CN114539401B

CN114539401B - 一种磁微粒标记方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN114539401B
Application number: CN202210440696.4A
Authority: CN
Inventors: 柳静; 詹先发
Original assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114539401A

Abstract

本发明涉及一种磁微粒标记方法及检测试剂盒。本发明提供了一种针对血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，所述抗体与SAA的结合能力强，特异性好，以所述抗体制备磁微粒的SAA免疫层析试纸条具有较好的检测下限以及检测的特异性，可以用于特异性的SAA的检测，具有很好的市场应用前景。

Description

一种磁微粒标记方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及了一种磁微粒标记方法及检测试剂盒。

背景技术

血清淀粉样蛋白 A（ serum amyloid A protein， SAA）是一种正向急性时相反应蛋白，是载脂蛋白家族中的一种异质类蛋白质，相对分子量约为12 000。SAA是一种急性相蛋白并与血浆高密度脂蛋白(HDL)结合。

SAA是个灵敏的参数，它在炎性反应大约8h后开始升高，且超过参考范围上限时间早于CRP，然而CRP在正常人中的中位数值与参考范围上限的差距，大约有10倍。在SAA中仅有5倍。轻微感染，例如，许多病毒感染，SAA升高要比CRP更为常见。在感染性疾病中，SAA的绝对上升要高于CRP，因此SAA测定，尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常约2/3感冒患者SAA升高，但少于1/2的患者相同表现CRP升高。在病毒感染病例中，SAA和CRP浓度升高见于腺病毒感染者。SAA和CRP的反应形式在急性感染的恢复阶段是平行的，这同时适用于细菌和病毒感染。红斑狼疮和溃疡性结肠炎SAA并不升高。恶性肿瘤转移阶段SAA升高通常比肿瘤局限于器官阶段显示较高的数值。对于移植排异，SAA检测是一个相当灵敏的指标。在对一项肾移植受者的研究中，97%的发生排异的检查是依据SAA的升高。在不可逆转的移植排异检测中，其平均浓度达690±29mg/L，而可逆排异发作病例的相关水平为271±31mg/L。类风湿性关节炎、结核病或麻风病患者SAA浓度的慢性升高，是合成AA-淀粉纤维的先决条件，这也被用来诊断继发性淀粉样变性病变。SAA 对于移植排斥反应、 2型糖尿病、慢性呼吸***疾病等疾病也有一定的辅助诊断作用。

SAA的常见检测方法包括胶体金法、酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）、胶乳增强免疫比浊法。其中胶乳增强免疫比浊法最先进，灵敏度更高，线性范围更广，操作也相对简便，在临床中被广泛采用。研究表明，胶乳增强免疫比浊法的分析灵敏度为3.52mg/L；批内变异系数<8%、日间<10%；抗干扰性较强，血红蛋白≤4.0g/L、胆红素≤400μmol/L、类风湿因子≤1621U/L、甘油三酯≤10mmol/L对测定无影响。胶乳增强免疫比浊法利用吸附在直径几十到几百纳米的胶乳微粒上的SAA抗体捕捉测试样品中的SAA，从而形成微粒之间的交联，改变了溶液的散射度或者透射吸光度（即浊度）。

随着科学技术特别是分子生物学的发展，抗体制备技术获得了革命性的进展，促进了免疫磁性微粒的出现。包被有单克隆抗体的磁性微粒，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物。通过磁场时，这种复合物可被滞留，与其它组分相分离，该过程称为免疫磁性分离法。它以免疫学为基础，渗透到生理、病理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域，是近年来国内外研究比较热的一种新的免疫学技术。免疫磁性分离简便易行，分离纯度高，保留靶物质活性，且高效、快速、低毒，广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析和基因工程、作靶向释药的载体等领域。

以磁性粒子标记的磁性免疫分析技术(Magnetic Immuno Chromatofraphic Tes,tMICT)是现代物理学与生物技术结合研发生产的磁性分析检测技术，最早应用于基础医学领域。与其它标记技术不同，该技术一个显著的优点就是用磁性粒子标记不受有色杂质干扰，可用于直接测量血液、食品、污水等有色样品。其原理是利用超顺磁性纳米微粒作为标记物，由高灵敏度磁性检测仪器测定结合在免疫复合物上的磁性微粒所产生的局部磁场效应，从而得出所测分析物的定量结果。。正是基于磁微粒包括磁微球的诸多好处，开发磁微粒标记的SAA单克隆抗体用于SAA的检测变得迫在眉睫，特别是高亲和力的SAA单抗的开发更是重中之重。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种改进的针对SAA的单克隆抗体及其应用。

一方面，本发明提供一种针对SAA的单克隆抗体2A4单克隆抗体其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示：EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSCQDCCWIKQRPGQGLEWIGREKTKSEVKCKAFWEFGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGRMKRRGSWGLGTTLAVSS，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示：

DIVITQRPALMAASPGEKVTITCREYFIAAHFGEFWYQQKSGISPKPWIYFCEWTEPGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCMAKQQHTGTFGAGTKLELK。

本发明另外一方面，提供了本发明优选利用腹水制备的方法制备所述单克隆抗体，本发明对所述腹水制备的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述单克隆抗体与SAA发生特异性反应，表明单克隆抗体具有良好的特异性；可用作本发明SAA检测试纸条的抗体。

在一些实施例中，抗体或其片段（如本文提供的抗SAA抗体）特异性结合靶（SAA)，结合常数至少为10⁻⁹M或更大的结合常数。在一些实施例中，抗体（例如，单克隆抗体）或其片段，具有10nM或更小的平衡常数（Kd），例如9nM或更小， 8.1nM或更小， 8nM或更小，7nM或更小， 6nM或更小， 6.5nM或更小，6.3nM或更小，5nM或更小，4.3nM或更小，4nM或更小，3nM或更小，2nM或更小，5nM或更小，5nM或更小，4nM或更小，3nM或更小或1.2nM或更小。例如，抗体或其片段以至少约0.1×106的结合亲和力与靶例如GPC1结合⁻⁸M，至少约0.3×10⁻⁸M，至少约0.5×10⁻⁸M，至少约0.75×10⁻⁸M，至少约0×10⁻⁸M，至少约3×10⁻⁸M至少约5×10⁻ ⁸M，或至少约2.0×10⁻⁸M，至少约2.5×10⁻⁸，至少约3.0×10⁻⁸，至少约3.5×10⁻⁸，至少约4.0×10⁻⁸，至少约4.5×10⁻⁸，至少约5.0×10⁻⁸M，至少约1×10⁻⁹M，至少约3×10⁻⁹M，至少约5×10⁻⁹M，至少约2×10⁻⁹M，至少约3×10⁻⁹M，至少约4×10⁻⁹M，至少约4.3×10⁻⁹M，至少约5×10⁻ ⁹M，至少约6×10⁻⁹M，至少约6.3×10⁻⁹M，至少约6.9×10^0.9M，至少约7×10⁻⁹M，至少约8×10⁻ ⁹M，至少约8.1×10⁻⁹M，或至少约10×10⁻⁹M. 在某些实施例中，与靶结合的特异性结合剂的解离常数（Kd）为<100nM， <10nM，<9nM，<8nM，<7nM，<6.9nM，<6.5nM，<6.3nM，<5nM，<4nM，<4.5nM，<3nM，<2nM，<1.5nM，<1nM，<0.1nM，<0.01nM或<0.001nM（例如，<10nM，<9nM，<8nM，<7nM，<6.9nM，<6.5nM，<6.3nM，<5nM，<4nM，<4.5nM，<3nM，<2nM，<1.5nM，<1nM，<0.1nM，<0.01nM或<0.001nM)。10⁻⁸M或更小，例如10⁻⁸M至10⁻¹³M，例如10⁻⁹M至10⁻¹³在一个实施方案中，通过用感兴趣抗体的Fab版本及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。

在一些实施例中，该单克隆抗体的VH结构域的氨基酸序列至少为80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，与SEQ ID NO:1 98%或99%以上相同；和/或单克隆抗体的VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%相同。在特定的非限制性实施例中，单克隆抗体的VH结构域的序列包括SEQ ID NO:1组成，和/或单克隆抗体的VL结构域的序列包括SEQ ID NO:2组成。

进一步的，抗体可与可检测标记物缀合；例如，一种可通过ELISA检测的可检测标记物，分光光度法，流式细胞术，显微镜或诊断成像技术（例如计算机断层摄影(CT)，计算机轴向断层摄影(CAT)扫描，磁共振成像(MRI)，核磁共振成像(NMRI)，磁共振断层摄影(MTR)，超声，纤维光学检查和腹腔镜检查）。可检测标记物的具体，非限制性例子包括荧光团，化学发光剂，酶键，放射性同位素和重金属或化合物（例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体）。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5-二甲基胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧系磷光体等。生物发光标记也是有用的，例如荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可与可用于检测的酶缀合，例如辣根过氧化物酶，-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶偶联时，可通过加入酶用于产生可被识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致有色反应产物，该有色反应产物在视觉上是可检测的。抗体或抗原结合片段也可与生物素缀合，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应当注意，亲和素本身可以与酶或荧光标记缀合。

进一步的，本发明提供了所述的SAA单克隆抗体在制备检测SAA的试纸条中的用途。

本发明还提供了一种快速检测SAA的试纸条，所述试纸条包括检测线和质控线；

所述检测线的制备方法包括在硝酸纤维膜上喷涂上述单克隆抗体；

所述质控线的制备方法包括在硝酸纤维膜上喷涂羊抗鼠IgG抗体。

本发明对所述试纸条的结构并没有特殊限定，优选包括本领域的常规试纸条结构。

本发明还提供了一种快速检测SAA的磁微粒检测试纸，所述磁微粒检测试纸包括自左到右，依次粘贴在背板上的：样品垫、磁微粒垫、硝酸纤维膜和吸水纸。

有益效果

本发明提供了一种针对血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，所述抗体与SAA的结合能力强，特异性好，以所述抗体制备磁微粒的SAA免疫层析试纸条具有较好的检测下限以及检测的特异性，可以用于特异性的SAA的检测，具有很好的市场应用前景。

附图说明

图1 偶联前后磁微粒表面电荷情况结果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1 单克隆抗体的制备

实验动物BALB/C（SPF）雌鼠10只，6-8周龄，体重18-22g。血清淀粉样蛋白A（货号SX01146，上海嵘崴达实业有限公司）作为免疫抗原。抗原80μg/每只小鼠首次免疫用。40μg/每只小鼠作为加强免疫使用。抗原乳化：配制0.01M pH7.2PBS缓冲液，要求无菌；若乳化前，管底有颗粒状沉淀，应超声粉碎后再进行乳化操作，用两支5ml注射器分别吸取等量的含抗原的PBS缓冲液及弗氏佐剂。通过一次性转换器连接注射器，反复推拉30-60min。乳化完全标准为滴入水中不再散开，即乳化成功。免疫部位：制备抗体过程中可采用同一部位多次注射，也可以采用多部位联合方法进行免疫，但首次免疫建议皮下注射，加强免疫可采用腹腔注射。首次免疫：每只小鼠注射总量为0.4ml（80μg抗原/只）。加强免疫：每只小鼠注射总量为0.2ml（40μg抗原/只），在小鼠首次免疫后，大概在10到15天左右，体内的抗体会达到一个峰值，之后的加强免疫可以选择在首次免疫的2周内进行。ELISA检测小鼠血清效价：将小鼠尾部放入37-40℃水中预热5min左右，减去1cm左右尾尖部分，用手顺着小鼠尾部挤压血液至EP管中。将血液室温放置1h，再4℃过夜。次日，ELISA检测小鼠血清效价，其中有7只小鼠血清通过间接法ELISA结果显示多克隆抗体的效价已经超过了1:10000。选择效果最好的3只小鼠，融合实验前3天再次免疫小鼠，剂量为100μg/只。间接ELISA选出效价合格的小鼠。

选用NS-1作为杂交骨髓瘤细胞，在融合操作之前要处于对数生长期的状态才能满足适合融合的条件。融合当天，收集NS-1细胞，1000rpm，5min离心，弃上清。加入单纯培养基洗涤一次，上述条件下离心，弃上清，重悬于一定量单纯培养基中，备融合操作用。

小鼠处死，75%酒精中消毒。剪开腹部皮肤及腹膜，取出脾脏。在10ml1640单纯培养基的培养皿中，洗涤***和脂肪。注射器内芯轻轻挤压脾脏，吹打成单细胞悬液。用铜网过滤，1000rpm，离心5min。单纯培养基洗涤1-2次，用10ml1640单纯培养基重悬。

小鼠NS-1细胞：脾细胞=1:5，按照这个比例轻轻混匀，1000rpm，离心5min。弃去管中全部上清液（保证PEG4000的浓度），并置于37℃水浴锅中，于37℃水浴锅中，先将1ml50%PEG4000加入到50ml离1心管中，缓慢搅动1分钟。1min内加入1ml371640℃培养基。2min内加入10ml1640培养基，800rpm，离心5min，弃去上清液。细胞重悬于HAT培养基，细胞铺96孔培养板，加入饲养细胞，CO₂培养箱中培养。饲养细胞的制备方法为：小鼠处死及消毒，剪开腹部皮肤，暴露腹膜。用手术镊提起小鼠腹膜，剪开一个小口，吸取一定量1640单纯培养基，在小鼠腹腔内吸取几次，放入离心管中离心，计数。96孔培养板每孔需要2x10⁴个饲养细胞，置于37℃培养箱中培养。

融合后5天，换半液HAT培养基。8天HT全部替换HAT培养基。此后用1640完全培养基培养。当杂交瘤细胞长至皿底1/8以上时，用间接ELISA法检测细胞上清效价，确定阳性孔。将效价合格的杂交瘤细胞制成细胞悬液，细胞计数后按一定比例稀释至每毫升含10个杂交瘤细胞，铺96孔培养板，37℃、CO₂培养箱培养；选出单个杂交瘤细胞培养孔并标记。ELISA检测细胞上清抗体效价，获得了阳性孔，经过2次亚克隆筛选，最终筛选得到7株能够稳定表达单抗的杂交瘤细胞株，选择其中阳性效果最好的2A4和3C5用于生产腹水。

SPF级BALB/C小鼠各3只，首先在小鼠腹部接种弗氏不完全佐剂，每只0.3ml。10天后，收集将对数生长期杂交瘤细胞2A4以及3C5分别制成浓度为10⁶个/ml细胞悬液。分别腹腔注射杂交瘤细胞，0.3ml/只。观察腹水生长情况。如腹部膨大，可抽取小鼠腹水，每个杂交瘤对应的腹水混合后腹水直接采用ELISA进行检测，结果如表1所示。

表1 ELISA检测结果

稀释倍数	2A4腹水	3C5腹水
			1:2000	1.532	1.418
1:5000	0.923	0.902
			1:10000	0.574	0.539
1:20000	0.264	0.233
			1:40000	0.132	0.109

从表1的结果可以看出，每个杂交瘤对应的腹水效果均达到了1:20000，具有较好的效果。将剩余腹水2000rpm，离心5min。取上清，纯化后即为2A4和3C5单克隆抗体，分别分装-80℃保存。

实施例2 2A4单克隆抗体的性能鉴定

采用AffinitySensors公司生产的生物传感器IAsysPlus对单克隆抗体的亲和常数进行测定。羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran,CMD)预处理样品池，在样品池中加入不同浓度的SAA蛋白,5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。将包被好SAA的样品池放入生物传感器,平衡10min。基线(baseline):加入pH7.2,0.01mol/L PBS 50μl,等待5min,作一平稳基线。结合(asso-ciation):吸去PBS,加入45μl PBS和5μl单抗,待单抗结合至饱和时吸去单抗液。解离(dissociation):换50μlPBS,待单抗结合与解离达到平衡。再生(regeneration):换20mmol/LHCl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。回复基线:换PBS,再次回到基线,即可开始下1个循环。将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度,依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率,并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表2所示。

表2 抗体的亲和常数

抗体名称	亲和常数（nM）
		2A4单克隆抗体	0.89±0.02

从表2的结果可以看出，2A4单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好。

用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类。ELISA板包被抗原，50ul/孔，置4℃过夜。弃上清，加封闭液200ul/孔，置于37℃孵育1小时。洗涤液洗3次，将2A4单抗分别加到9个不同孔中，50ul/孔，设复孔。将阳性对照加到第10孔中，置37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。将正常兔血清加到第1个孔中，兔抗小鼠免疫球蛋白类或亚类的特异性抗体分别加到2-9孔中，阳性对照孔加入兔抗小鼠IgGl抗体，50ul/孔，37℃孵育1小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入HRP-羊抗兔lgG抗体，50ul/孔，37℃孵育l小时。移去液体，洗涤液洗3次。加入TMB显色液，50ul/孔。室温显色5min，加入100ul终止液终止反应，于450nm处测OD值，记录并判定结果。结果显示，2A4单克隆抗体是IgM亚型，轻链是κ链。

采用试剂盒提取杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示：EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSCQDCCWIKQRPGQGLEWIGREKTKSEVKCKAFWEFGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGRMKRRGSWGLGTTLAVSS，轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示：

实施例3 2A4单克隆抗体的特异性鉴定

特异性鉴定采用Western blot法：将SAA、BSA、AFP、β球蛋白进行SDS-PAGE, 再将凝胶蛋白带电转移至硝酸纤维素膜上，依次与2A4及HRP-羊抗鼠IgG反应后以DAB显色，进行交叉反应性检测，采用间接ELISA。

Western blot鉴定结果表明，2A4单克隆抗体可识别Mr为大约12KD的SAA条带，说明是与目的SAA蛋白进行的结合；而与BSA、AFP、β球蛋白等均无交叉反应。通过间接ELISA法测定了2A4单克隆抗体与其他蛋白无结合反应，具有较好的特异性。

实施例4 磁微粒的SAA免疫层析试纸条的制备

一、SAA顺磁微粒的制备：

磁微粒购买自西安瑞禧生物科技有限公司，货号： 82023，直径150nm。

1)吸取200μL(2mg)磁微粒，用500μL 10mmol/L MES缓冲液，pH5.5，含0.05%Tween-20的洗涤缓冲液漂洗3次，分别加入新鲜配制的浓度为5mg/mL的EDC和NHS，37℃旋转活化反应4h;活化后，用MES缓冲液洗涤两次除去未反应的活化剂。

2)用0.005M pH9.0的BS偶联缓冲液（称取0.95g四硼酸钠粉末，溶解于50ｍＬ纯水中后，取8mL与2mL的0.05M硼酸缓冲液混合，用0.1Ｍ NaOH调pH至9.0,随后稀释40倍，用0.1M NaOH条pH至9.0）洗涤活化好的磁微粒两次，用500μL偶联缓冲液洗涤磁微粒两遍；加入475μL偶联缓冲液重悬洗涂后的磁微粒，再加入25μL共150μg 2A4单克隆抗体，使得磁微粒表面活化的羟基与抗体的氨基接触并在37℃反应3小时，将抗体偶联于磁微粒表面，得到免疫磁微粒。

3)磁分离吸附磁微粒移除上清后，加入1mL含封闭剂的偶联缓冲液（0.25g 脱脂奶粉加入10mL 0.005M BS偶联缓冲液），37℃封闭过夜;4)封闭好的磁微粒用偶联缓冲液洗涤4次后，保存于500μL合适的保存缓冲液中（取0.1g BSA及5mg吐温-20加入10mL 0.005M BS偶联缓冲液中，并加入0.01%NaN₃，置于4℃冰箱保存备用。通过BCA蛋白定量检测试剂盒分析偶联后的磁微粒抗体含量，结果显示每毫克磁微粒表面偶联抗体的量为38μg，具有较好的偶联量。

ZETA电位的测定有时被认为是一种＂电荷＂测定，用于评价分散体系的静电力稳定效果。25℃条件下，使用高性能纳米粒度分析仪对磁微粒原液及偶联后免疫磁微粒ZETA电位进行测量。结果如图1所示。

图1是偶联前后磁微粒表面电荷情况。磁微粒表面的羧基基团使得其带有负电荷（-7.92±0.91）mV，偶联抗体后，羧基与抗体的氨基结合，羧基数量减少，所免疫磁微粒表面电荷量下降（-2.71±0.51）mV。由于表面电荷量的减少不利于磁微粒的稳定性，所为了提高磁微粒表面负电荷的总量，把免疫磁微粒保存液的pH定为9.0，提高免疫磁微粒的稳定性。

二、试纸条的制备

1）样品垫预处理：将裁剪成合适大小的玻璃纤维素膜完全浸泡于样品垫处理液(pH7.4 的0.01mol/L PBS，0.5% BSA，0.5% TritonX-100) 中处理 4h 后室温自然干燥。

2）磁微粒结合垫的制备：取适量制备好的单抗标记的磁微粒用移液枪吸取适量磁微粒点于结合垫上，室温通风干燥 5h。

3）NC膜的制备：将稀释成1mg/mL浓度的市售SAA单抗（上海钰博生物科技有限公司，货号MAA885Hu22）和市售羊抗鼠二抗用点膜机以 1μL/cm 的量分别喷于 NC 膜的相应位置上，作为检测 T 线和质控C 线。

4）免疫层析试纸条的组装：将制备好的样品垫、结合垫、NC 膜和吸水垫按顺序依次粘贴于PVC 背板上，相邻垫子部分互相重叠，组装好后用试纸条斩切机切割成 3mm 宽的试纸条，装入含有干燥剂的密封袋中 4℃ 保存。

试纸条的检测灵敏度实验：

检测灵敏度确定：将SAA标准抗原稀释于人正常血清中，浓度范围0-1000ng/mL。用构建的试纸条分别检测0、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的血清样品，15分钟后用磁强度检测仪（MAR）分析T/C与样品浓度之间的关系。由于试纸条定量检测的灵敏度为偏离试纸条背景信号的最低浓度，即用空白样品的T/C平均值加上3倍标准差计算出的检测SAA的定量检测灵敏度为0.18ng/mL。

特异性鉴定：将配制好的SAA、CEA、BSA、AFP、HCG标准溶液滴加到试纸条上，15分钟后观察检测结果，结果显示仅含有SAA的标准溶液显示阳性结果，余均为阴性，如表3所示，表明该检测体系具有较高的特异性。

表3 试纸条交叉反应性

检测抗原	检测结果
		SAA	+
CEA	-
		BSA	-
AFP	-
		HCG	-

+表示阳性，-表示阴性。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和***的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

序列表

<110> 北京科跃中楷生物技术有限公司

<120> 一种磁微粒标记方法及检测试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Cys Gln

20 25 30

Asp Cys Cys Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Glu Lys Thr Lys Ser Glu Val Lys Cys Lys Ala Phe Trp Glu

50 55 60

Phe Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Arg Met Lys Arg Arg Gly Ser Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Ala Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Glu Tyr Phe Ile Ala Ala His Phe

20 25 30

Gly Glu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Phe Cys Glu Trp Thr Glu Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Ala Lys Gln Gln His Thr

85 90 95

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

Claims

1.一种针对SAA的单克隆抗体2A4，其特征在于其重链可变区序列如SEQ ID NO：1所示；轻链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体2A4在制备磁微粒标记的SAA检测试剂盒中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述试剂盒中含有磁微粒标记的试纸条。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述试纸条包括检测线和质控线。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述磁微粒检测试纸包括依次粘贴在背板上的样品垫、磁微粒垫、硝酸纤维膜和吸水纸。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于免疫层析试纸条的组装步骤为：将制备好的样品垫、结合垫、NC 膜和吸水垫按顺序依次粘贴于PVC 背板上，相邻垫子部分互相重叠，组装好后用试纸条斩切机切割成 3mm 宽的试纸条，装入含有干燥剂的密封袋中 4℃ 保存。