTTTGTGTTCCCTGCTTTCAACTTCC-3’
步骤c、采用限制性内切酶Bsu361(10000U/mL，0.5mL)对步骤b得到的DNA进行切割，切割示意图如图5所示，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA。
步骤d、将步骤c分离出来的DNA转到尼龙膜上。
步骤e、待探针变性后与步骤d的DNA分子进行杂交，NBT/BCIP 化学显色法显色，拍照观察，结果如图6所示，如图6可以看到17、 19、22、23号PirB基因敲除小鼠在4.13kb和3.56kb有两个片段， WT小鼠只在4.13kb处有一个切割片段。
步骤6、将F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠PirB-/-，即为本发明所述小鼠PirB基因敲除动物模型。
根据得到的小鼠PirB基因敲除动物模型，将F2代纯合子小鼠 PirB-/-与同品系小鼠组织/细胞特异性Cre表达的小鼠杂交，获得的 F3代小鼠可以实现不同组织或者细胞类型的中PirB基因的敲除。
对F3代小鼠进行基因型的鉴定：含有无(PirB-cWT)、一个 (PirB-cHET)或者两个(PirB-cKO)PirB基因被敲除的小鼠，PirB 基因在特异性组织或细胞中被敲除。其中PirB-cWT小鼠表达Cre，但不含有loxP-PirB等位基因，PirB-cHET and PirB-cKO小鼠表达Cre 并分别含有一个或者两个lox-PirB等位基因。
其中杂交小鼠纯合子/杂合子鉴定所用的PCR引物如下：
F2:5’-CAGAGGAGCCCAGTGTATATGC-3’
R3:5’-CACTCAATGTAAAACCTTCCCTTCC-3’
Homozygotes:296bp
Heterozygotes:296bp/241bp
Wildtype allele:241bp
Cre阳性PCR鉴定所需的引物如下:
Forward:5’-GAACGCACTGATTTCGACCA-3’
Reverse:5’-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC-3’
Creamplicon:204 bp。
序列表
<110> 西安医学院
<120> PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccaagtca agctatctag agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaatgaccc cctgcctgcc agg 23
Claims (7)
1.PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述小鼠动物模型是通过以下方法获得：
步骤1、基于CRISPR/Cas9技术，根据PirB基因信息确定C57BL/6J小鼠PirB基因待敲除的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO区域，采用in-fusion方法构建含有loxP位点的打靶载体；
步骤3、将有活性的gRNA1、gRNA2、Cas9蛋白和含有loxP位点线性打靶质粒载体显微注射入***小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；
步骤4、将步骤3中性成熟的阳性F0代小鼠分别与野生型异性小鼠交配繁殖一代，获得F1代杂合子小鼠；
步骤5、将步骤4获得的F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的PirB基因敲除的小鼠动物模型。
2.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述gRNA1、gRNA2的敲除位点依次为小鼠PirB基因编码区的第10个外显子上和15个外显子上。
3.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述步骤1中得到gRNA1和gRNA2后，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。
4.根据权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型，其特征在于，所述步骤3中注射进入受精卵的gRNA1、gRNA2的浓度均为2～5pmol/ul，Cas9蛋白的浓度为30～100ng/μL。
5.一种权利要求1所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、分别获取C57BL/6J小鼠PirB基因序列的第10、15号外显子的基因序列，基于CRISPR-Cas9***构建第10号外显子的gRNA1，所述gRNA1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，基于CRISPR-Cas9***构建第15号外显子的gRNA2，所述gRNA2的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤2、通过PCR扩增C57BL/6J小鼠PirB基因的同源臂和cKO区域，采用in-fusion方法构建cKO区两端含有loxP位点的打靶质粒载体，通过PCR及测序对打靶载体进行验证，并通过酶切获得线性化打靶载体质粒。
步骤3、将步骤1得到的gRNA1、gRNA2、步骤2得到的线性化的含有loxP位点打靶载体和Cas9蛋白注射进入***C57BL/6J小鼠受精卵中，繁育获得F0代小鼠；
步骤4、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体；
步骤5、将步骤4中性成熟的阳性F0代小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，PCR扩增、测序和Southern杂交，验证小鼠基因型；
步骤6、将步骤5中F1代杂合子小鼠近交获得F2代纯合子小鼠，即为本发明构建的小鼠动物模型。
6.根据权利要求5所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1中得到gRNA1和gRNA2后，将gRNA1和gRNA2分别与trancrRNA在25℃孵育10min形成发夹结构。
7.根据权利要求5所述的PirB基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤5中Southern杂交所用的限制性内切酶为Bsu36I，浓度为10000U/mL，用量0.5mL，片段大小如下：4.13kb-WT,3.56kb-MT。
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