CN109777829A - 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，属于生物基因工程，本发明以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，通过设计sgRNA中基因特异性序列，获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列，扩增U6‑sgRNA表达组件，合成U6‑sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，最后进行重叠PCR获得完整的U6‑sgRNA表达组件的双链DNA片段的步骤完成构建，整个构建方法基因编辑的成功率，不仅方便且成本低。

Description

一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，特别是指一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法。

背景技术

基因编辑是当今最热门的科研和治疗手段之一，可以对特定的基因序列进行修改编辑，目前已被广泛应用于科研中的基因功能研究、模式动物构建以及疾病的临床治疗等。基因编辑目前主要的***包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9***。由于ZFN和TALEN***需要根据基因编辑的目的序列不同进行蛋白的重新构建，耗费的时间和成本较多，而CRISPR/Cas9***仅仅需要针对目的基因的序列不同重新构建短链RNA序列即可，使用起来具有时效和成本的优势。在CRISPR/Cas9***中，Cas9核酸酶需要crRNA和tracrRNA的协助识别目的序列，对目的序列进行剪切形成双链断裂。为了方便，人们之后将crRNA和tracrRNA整合起来形成一个RNA分子—sgRNA。

当今利用CRISPR/Cas9***进行基因编辑需要两个重要组件，即sgRNA和Cas9核酸酶。在进行基因编辑时，sgRNA识别目的DNA序列，指导Cas9在特定序列进行剪切，形成双链断裂，随后依赖细胞本身的序列修复或者外源基因的同源重组实现基因编辑。基因编辑的特异性和位点选择依赖于sgRNA中特异性识别序列的不同设计，不同的sgRNA特异性识别序列的设计对应不同的靶点DNA序列，可见sgRNA，尤其是其特异性识别序列的设计和构建对基因编辑至关重要。同时，sgRNA作为一类非编码RNA，需要III型RNA聚合酶通过转录方式合成。所以，如何快速地构建含有III型RNA聚合酶启动子(比如U6启动子)的sgRNA表达组件至关重要。

目前来说，主要有两种途径可以实现构建含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件。第一种技术方案，即通过合成sgRNA全长序列并将其***含有III型RNA聚合酶启动子的载体质粒中，来获得含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的方法。此方法虽比较快捷，但由于合成的片段不含III型RNA聚合酶启动子，依赖载体上的III型RNA聚合酶启动子，因而在选择载体时需使用含有III型RNA聚合酶启动子的载体，在载体的选择上缺乏灵活性，更换载体和体系较为繁琐，且在连接进入载体质粒时，可能出现反向连接的可能，需要进一步筛选和检验，效率较低。第二种技术方案，即全基因合成含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件，此方法较为直接，但是十分昂贵，如果遇到需要针对大量不同位点构建sgRNA表达组件的情况将耗费大量财力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，用以克服现有技术中全部或者部分不足。

基于上述目的本发明提供的一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，包括如下步骤：

1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；

2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列置于sgRNA表达组件的模板中，得到U6-sgRNA组件；

3)获得U6-sgRNA表达组件的模板质粒：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6-sgRNA-X组件连入pGEM-T载体，得质粒pGEM-T/U6-sgRNA-X，且序列为SEQ ID NO.7；

4)合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；

F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTT

TAAAG-3’；

F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAG

AAAG-3’；

F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；

F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；

5)进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段。

在一些可选实施例中，所述IDH1基因的编辑目的区段为IDH1 ENSG00000138413,17230bp-17350bp。

在一些可选实施例中，所述序列设计采用CRISPR设计网站Benchlin，并选取其中“On-Target Score”较高且“Off-Target Score”较低的以“G”为起始核苷酸的序列。

在一些可选实施例中，所述sgRNA基因特异性序列为5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACT-3’。

在一些可选实施例中，所述步骤(5)包括如下步骤：

a)分别利用步骤(4)中合成的F1/F3引物以及F2/F4引物，以步骤(3)所述的pGEM-T/U6-sgRNA-X为模板进行PCR扩增；

b)对步骤(a)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为360bp的A片段和大小为159bp的B片段，并将A、B片段进行PCR扩增；

c)将步骤(b)反应体系从PCR仪中取出，向其中加入引物F1和F2，再进行PCR扩增；

d)对步骤(c)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为499bp的U6-sgRNA表达组件的DNA片段；

e)对(d)中回收的U6-sgRNA表达组件的DNA片段进行测序鉴定。

在一些可选实施例中，所述步骤(a)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，64℃30s，72℃30s循环30次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

在一些可选实施例中，所述步骤(b)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环10次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

在一些可选实施例中，所述步骤(c)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环25次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

在一些可选实施例中，所述步骤(e)中测序引物序列为5’-TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，设计出sgRNA序列，所得的sgRNA序列处于III型RNA聚合酶启动子之下，可以保证sgRNA的有效表达，保证基因编辑的成功率；并采用三次PCR反应即可高效地获得含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的DNA片段，操作方便；此设计仅需针对不同基因的特异性sgRNA序列设计合成F3和F4引物，F1、F2引物以及模板质粒都为通用，因而此方案不仅方便且成本低；引物F1和F2中含有常用的限制酶切位点，方便之后进行sgRNA的载体连接。

附图说明

图1为本发明现有技术中利用CRISPR/Cas9***进行基因编辑示意图；

图2为本发明实施例设计sgRNA中基因特异性序列过程示意图；

图3为本发明实施例进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段过程示意图；

图4为本发明实施例U6-sgRNA表达组件的DNA片段琼脂糖凝胶电泳示意图；

M-1kb plus ladder，1-PCR后A片段，2-PCR后B片段，3-胶回收后A片段，4-胶回收后B片段，5-PCR后U6-sgRNA，6-胶回收后U6-sgRNA；

图5为本发明实施例U6-sgRNA表达组件的DNA片段测序结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

为了解决现有技术中构建含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的效率较低和价格昂贵的问题，本发明实施例提供了一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，步骤如下：

一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，包括如下步骤：

1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；

2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列与U6启动子序列进行连接，得到U6-sgRNA组件；

3)扩增U6-sgRNA表达组件：将U6-sgRNA组件连入pGEM-T载体，得质粒pGEM-T/U6-sgRNA-X，且序列为SEQ ID NO.7；

4)合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；

F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’；

F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG-3’；

F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；

F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；

5)进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段。

在一些可选实施例中，本发明实施例提供的一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，具体步骤如下：

以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因阐述整个技术方案。

1.设计sgRNA中基因特异性序列：设计针对IDH1的sgRNA序列。首先，进入CRISPR设计网站Benchlin(benchling.com)，选择人类基因组中IDH1基因，并选取其中基因编辑的目的区段(IDH1ENSG00000138413,17230bp-17350bp)，使用软件默认参数进行序列设计，选取其中“On-Target Score”较高且“Off-Target Score”较低的序列。同时考虑到最终使用III型RNA聚合酶对sgRNA进行合成，选择时需选用以“G”为起始核苷酸的序列以提高表达效率。最终通过软件设计和筛选，最终选定此次IDH1基因编辑的sgRNA中基因特异性序列为5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACT-3’(如图2所示，此序列因不同基因编辑而异)。

2.获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将上述步骤设计得到的sgRNA中基因特异性序列信息放入sgRNA的模板序列(如图3所示)中，得到完整的U6启动子的sgRNA表达组件序列，我们将此序列记为“U6-sgRNA”序列。U6-sgRNA包括U6启动子序列、sgRNA中基因特异性序列、sgRNA的骨架序列、转录终止序列、sgRNA表达组件的框架序列和用于载体的连接的酶切位点序列。除sgRNA中基因特异性序列外，其他序列为固定序列，在不同基因编辑中保持不变(如图2所示)。

3.获得U6-sgRNA表达组件的模板质粒：前期我们已经设计并通过分子生物学手段获得了含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6-sgRNA组件，并将其连入pGEM-T载体，我们将此质粒记为“pGEM-T/U6-sgRNA-X”，并作为之后合成其他U6-sgRNA的模板。pGEM-T/U6-sgRNA-X的序列为SEQ IDNO.7。

4.设计合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物：如图2中所示，合成F1、F2、F3、F4四条引物，并进行PAGE纯化。其中F1和F4为正向引物，序列和图中所选区域一致；F2和F3为反向引物，序列和图中所选区域反向互补。F3和F4的重叠序列为第1步中所设计的sgRNA中基因特异性序列，因基因及靶点不同而异，此序列作为F3和F4的重叠序列，作为下一步重叠PCR的重叠部分。F1和F2引物为通用引物；F3和F4需根据基因编辑序列的不同每次合成。

其中，

F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’；

F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG-3’；

F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；

F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’。

5.进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段，整个流程如图3所示：

(a)分别利用第4步中合成的F1/F3引物以及F2/F4引物，以第3步所述的pGEM-T/U6-sgRNA-X为模板，利用Phusion PCR体系(Thermo Scientific,Catalog No.:F531S)配制如下的PCR反应体系(总体系50μL)，分别PCR扩增得到DNA片段A和B：

将上述体系利用PCR仪进行如下循环：

循环应控制在30个循环，以免引入突变。

(b)对(a)中的反应产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，进行凝胶回收，分别回收大小为360bp的A片段和大小为159bp的B片段。

利用Phusion PCR体系(Thermo Scientific,Catalog No.:F531S)配制如下的PCR反应体系(总体系20μL)进行扩增：

将上述体系利用PCR仪进行如下循环：

(c)将上述反应体系从PCR仪中取出，向其中加入引物F1(10μM)和F2(10μM)各1μL，放回PCR仪中，进行如下所述循环：

(d)对(c)中的反应产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，进行凝胶回收，回收大小为499bp的片段,即为U6-sgRNA表达组件的DNA片段，结果见图4；

(e)对(d)中回收的U6-sgRNA表达组件的DNA片段进行测序鉴定，测序引物序列为5’-TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’，确保sgRNA中基因特异性序列(即图2中F3和F4的重叠序列)的正确性，此序列决定基因编辑的靶点位置(测序结果见图5)。

步骤(e)中测序正确的U6-sgRNA表达组件可以直接转染细胞，也可以利用图2中两端的酶切位点序列接入载体进而转染细胞，进行基因编辑。

本发明实施例中设计所得的sgRNA序列处于III型RNA聚合酶启动子之下，可以保证sgRNA的有效表达，提高基因编辑的成功率。同时进行三次PCR反应即可高效地获得含有III型RNA聚合酶启动子的sgRNA表达组件的DNA片段，操作方便。设计仅需针对不同基因的特异性sgRNA特异性序列设计合成F3和F4引物，F1、F2引物以及模板质粒都为通用，因而此方案不仅方便且成本低。引物F1和F2中含有常用的限制酶切位点，方便之后进行sgRNA的载体连接。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法

<130> 2018.12.26

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 正向引物（F1)

<400> 1

ggggctcgag gaattcacgc gttgtacaaa aaagcaggct ttaaag 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 反向引物（F2)

<400> 2

aagcggccgc aagcttacgc gttaatgcca actttgtaca agaaag 46

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 反向引物(F3)

<400> 3

agttttagca ctggcacacc ggtgtttcgt cctttccaca 40

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物(F4)

<400> 4

ggtgtgccag tgctaaaact gttttagagc tagaaatagc aag 43

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA中基因特异性序列(DNA）

<400> 5

ggtgtgccag tgctaaaact 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 测序引物序列（DNA）

<400> 6

tgtacaaaaa agcaggcttt aaag 24

<210> 7

<211> 3472

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

ttgtacaaaa aagcaggctt taaaggaacc aattcagtcg actggatccg gtaccaaggt 120

cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 180

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 240

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 300

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 360

gtggaaagga cgaaacaccg gaccttatgg tggtcctgtg ttttagagct agaaatagca 420

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 480

ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcattaaatc actagtgaat tcgcggccgc 540

ctgcaggtcg accatatggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta 600

tagtgtcacc taaatagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 660

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 720

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 780

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 840

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 900

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 960

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 1020

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 1080

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1140

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1200

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1260

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1320

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1380

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1440

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 1500

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1560

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1620

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1680

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1740

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1800

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1860

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1920

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1980

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 2040

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 2100

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2160

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2220

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2280

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2340

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2400

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2460

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2520

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2580

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2640

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2700

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2760

acatttcccc gaaaagtgcc acctgatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 2820

aaaataccgc atcaggaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt 2880

tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca 2940

aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta 3000

aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta 3060

cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg 3120

aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga 3180

aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg 3240

ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtccattcgc 3300

cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 3360

agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 3420

agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta ta 3472

Claims (9)

1.一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)设计sgRNA中基因特异性序列：以人基因组的IDH1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因，进行序列设计，得到IDH1基因编辑的sgRNA基因特异性序列；

2)获得完整的含有U6启动子的sgRNA表达组件序列：将步骤(1)得到的sgRNA基因特异性序列与含有U6启动子序列的sgRNA表达组件模板进行连接，得到U6-sgRNA组件；

3)扩增U6-sgRNA表达组件：通过分子生物学手段获得的含有针对小鼠X染色体上非编码区域的U6-sgRNA-X组件连入pGEM-T载体，得质粒pGEM-T/U6-sgRNA-X，且序列为SEQ IDNO.7；

4)合成U6-sgRNA表达组件的PCR引物，并进行PAGE纯化，其中，所述引物序列如下，F1和F4为正向引物，F2和F3为反向引物；

F1：5’-GGGGCTCGAGGAATTCACGCGTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’；

F2：5’-AAGCGGCCGCAAGCTTACGCGTTAATGCCAACTTTGTACAAGAAAG-3’；

F3：5’-AGTTTTAGCACTGGCACACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3’；

F4：5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’；

5)进行重叠PCR获得完整的U6-sgRNA表达组件的双链DNA片段。

2.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述IDH1基因的编辑目的区段为IDH1 ENSG00000138413,17230bp-17350bp。

3.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述序列设计采用CRISPR设计网站Benchlin，并选取其中“On-Target Score”较高且“Off-Target Score”较低的以“G”为起始核苷酸的序列。

4.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述sgRNA基因特异性序列为5’-GGTGTGCCAGTGCTAAAACT-3’。

5.根据权利要求1所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)包括如下步骤：

a)分别利用步骤(4)中合成的F1/F3引物以及F2/F4引物，以步骤(3)所述的pGEM-T/U6-sgRNA-X为模板进行PCR扩增；

b)对步骤(a)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为360bp的A片段和大小为159bp的B片段，并将A、B片段进行PCR扩增；

c)将步骤(b)反应体系从PCR仪中取出，向其中加入引物F1和F2，再进行PCR扩增；

d)对步骤(c)中的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并分别进行凝胶回收大小为499bp的U6-sgRNA表达组件的DNA片段；

e)对(d)中回收的U6-sgRNA表达组件的DNA片段进行测序鉴定。

6.根据权利要求5所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述步骤(a)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，64℃30s，72℃30s循环30次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

7.根据权利要求5所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述步骤(b)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环10次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

8.根据权利要求5所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述步骤(c)的PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃10s，63℃30s，72℃30s循环25次；72℃充分延伸10min；4℃保持。

9.根据权利要求5所述的基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法，其特征在于，所述步骤(e)中测序引物序列为5’-TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG-3’。